西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610250520.7	申请日：	20160420
公开号：	CN105906494A	公开日：	20160831
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C07C47/46,C07C45/78,A61K31/4422,A61P9/00,A61P9/10,A61K31/11	主分类号：	C07C47/46,C07C45/78,A61K31/4422,A61P9/00,A61P9/10,A61K31/11
申请人：	宋晓梅
发明人：	宋晓梅
地址：	311816 浙江省绍兴市诸暨市陶朱街道宋家村后宋80号
优先权：	CN201610250520A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明公开了西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途，本发明提供的西尼地平的药物组合物中含有西尼地平和一种从黄芩的干燥根中分离得到的结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，西尼地平和该天然产物单独作用时，可以降低心肌缺血再灌注损伤；二者联合作用时，对心肌缺血再灌注损伤的保护作用更优，可以开发成保护心肌缺血再灌注损伤的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。

权利要求书

1.一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)， 2.一种西尼地平的药物组合物，其特征在于：包括西尼地平、如权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。 3.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(a)将黄芩的干燥根粉碎，用60～70％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱12个柱体积，再用70％乙醇洗脱15个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为55:1、25:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集7～13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。 4.根据权利要求3所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中用65％乙醇热回流提取，合并提取液。 5.根据权利要求3所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。 6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备心肌保护的药物中的应用。 7.权利要求2所述的西尼地平的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及西尼地平的新用途，具体涉及西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途。

背景技术

西尼地平即1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸2-甲氧基乙酯肉桂醇酯。

西尼地平为亲脂性的二氢吡啶类钙拮抗剂，能与血管平滑肌细胞膜上L型钙通道的二氢吡啶位点结合，抑制Ca2+通过L型钙通道的跨膜内流，从而松弛、扩张血管平滑肌，起到降压作用。它还可通过抑制Ca2+通过交感神经细胞膜上N型钙通道的跨膜内流而抑制交感神经末梢去甲肾上腺素的释放和交感神经活动。

迄今为止，尚未见西尼地平及其药物组合物与心肌缺血再灌注损伤的相关性报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种西尼地平的药物组合物，该药物组合物中含有西尼地平和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，西尼地平和该天然产物可以协同保护心肌。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

一种西尼地平的药物组合物，包括西尼地平、如上所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。

如上所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将黄芩的干燥根粉碎，用60～70％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱12个柱体积，再用70％乙醇洗脱15个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为55:1、25:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集7～13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中用65％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

如上所述的化合物(Ⅰ)在制备心肌保护的药物中的应用。

如上所述的西尼地平的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。

本发明的优点：

本发明提供的西尼地平的药物组合物中含有西尼地平和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，西尼地平和该天然产物单独作用时，可以降低心肌缺血再灌注损伤；二者联合作用时，对心肌缺血再灌注损伤的防治作用更优，可以开发成防治心肌缺血再灌注损伤的药物。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

分离方法：(a)将黄芩的干燥根(2kg)粉碎，用65％乙醇热回流提取(20L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱12个柱体积，再用70％乙醇洗脱15个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为55:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集7～13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(345mg，HPLC归一化纯度大于98％)。

结构确证：淡黄色粉末，HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z 253.1761，结合核磁特征可得分子式为C15H24O3，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-3(2.54，m)，H-4a(1.82，m)，H-4b(1.62，m)，H-5a(1.77，m)，H-5b(1.69，m)，H-6(2.07，m)，H-7(2.66，br，d，J＝8.7Hz)，H-8(3.54，d，J＝9.2Hz)，H-10a(2.37，d，J＝15.4Hz)，H-10b(1.90，d，J＝15.4Hz)，H-11(9.87，s)，H-12a(3.93，dd，J＝9.2，4.5Hz)，H-12b(3.58，dd，J＝9.2，2.7Hz)，H-13(0.88，d，J＝7.4Hz)，H-14(0.86，s)，H-15(1.05，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：171.2(C，1-C)，128.3(C，2-C)51.2(CH，3-C)，24.5(CH2，4-C)，32.1(CH2，5-C)，29.3(CH，6-C)，53.5(CH，7-C)，83.1(CH，8-C)，39.6(C，9-C)，43.7(CH2，10-C)，194.3(CH，11-C)，51.4(CH2，12-C)，12.5(CH3，13-C)，19.5(CH3，14-C)，25.8(CH3，15-C)。红外波谱表明该化合物含有羟基(3340cm-1)，羰基(1735cm-1)。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有15个碳信号，包括三个甲基，四个亚甲基(一个连氧碳)，五个次甲基(一个醛基碳和一个连氧碳)，以及三个季碳(两个烯烃碳)，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为双环结构。1H-NMR谱结合HSQC谱显示三个甲基质子信号δH 0.88(3H，d，J＝7.4Hz)、0.86(3H，s)、1.05(3H，s)，三组亚甲基质子信号δH 1.82(1H，m)与1.62(1H，m)、1.77(1H，m)与1.69(1H，m)、2.37(1H，d，J＝15.4Hz)与1.90(1H，d，J＝15.4Hz)，一组羟甲基质子信号δH 3.93(1H，dd，J＝9.2，4.5Hz)与3.58(1H，dd，J＝9.2，2.7Hz)，三个次甲基质子信号δH2.54(1H，m)，2.07(1H，m)与2.66(1H，br，d，J＝8.7Hz)，一个连氧次甲基质子信号δH 3.54(1H，d，J＝9.2Hz)，一个醛基质子信号δH 9.87(1H，s)。1H-1H COSY谱中存在H-3/H2-12、H-3/H2-4/H2-5/H-6/H-7/H-8相关信号，同时HMBC谱中显示有H2-4与C-2和C-3，H2-5与C-3，H-6与C-8，H-7与C-1，H2-10与C-1、C-2、C-7、C-8和C-14，H-11与C-1、C-2和C-3，H2-12与C-2，H3-13与C-5和C-7，H3-14与C-8、C-9和C-10，H3-15与C-9和C-10相关信号，通过上述NMR谱中的相关信息可以构建该化合物的连接方式，并且上述波谱数据表明该化合物为tremulane型倍半萜。HMBC谱中H3-14与C-8和C-9的相关性表明C-8位连有一个羟基。在tremulane型倍半萜中，H-6与H-7位为β构型，H3-14构型通常处是β位，H3-15构型为α位。在该化合物的NOE试验中体现的H-6与H-7以及H-7与H3-14相关信号符合tremulane型倍半萜的构型关系。同时，NOESY谱中H2-12与H-7以及H3-15与H-8的相关性表明羟甲基为β构型，H-8为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。

化学结构式及碳原子编号如下：

实施例2：对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的保护作用

1、材料与方法

1.1动物

SD大鼠70只，体重180～200g，雌雄各半，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。清洁级动物房饲养，定时给予全价营养饲料喂食，室温22～25℃，湿度50％～70％。

1.2试剂与样品

西尼地平购自上海极威生物科技有限公司。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。丹红注射液(原儿茶醛0.05g·L-1，约相当于生药1g·mL-1)，由山东济南步长制药有限公司生产。肌钙蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)试剂盒由美国Rapid Bio Lab公司生产，北京莱博特利生物医学科技公司提供；肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供；硝基四氮唑蓝(NBT)，上海前进试剂厂生产。血栓素(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)放射免疫试剂盒，由北京普尔伟业生物技术有限公司提供；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，由美国CHRO-NOLOG公司生产，北京现代威士达医疗器械有限公司提供，浓度0.2mmol·L-1。

1.3仪器

SC-3人工呼吸机(上海医疗设备厂)；ECG-6511心电图机(上海光电仪器有限公司)；RX-2000全自动生化仪(美国Technicon公司)；LBY-NJ2血小板聚集仪(北京普利生公司)；SN-682放射免疫γ计数仪(上海核辐射仪器有限公司)。

1.4大鼠分组及模型制备

20％氨基甲基乙酯(乌拉坦)腹腔注射麻醉(0.7mL·kg-1)，大鼠固定在专用木板上，气管插管，人工呼吸(潮气量为20mL·kg-1，呼吸频率为50次/min)吸入室内空气，开胸，剪开心包膜，轻轻挤压大鼠胸腔右侧壁，将心脏挤出。在左心耳下缘，肺动脉圆锥左缘与左心耳之间进针，以冠状静脉主干为标志，左心耳下方2～3mm处用丝线结扎(垫1个半圆形硅胶管)冠状动脉前降支造成大鼠心肌缺血，心电监护显示结扎冠状动脉成功(持续2min)后10min 经股静脉iv给药。假手术组只穿线不结扎，注射等剂量生理盐水；模型组结扎后，给予等剂量生理盐水。实验过程中动物处置方法符合动物伦理学要求标准。实验分组分别作空白对照(假手术)组、模型对照组、西尼地平组(80mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)组(80mg·kg-1)、西尼地平与化合物(Ⅰ)组合物组【40mg·kg-1西尼地平+40mg·kg-1化合物(Ⅰ)】及阳性药对照组。阳性药物对照组：丹红注射液(50mg·kg-1)。

1.5标本采集

大鼠造模缺血后40min，剪断丝线再灌注60min。记录结扎前、结扎后40min及剪开丝线后(再灌注)60minⅡ导心电图。观察60min后，腹主动脉取血，一部分放入3.8％枸橼酸钠溶液1:9抗凝真空管和消心痛+2％EDTANa2溶液抗凝管后离心，测定血小板聚集性和TXB2，6-keto-PGF1α含量。另一部分不抗凝放入真空管后离心测定血清cTnT，CK-MB含量。然后，取出心脏，生理盐水冲洗，称量全心重，在心脏结扎线以下，平行于冠状沟均匀地将左心室部分横断切成5片，置于NBT溶液37℃染色15min。用DeltaPix(丹麦)图像分析系统测量每片心肌面积、心室面积和梗死区面积，然后求出梗死区占心室和全心区面积的百分比。

1.6指标检测方法

放射免疫法测定TXB2，6-keto-PGFα1；全自动生化仪电化学发光法和速率法测定测定cTnT，CK-MB；比浊法测定血小板聚集率，诱导剂为ADP，浓度为0.2mmol·L-1，取其1、3、5min及最大聚集率。

1.7统计学方法

所有数据用x±s表示，组间比较为单因素方差分析，组间比较采用LSD方法，P<0.05为差异有统计学意义，采用SPSS19.0软件包进行统计学处理。

2、实验结果

2.1对大鼠MI面积和I/R损伤后CK-MB和cTnT的影响

大鼠心肌I/R损伤后，模型组血清CK-MB活性明显升高，和假手术组比较有显著差异(P<0.01)。模型组cTnT水平亦有一定升高，但与假手术组比较无显著差异，穿刺对心肌组织也是一种损伤。与模型对照组比较，西尼地平与化合物(Ⅰ)组合物组及阳性对照组均能显著降低大鼠MI面积及动物血清CK-MB水平和cTnT含量(P<0.01)；与模型对照组比较，西尼地平组、化合物(Ⅰ)组大鼠MI面积及血清CK-MB水平和cTnT含量降低(P＜0.05)。

结果见表1。

2.2对大鼠心肌I/R损伤后血小板聚集性、6-keto-PGF1α和TXB2的影响

与正常对照组比较，模型对照组小鼠血小板聚集性升高(P＜0.05)，TXB2升高(P＜0.05)，(P＜0.05)，6-keto-PGF1α降低；与模型对照组比较，西尼地平与化合物(Ⅰ)组合物组和阳性对照组血小板最大聚集率和TXB2显著降低(P＜0.01)，6-keto-PGF1α显著升高(P＜0.01)；与模型对照组比较，西尼地平组、化合物(Ⅰ)组血小板最大聚集率和TXB2降低(P＜0.05)，6-keto-PGF1α升高(P＜0.05)。结果见表2。

表1 对大鼠MI面积和I/R损伤后CK-MB和cTnT的影响

组别心肌梗死面积/％ cTnT/mg·L-1 CK-MB/U·L-1 空白对照组 / 0.97±0.17 437.17±154.82 模型对照组 29.13±3.18 1.04±0.14 1268.17±256.50 阳性对照组 24.97±5.94 0.63±0.14 386.39±107.71 西尼地平组 21.56±2.08 0.74±0.14 762.92±118.55 化合物(Ⅰ)组 21.13±2.89 0.77±0.81 758.14±160.19 西尼地平与化合物(Ⅰ)组合物组 19.85±6.74 0.62±0.18 385.32±117.05

表2 对大鼠心肌I/R损伤后血小板聚集性、6-keto-PGF1α和TXB2的影响

上述结果表明，西尼地平或化合物(Ⅰ)单独作用时，对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用；西尼地平和化合物(Ⅰ)联合作用时，对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用更为明显，可以开发成保护心肌缺血/再灌注损伤的药物。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610250520.7 (22)申请日 2016.04.20 (71)申请人宋晓梅地址 311816 浙江省绍兴市诸暨市陶朱街道宋家村后宋80号 (72)发明人宋晓梅 (51)Int.Cl. C07C 47/46(2006.01) C07C 45/78(2006.01) A61K 31/4422(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61K 31/11(2006.01) (54)发明名称西尼地平的药物组合物。

2、及其心肌保护的医药用途 (57)摘要本发明公开了西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途，本发明提供的西尼地平的药物组合物中含有西尼地平和一种从黄芩的干燥根中分离得到的结构新颖的天然产物化合物 ()，西尼地平和该天然产物单独作用时，可以降低心肌缺血再灌注损伤；二者联合作用时，对心肌缺血再灌注损伤的保护作用更优，可以开发成保护心肌缺血再灌注损伤的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。权利要求书1页说明书5页 CN 105906494 A 2016.08.31 CN 105906494 A 1.一种具有下述结构式的化合物()， 2.一种西尼地平。

3、的药物组合物，其特征在于：包括西尼地平、如权利要求1所述的化合物()和药学上可以接受的载体。 3.权利要求1所述的化合物()的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤： (a)将黄芩的干燥根粉碎，用6070乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10乙醇洗脱12个柱体积，再用70 乙醇洗脱15个柱体积，收集70洗脱液，减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中 70乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用。

4、体积比为55:1、 25:1、 15:1和1:1的二氯甲烷- 甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 20:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70的甲醇水溶液等度洗脱，收集713个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物()。 4.根据权利要求3所述的化合物()的制备方法，其特征在于：步骤(a)中用65乙醇热回流提取，合并提取液。 5.根据权利要求3所述的化合物()的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附。

5、树脂。 6.权利要求1所述的化合物()在制备心肌保护的药物中的应用。 7.权利要求2所述的西尼地平的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 105906494 A 2 西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途技术领域 0001 本发明属于生物医药领域，涉及西尼地平的新用途，具体涉及西尼地平的药物组合物及其心肌保护的医药用途。背景技术 0002 西尼地平即1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸2-甲氧基乙酯肉桂醇酯。 0003 西尼地平为亲脂性的二氢吡啶类钙拮抗剂，能与血管平滑肌细胞膜上L型钙通道的二氢吡啶位点。

6、结合，抑制Ca2+通过L型钙通道的跨膜内流，从而松弛、扩张血管平滑肌，起到降压作用。它还可通过抑制Ca2+通过交感神经细胞膜上N型钙通道的跨膜内流而抑制交感神经末梢去甲肾上腺素的释放和交感神经活动。 0004 迄今为止，尚未见西尼地平及其药物组合物与心肌缺血再灌注损伤的相关性报道。发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种西尼地平的药物组合物，该药物组合物中含有西尼地平和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，西尼地平和该天然产物可以协同保护心肌。 0006 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 0007 一种具有下述结构式的化合物()， 0008 。

7、0009 一种西尼地平的药物组合物，包括西尼地平、如上所述的化合物()和药学上可以接受的载体。 0010 如上所述的化合物()的制备方法，包含以下操作步骤： (a)将黄芩的干燥根粉碎，用6070乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用10乙醇洗脱12个柱体积，再用70乙醇洗脱15个柱体积，收集70洗脱液，减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为55:。

8、1、 25:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到 4个组分； (d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、 15:1和1:1的说明书 1/5 页 3 CN 105906494 A 3 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70的甲醇水溶液等度洗脱，收集713个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物()。 0011 进一步地，步骤(a)中用65乙醇热回流提取，合并提取液。 0012 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。 0013 如上所述的化合物()在。

9、制备心肌保护的药物中的应用。 0014 如上所述的西尼地平的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。 0015 本发明的优点： 0016 本发明提供的西尼地平的药物组合物中含有西尼地平和一种从草本中分离得到的结构新颖的天然产物，西尼地平和该天然产物单独作用时，可以降低心肌缺血再灌注损伤；二者联合作用时，对心肌缺血再灌注损伤的防治作用更优，可以开发成防治心肌缺血再灌注损伤的药物。具体实施方式 0017 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。 0018 实施例1：化合物()分离制备及结构确证 0019 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，。

10、购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。 0020 分离方法： (a)将黄芩的干燥根(2kg)粉碎，用65乙醇热回流提取(20L3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L3次)、乙酸乙酯(4L3次)和水饱和的正丁醇(4L3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤 (a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10乙醇洗脱12个柱体积，再用70乙醇洗脱15个柱体积，收集70洗脱液，减压浓缩得70乙醇洗脱浓缩物； (c)步骤(b)中70乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依。

11、次用体积比为55:1(8个柱体积)、 25:1(8个柱体积)、 15:1 (8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d)步骤(c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、 15:1(10个柱体积)和1:1(5 个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70的甲醇水溶液等度洗脱，收集713个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物()(345mg， HPLC归一化纯度大于98)。 0021 结构确证：淡黄色粉末， HR-ESI-MS显示M。

12、+H+为m/z253.1761，结合核磁特征可得分子式为C15H24O3，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据 H(ppm， CDCl3， 500MHz)： H-3(2.54， m)， H-4a(1.82， m)， H-4b(1.62， m)， H-5a(1.77， m)， H-5b(1.69， m)， H-6(2.07， m)， H-7(2.66， br， d， J8.7Hz)， H-8(3.54， d， J9.2Hz)， H-10a(2.37， d， J15.4Hz)， H-10b(1.90， d， J 15.4Hz)， H-11(9.87， s)， H-12a(3.93， dd， J9。

13、.2， 4.5Hz)， H-12b(3.58， dd， J9.2， 2.7Hz)， H-13(0.88， d， J7.4Hz)， H-14(0.86， s)， H-15(1.05， s)；核磁共振碳谱数据 C(ppm， CDCl3， 125MHz)： 171.2(C， 1-C)， 128.3(C， 2-C)51.2(CH， 3-C)， 24.5(CH2， 4-C)， 32.1(CH2， 5-C)， 29.3 (CH， 6-C)， 53.5(CH， 7-C)， 83.1(CH， 8-C)， 39.6(C， 9-C)， 43.7(CH2， 10-C)， 194.3(CH， 11-C)， 51.4。

14、(CH2， 12-C)， 12.5(CH3， 13-C)， 19.5(CH3， 14-C)， 25.8(CH3， 15-C)。红外波谱表明该化合物含有羟基(3340cm-1)，羰基(1735cm-1)。 13C-NMR、 DEPT和HSQC谱中显示有15个碳信号，包括说明书 2/5 页 4 CN 105906494 A 4 三个甲基，四个亚甲基(一个连氧碳)，五个次甲基(一个醛基碳和一个连氧碳)，以及三个季碳(两个烯烃碳)，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为双环结构。 1H-NMR谱结合 HSQC谱显示三个甲基质子信号 H0.88(3H， d， J7.4Hz)、 0.。

15、86(3H， s)、 1.05(3H， s)，三组亚甲基质子信号 H1.82(1H， m)与1.62(1H， m)、 1.77(1H， m)与1.69(1H， m)、 2.37(1H， d， J 15.4Hz)与1.90(1H， d， J15.4Hz)，一组羟甲基质子信号 H3.93(1H， dd， J9.2， 4.5Hz)与 3.58(1H， dd， J9.2， 2.7Hz)，三个次甲基质子信号 H2.54(1H， m)， 2.07(1H， m)与2.66(1H， br， d， J8.7Hz)，一个连氧次甲基质子信号 H3.54(1H， d， J9.2Hz)，一个醛基质子信号 H。

16、 9.87(1H， s)。 1H-1HCOSY谱中存在H-3/H2-12、 H-3/H2-4/H2-5/H-6/H-7/H-8相关信号，同时 HMBC谱中显示有H2-4与C-2和C-3， H2-5与C-3， H-6与C-8， H-7与C-1， H2-10与C-1、 C-2、 C-7、 C- 8和C-14， H-11与C-1、 C-2和C-3， H2-12与C-2， H3-13与C-5和C-7， H3-14与C-8、 C-9和C-10， H3- 15与C-9和C-10相关信号，通过上述NMR谱中的相关信息可以构建该化合物的连接方式，并且上述波谱数据表明该化合物为tremulane型倍半萜。

17、。 HMBC谱中H3-14与C-8和C-9的相关性表明C-8位连有一个羟基。在tremulane型倍半萜中， H-6与H-7位为构型， H3-14构型通常处是位， H3-15构型为位。在该化合物的NOE试验中体现的H-6与H-7以及H-7与H3-14相关信号符合tremulane型倍半萜的构型关系。同时， NOESY谱中H2-12与H-7以及H3-15与H-8的相关性表明羟甲基为构型， H-8为构型。综合氢谱、碳谱、 HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一。

18、致。 0022 化学结构式及碳原子编号如下： 0023 0024 实施例2：对大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的保护作用 0025 1、材料与方法 0026 1.1动物 0027 SD大鼠70只，体重180200g，雌雄各半，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。清洁级动物房饲养，定时给予全价营养饲料喂食，室温2225，湿度50 70。 0028 1.2试剂与样品 0029 西尼地平购自上海极威生物科技有限公司。化合物()自制，制备方法见实施例1。丹红注射液(原儿茶醛0.05gL-1，约相当于生药1gmL-1)，由山东济南步长制药有限公司生产。肌钙蛋白T。

19、(CardiactroponinT， cTnT)试剂盒由美国RapidBioLab公司生产，北京莱博特利生物医学科技公司提供；肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒由北京中生北控生物科说明书 3/5 页 5 CN 105906494 A 5 技股份有限公司提供；硝基四氮唑蓝(NBT)，上海前进试剂厂生产。血栓素(TXB2)和6-酮-前列腺素F1 (6-keto-PGF1 )放射免疫试剂盒，由北京普尔伟业生物技术有限公司提供；二磷酸腺苷(adenosinediphosphate， ADP)，由美国CHRO-NOLOG公司生产，北京现代威士达医疗器械有限公司提供，浓度0.。

20、2mmolL-1。 0030 1.3仪器 0031 SC-3人工呼吸机(上海医疗设备厂)； ECG-6511心电图机(上海光电仪器有限公司)； RX-2000全自动生化仪(美国Technicon公司)； LBY-NJ2血小板聚集仪(北京普利生公司)； SN-682放射免疫计数仪(上海核辐射仪器有限公司)。 0032 1.4大鼠分组及模型制备 0033 20氨基甲基乙酯(乌拉坦)腹腔注射麻醉(0.7mLkg-1)，大鼠固定在专用木板上，气管插管，人工呼吸(潮气量为20mLkg-1，呼吸频率为50次/min)吸入室内空气，开胸，剪开心包膜，轻轻挤压大鼠胸腔右侧壁，将心脏挤出。。

21、在左心耳下缘，肺动脉圆锥左缘与左心耳之间进针，以冠状静脉主干为标志，左心耳下方23mm处用丝线结扎(垫1个半圆形硅胶管)冠状动脉前降支造成大鼠心肌缺血，心电监护显示结扎冠状动脉成功(持续2min)后 10min经股静脉iv给药。假手术组只穿线不结扎，注射等剂量生理盐水；模型组结扎后，给予等剂量生理盐水。实验过程中动物处置方法符合动物伦理学要求标准。实验分组分别作空白对照(假手术)组、模型对照组、西尼地平组(80mgkg-1)、化合物()组(80mgkg-1)、西尼地平与化合物()组合物组【40mgkg-1西尼地平+40mgkg-1化合物()】及阳性药。

22、对照组。阳性药物对照组：丹红注射液(50mgkg-1)。 0034 1.5标本采集 0035 大鼠造模缺血后40min，剪断丝线再灌注60min。记录结扎前、结扎后40min及剪开丝线后(再灌注)60min导心电图。观察60min后，腹主动脉取血，一部分放入3.8枸橼酸钠溶液1:9抗凝真空管和消心痛+2EDTANa2溶液抗凝管后离心，测定血小板聚集性和TXB2， 6-keto-PGF1 含量。另一部分不抗凝放入真空管后离心测定血清cTnT， CK-MB含量。然后，取出心脏，生理盐水冲洗，称量全心重，在心脏结扎线以下，平行于冠状沟均匀地将左心室部分横断切。

23、成5片，置于NBT溶液37染色15min。用DeltaPix(丹麦)图像分析系统测量每片心肌面积、心室面积和梗死区面积，然后求出梗死区占心室和全心区面积的百分比。 0036 1.6指标检测方法 0037 放射免疫法测定TXB2， 6-keto-PGF 1；全自动生化仪电化学发光法和速率法测定测定cTnT， CK-MB；比浊法测定血小板聚集率，诱导剂为ADP，浓度为0.2mmolL-1，取其1、 3、 5min及最大聚集率。 0038 1.7统计学方法 0039 所有数据用xs表示，组间比较为单因素方差分析，组间比较采用LSD方法， P 0.05为差异有统计学意义，采。

24、用SPSS19.0软件包进行统计学处理。 0040 2、实验结果 0041 2.1对大鼠MI面积和I/R损伤后CK-MB和cTnT的影响 0042 大鼠心肌I/R损伤后，模型组血清CK-MB活性明显升高，和假手术组比较有显著差异(P0.01)。模型组cTnT水平亦有一定升高，但与假手术组比较无显著差异，穿刺对心肌组织也是一种损伤。与模型对照组比较，西尼地平与化合物()组合物组及阳性对照组均能显说明书 4/5 页 6 CN 105906494 A 6 著降低大鼠MI面积及动物血清CK-MB水平和cTnT含量(P0.01)；与模型对照组比较，西尼地平组、化合物()组大。

25、鼠MI面积及血清CK-MB水平和cTnT含量降低(P0.05)。 0043 结果见表1。 0044 2.2对大鼠心肌I/R损伤后血小板聚集性、 6-keto-PGF1 和TXB2的影响 0045 与正常对照组比较，模型对照组小鼠血小板聚集性升高(P0.05)， TXB2升高(P 0.05)， (P0.05)， 6-keto-PGF1 降低；与模型对照组比较，西尼地平与化合物()组合物组和阳性对照组血小板最大聚集率和TXB2显著降低(P0.01)， 6-keto-PGF1显著升高(P 0.01)；与模型对照组比较，西尼地平组、化合物()组血小板最大聚集率和TXB2降低(P 0.05。

26、)， 6-keto-PGF1 升高(P0.05)。结果见表2。 0046 表1对大鼠MI面积和I/R损伤后CK-MB和cTnT的影响 0047 组别心肌梗死面积/cTnT/mgL-1CK-MB/UL-1 空白对照组/0.970.17437.17154.82 模型对照组29.133.181.040.141268.17256.50 阳性对照组24.975.940.630.14386.39107.71 西尼地平组21.562.080.740.14762.92118.55 化合物()组21.132.890.770.81758.14160.19 西尼地平与化合物()组合物组19.856.740.620。

27、.18385.32117.05 0048 表2对大鼠心肌I/R损伤后血小板聚集性、 6-keto-PGF1 和TXB2的影响 0049 0050 上述结果表明，西尼地平或化合物()单独作用时，对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用；西尼地平和化合物()联合作用时，对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用更为明显，可以开发成保护心肌缺血/再灌注损伤的药物。 0051 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。说明书 5/5 页 7 CN 105906494 A 7 。

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