技术领域
本发明涉及合成有机化学和药学领域，具体涉及一种培美曲塞氧化杂质即培美曲 塞氧化物及其制备和在培美曲塞二钠质量控制中的用途。
背景技术
培美曲塞(Pemetrexed)及其盐(式I化合物，当M1+和M2+均为H+时即为培美曲塞)公 开作为一种多种叶酸依赖酶包括胸苷酸合成酶(TS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和甘氨酰胺核 糖核苷酸甲酰基转移酶(GARFT)的强有力的抑制剂，如EP334636，EP432677，CN1552713， CN101033227等报道，具有抗癌活性。
式中：
M1+和M2+可以是一价阳离子，如：H+、Li+、Na+、K+或单氨阳离子(如NH4+、二甲胺离子、 二乙胺离子、葡甲胺离子、胺基葡萄糖离子等)等，M1+和M2+可以相同或不同；M1+和M2+也可以 联合起来代表二价阳离子，如：Ca2+、Mg2+、Zn2+或二氨阳离子(如乙二胺离子，丙二胺离子) 等。
培美曲塞的二钠盐，即培美曲塞二钠(式II化合物)作为抗癌药已在中国、美国、欧 盟等
国上市，目前，培美曲塞二钠在治疗癌症方面已批准有四个适应症：(1)与顺铂联 合用药，治疗不宜手术的恶性胸膜间皮瘤，培美曲塞二钠是治疗恶性胸膜间皮瘤的第一个 也是唯一一个药物；(2)单独用于二线治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌，由于培美曲塞 二钠治疗非小细胞肺癌疗效确切，副作用较小，已成为该适应症新的标准药物；(3)与顺铂 联合用药一线治疗晚期非小细胞肺癌；(4)维持治疗晚期或转移性非鳞癌型非小细胞肺癌， 培美曲塞二钠是具有该适应症的第一个药物。另外，其用于治疗肠癌、胰腺癌、头颈部癌、胃 癌、膀胱癌、乳腺癌等的研究正在II、III期临床中，有望不久用于这些癌症的治疗。
杂质研究是药物研发的一项重要内容，直接关系到药物的质量控制及安全性，如 本领域技术人员已知的，通过鉴定药物活性成分或药物终产品中杂质结构和确定杂质的 量，可以大大加强对产品质量和安全性的控制。培美曲塞及其药用盐在制备、储存和使用中 的主要杂质是通过氧化和水解两个途径产生，这一点也在欧盟EMEA批准培美曲塞二钠上市 的文件中进行了表述(http://www.emea.eu.int//humandocs/PDFs/EPAR/alimta/ 102004enl.pdf.)。但是，现有报道并没有公开培美曲塞或其盐被氧化后产生了何种杂质 (副产物或降解产物)，也没有文献公开其氧化杂质的化学结构和名称。因此进一步识别、分 离以及化学表征培美曲塞二钠中的氧化杂质对进一步提高培美曲塞二钠质量控制水平和 安全性有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供了培美曲塞及其盐中的氧化杂质化合物，所述杂质化合物 为式III的化合物和/或式IV的化合物及其它们的手性异构体或其盐，其中，式中A-1、A-2、 A-3、B-1、B-2、B-3为手性中心。
这些杂质是培美曲塞及其药用盐在制备、储存和使用中通过氧化和/或水解两个 途径产生的，这些杂质以酸或者盐的形式存在。
本发明所述III式化合物的手性中心A-1、A-2分别位于其吡咯并[2，3-d]嘧啶基的 5位和6位，所述IV式化合物的手性中心B-1、B-2分别位于其吡咯并[2，3-d]嘧啶基的5位和6 位。
为实现上述本发明的目的，提供如下具体实施方案：
在一实施方案中，一种式III的化合物及其手性异构体或它们的盐，
式中，手性中心(A-1，A-2)为(R，R)型、(S，S)型或它们的混合型，手性中心A-3为S 型、R型或它们的混合型，优选手性中心A-3为S型(即L-谷氨酸)。
上述式III化合物为培美曲塞及其盐的氧化杂质，其化学名为：N-[4-[2-[2-氨基- 4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-谷氨 酸(以下简称“氧化物A”)，其中，所述的盐包括碱式加成盐和酸式加成盐。
对于氧化物A的碱式加成盐包括一价阳离子盐和二价阳离子盐等，其中，一价阳离 子盐包括钠盐，钾盐，锂盐，单氨阳离子盐(如氨盐、二甲胺盐、二乙胺能、葡甲胺盐、胺基葡 萄糖盐等)等或它们的混合盐；其中进一步包括这些一价阳离子的双离子盐，单离子盐，三 离子盐或它们的混合物。在这些一价阳离子盐中，优选钠盐，钾盐，锂盐的双离子盐，即二钠 盐，二钾盐和二锂盐，更优选二钠盐；二价阳离子盐包括钙盐，镁盐，锌盐，二氨盐(如乙二胺 盐，丙二胺盐等)等，优选的盐为钠盐，更优选二钠盐。
对于氧化物A的酸式加成盐包括盐酸盐，硫酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，甲磺酸盐， 对甲苯磺酸盐等。
上述本发明的式III化合物或其盐，具体包括以下化合物：
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(即手性中心A-3为S构型，简称为“培美曲塞氧化物A”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸(即手性中心A-3为R构型)
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物A”)
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物A”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“培美曲塞氧化物A二钠盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠盐(即手性中心A-3为R构型)
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物A二 钠盐”)
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二 钠盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“培美曲塞氧化物A二钾盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钾盐
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物A二 钾盐”)
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二 钾盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“培美曲塞氧化物A二锂盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二锂盐
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物A二 锂盐”)
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二 锂盐”)
在另一具体实施方案，一种式IV的化合物及其手性异构体、消旋体或它们的盐，
式中，手性中心B-1，B-2和B-3均包括S型，R型或它们的混合型。
上述的式IV的化合物为培美曲塞及其盐的氧化杂质，其化学名为：N-[4-[2-[2-氨 基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-谷氨 酸(以下简称物“氧化物B”)，或其盐，其中，对于盐，由于式IV化合物中同时具有酸性基团和 碱性基团，因此该盐包括碱式加成盐和酸式加成盐。
对于氧化物B的碱式加成盐包括一价阳离子盐和二价阳离子盐等，其中，一价阳离 子盐包括钠盐，钾盐，锂盐，单氨阳离子盐(如氨盐、二甲胺盐、二乙胺盐、葡甲胺盐、胺基葡 萄糖盐等)等或它们的混合盐；其中进一步包括这些一价阳离子的双离子盐，单离子盐和三 离子盐。在这些一价阳离子盐中，优选钠盐，钾盐，锂盐的双离子盐，即二钠盐，二钾盐和二 锂盐，更优选二钠盐；二价阳离子盐包括钙盐，镁盐，锌盐，二氨盐(如乙二胺盐，丙二胺盐 等)等，优选的盐为钠盐，更优选二钠盐。
对于氧化物B的酸式加成盐包括盐酸盐，硫酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，甲磺酸盐， 对甲苯磺酸盐等。
本发明上述的式IV的化合物或其盐，包括以下化合物或其盐：
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“培美曲塞氧化物B”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸(即手性中心B-3为R构型)
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物B”)
(5S，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“(5S，6R)-培美曲塞氧化物B”)
(5R，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“(5R，6S)-培美曲塞氧化物B”)
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物B”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“培美曲塞氧化物B二钠盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠盐
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二钠 盐”)
(5S，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钠 盐”)
(5R，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二钠 盐”)
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠盐(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二钠 盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“培美曲塞氧化物B二钾盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钾盐
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二钾 盐”)
(5S，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钾 盐”)
(5R，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二钾 盐”)
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二钾 盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“培美曲塞氧化物B二锂盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二锂盐
(5S，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二锂 盐”)
(5S，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二锂 盐”)
(5R，6S)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二锂 盐”)
(5R，6R)-N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d] 嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二锂 盐”)
上述结构为式III或式IV的化合物，每一个化合物都可能以其互变异构体的平衡 混合物形式存在，下列的局部结构式表示分子中进行互变异构的那部分结构，因此，本发明 的化合物包括相应的互变“1-氧代，4-氧代”、“1-氧代，4-羟基”等形式。
本发明的式III化合物及其盐或式IV化合物及其盐，在一些实施方案中被分离为 具有至少0.01％的纯度，或者至少0.1％的纯度，或者至少1％的纯度，或者至少5％的纯度， 或者至少10％的纯度，或者至少15％的纯度，或者至少25％的纯度，或者至少50％的纯度， 或者至少75％的纯度，或者至少95％的纯度。该纯度一般为HPLC面积归一化法的纯度。
上述氧化物A或其盐(即式III化合物)或氧化物B或其盐(即式IV化合物)可以以固 体或者溶液的形式存在。但如果氧化物A或其盐(即式III化合物)存在于含水的溶液中时， 其可以转化为相应的氧化物B或其盐(即式IV化合物)，即
本发明的另一目的是提供一种培美曲塞及其盐(式I化合物)的组合物，其特征在 于：式I化合物的含量不小于98％HPLC百分面积，式III化合物的总含量不大于0.5％HPLC百 分面积，或/和式IV化合物的总含量不大于0.5％HPLC百分面积。
优选地，本发明的培美曲塞及其盐(式I化合物)的组合物，其特征在于：式I化合物 的含量不小于98％HPLC百分面积，式III化合物的总含量不大于0.5％HPLC百分面积。
优选地，本发明的培美曲塞及其盐(式I化合物)的组合物，其特征在于：式I化合物 的含量不小于98％HPLC百分面积，式IV化合物的总含量不大于0.5％HPLC百分面积。
上述本发明的组合物，其中“式III化合物的总含量”是指出现在该组合物中，且属 于式III代表的化合物含量的总和；同样，“式IV化合物的总含量”是指出现在该组合物中， 且属于式IV代表的化合物含量的总和。
在一个具体实施方案中，本发明的培美曲塞(式I化合物中M1+和M2+同为H+)或其盐 的组合物，其特征在于：培美曲塞的含量不小于98％，杂质N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5， 6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，且手性 中心A-3为S型(培美曲塞氧化物A)，其总含量不大于0.5％，N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4- 氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，且手性中 心B-3为S型(简称为“培美曲塞氧化物B”)的总含量不大于0.5％，其含量均以HPLC百分面积 计。
在上述实施方案中，本发明的培美曲塞或其盐的组合物，进一步包括：
培美曲塞的HPLC百分面积不小于98.5％、培美曲塞氧化物A总含量的HPLC百分面 积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B总含 量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
优选地，本发明的培美曲塞或其盐的组合物，培美曲塞的HPLC百分面积不小于 99.0％、培美曲塞氧化物A总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、 0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、 0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
优选地，本发明的培美曲塞或其盐的组合物，培美曲塞的HPLC百分面积不小于 99.5％、培美曲塞氧化物A总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、 0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、 0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
优选地，本发明的培美曲塞或其盐的组合物，培美曲塞的HPLC百分面积不小于 99.5％、培美曲塞氧化物A总含量的HPLC百分面积不大于0.25％、0.2％、0.15％、0.1％或 0.05％，和/或培美曲塞氧化物B总含量的HPLC百分面积不大于0.25％、0.2％、0.15％、 0.1％或0.05％。
上述“培美曲塞氧化物A总含量”是指出现在该组合物中的(5R，6R)-培美曲塞氧化 物A或/和(5S，6S)-培美曲塞氧化物A含量的总和；“培美曲塞氧化物B总含量”是指出现在该 组合物中的(5S，6S)-培美曲塞氧化物B、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B、(5R，6S)-培美曲塞氧 化物B或/和(5R，6R)-培美曲塞氧化物B含量的总和。
在另一方面，本发明提供了一种培美曲塞二钠的组合物，其特征在于：培美曲塞二 钠的含量不小于98％HPLC百分面积，N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧 代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠(式III化合物的二钠盐， 且手性中心A-3为S型，简称为“培美曲塞氧化物A二钠盐”)总含量不大于0.5％HPLC百分面 积，和/或N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠(式IV化合物的二钠盐，且手性中心B-3为S型，简称为 “培美曲塞氧化物B二钠盐”)的总含量不大于0.5％HPLC百分面积。
优选地，本发明的培美曲塞二钠高纯度组合物，包括：培美曲塞二钠的HPLC百分面 积不小于98.5％、培美曲塞氧化物A二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、 0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B二钠盐总含量的HPLC百分面 积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
优选地，本发明的培美曲塞二钠高纯度组合物，包括：培美曲塞二钠的HPLC百分面 积不小于99.0％、培美曲塞氧化物A二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、 0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B二钠盐总含量的HPLC百分面 积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
优选地，本发明的培美曲塞二钠高纯度组合物，包括：培美曲塞二钠的HPLC百分面 积不小于99.5％、培美曲塞氧化物A二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、 0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B二钠盐总含量的HPLC百分面 积不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
优选地，本发明的培美曲塞二钠高纯度组合物，包括：培美曲塞二钠的HPLC百分面 积不小于99.5％、培美曲塞氧化物A二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于0.3％、0.2％、 0.15％、0.1％或0.05％，和/或培美曲塞氧化物B二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于 0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
更优选地，本发明的培美曲塞二钠高纯度组合物，包括：培美曲塞二钠的HPLC百分 面积不小于99.5％、培美曲塞氧化物A二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、 0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
更优选地，本发明的培美曲塞二钠高纯度组合物，包括：培美曲塞二钠的HPLC百分 面积不小于99.5％、培美曲塞氧化物B二钠盐总含量的HPLC百分面积不大于0.5％、0.4％、 0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
上述“培美曲塞氧化物A二钠盐总含量”是指出现在该组合物中的(5R，6R)-培美曲 塞氧化物A二钠盐或/和(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二钠盐含量的总和；“培美曲塞氧化物B 二钠盐总含量”是指出现在该组合物中的(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6R)-培美 曲塞氧化物B二钠盐、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐或/和(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二 钠盐含量的总和。
上述“HPLC百分面积”是指产物的纯度，是用高效液相色谱(HPLC)面积归一法测定 的，每个组份的检测限的浓度小于0.02％。含量或纯度的数值是经测量数据四舍五入所得。
本发明提供了式III化合物或其盐的制备方法，该方法包括将式V化合物在无水条 件下用氧化剂氧化而得，
式中，手性中心*包括S型，R型或它们的混合型，任意地加成盐。
上述方法中所述的盐包括碱式加成盐和酸式加成盐，其中，碱式加成盐包括一价 阳离子盐和二价阳离子盐等，一价阳离子盐包括钠盐，钾盐，锂盐，单氨阳离子盐(如氨盐、 二甲胺盐、二乙胺盐、葡甲胺盐、胺基葡萄糖盐等)等或它们的混合盐；其中进一步包括这些 一价阳离子的双离子盐，单离子能，三离子盐或它们的混合物。在这些一价阳离子盐中，优 选钠盐，钾盐，锂盐的双离子盐，即二钠盐，二钾盐和二锂盐，更优选二钠盐；二价阳离子盐 包括钙盐，镁盐，锌盐，二氨盐(如乙二胺盐，丙二胺盐等)等，酸式加成盐包括盐酸盐，硫酸 盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐等。
上述方法中所述的氧化剂包括无机氧化剂和有机氧化剂。其中无机氧化剂包括但 不限于氧气、过氧化氢、硫酸、硝酸、高氯酸及其盐、次氯酸及其盐、高锰酸钾等；有机氧化剂 包括但不限于叔丁基过氧化氢、过氧苯甲酸、间氯过氧苯甲酸等，优选过氧化氢、氧气。氧化 剂的用量一般为式V化合物摩尔量的0.01～100倍，优选0.1～50倍，更优选1～30倍。
上述方法中所说的“无水条件”包括在无水溶液中或在无溶剂条件下进行反应。 “无水溶液“是指由式V化合物、氧化剂、溶剂等组成的混合溶液，其中含水重量小于1％。其 中溶剂包括常用有机溶剂，如醇类(甲醇、乙醇、丁醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇等)、酯类(乙 酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯等)、醚类(异丙醚、石油醚、甲基叔丁基醚，乙二醇二甲醚、四氢 呋喃、二氧六环等)、腈类(乙腈、丁二腈等)、酮类(丙酮、2-丁酮等)、酰胺类(N，N-二甲基甲 酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等)、砜类(二甲亚砜等)以及它们的混合物；其中优选甲醇、乙醇和 N，N-二甲基甲酰胺。溶剂体积用量一般为式V化合物质量的0.5～50倍，优选1～25倍，更优 选5～10倍。
本发明的方法还进一步包括将制得的氧化物A或其盐(式III化合物)进行分离纯 化，分离纯化方法可采为本技术领域内常规的方法，如：重结晶、色谱分离、冷冻干燥等。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种培美曲塞氧化物A(即式III化合物， 且手性中心A-3为S型)的制备方法，该方法包括将培美曲塞溶解于有机溶剂中，通入过氧化 氢气体进行氧化，控制该溶液体系含水重量小于1％。其中，有机溶剂可选自甲醇、乙醇、四 氢呋喃、乙腈、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜等以及它们的混合 物，其中优选甲醇、乙醇和N，N-二甲基甲酰胺；溶剂的体积为培美曲塞质量的0.5～100倍， 优选1～50倍，更优选5～30倍。过氧化氢用量为式V化合物摩尔量的0.1～50倍，优选1～30 倍。反应温度一般为-20℃至溶剂沸点温度，优选-10～50℃，更优选0～30℃。
所制得的培美曲塞氧化物A纯度为具有至少0.1％的纯度，或者至少0.5％的纯度， 或者至少1％的纯度，或者至少5％的纯度，或者至少10％的纯度，或者至少15％的纯度，或 者至少25％的纯度，或者至少50％的纯度，或者至少75％的纯度，或者至少95％的纯度。该 纯度一般为HPLC面积归一化法的纯度。
在另一个具体的实施方案中，本发明提供了一种培美曲塞氧化物A二钠盐、二钾盐 或二锂盐(即式III化合物中的二钠盐、二钾盐或二锂盐，且手性中心A-3为S型)的制备方 法，该方法包括将培美曲塞二钠盐、二钾盐或二锂盐(即式V化合物中的二钠盐、二钾盐或二 锂盐，且手性中心*为S型)在无溶剂条件下，即固体状态下通入空气或氧气进行处理。温度 一般为20～100℃，优选60～80℃。所制得的培美曲塞氧化物A二钠盐、二钾盐或二锂盐的在 一些实施方案中被分离为具有至少0.1％的纯度，或者至少0.5％的纯度，或者至少1％的纯 度，或者至少5％的纯度，或者至少10％的纯度，或者至少15％的纯度，或者至少25％的纯 度，或者至少50％的纯度，或者至少75％的纯度，或者至少95％的纯度。该纯度一般为HPLC 面积归一化法的纯度。
本发明提供了一种氧化物B或其盐(式IV化合物)的制备方法，该方法包括将式V化 合物在含水条件下用氧化剂氧化而得，或将氧化物A或其盐(式III化合物)水解而得。
式V
式中，手性中心*包括S型，R型或它们的混合型，其盐包括碱式加成盐和酸式加成 盐。
该方法中式V化合物中的“碱式加成盐”包括一价阳离子盐和二价阳离子盐等。其 中一价阳离子盐包括钠盐，钾盐，锂盐，单氨阳离子盐(如氨盐、二甲胺盐、二乙胺盐、葡甲胺 盐、胺基葡萄糖盐等)等或它们的混合盐；其中进一步包括这些一价阳离子的双离子盐，单 离子盐，三离子盐或它们的混合物。在这些一价阳离子盐中，优选钠盐，钾盐，锂盐的双离子 盐，即二钠盐，二钾盐和二锂盐，更优选二钠盐。其中二价阳离子盐包括钙盐，镁盐，锌盐，二 氨盐(如乙二胺盐，丙二胺盐等)等。
该方法中式V化合物中的“酸式加成盐”包括盐酸盐，硫酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐， 甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐等。
上述方法中“氧化剂”包括无机氧化剂和有机氧化剂。其中无机氧化剂包括但不限 于氧气、过氧化氢、硫酸、硝酸、高氯酸及其盐、次氯酸及其盐、高锰酸钾等；有机氧化剂包括 但不限于叔丁基过氧化氢、过氧苯甲酸、间氯过氧苯甲酸等。其中优选过氧化氢。氧化剂的 用量一般为式V化合物摩尔量的0.01～100倍，优选0.1～50倍，更优选1～30倍。
该方法中“含水条件“是指由式V化合物、氧化剂、水及可选的有机溶剂等组成的混 合水溶液，其中含水重量大于5％，优选大于20％，更优选大于50％。对于有机溶剂可包括如 醇类(甲醇、乙醇、丁醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇等)、酯类(乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯 等)、醚类(异丙醚、石油醚、甲基叔丁基醚，乙二醇二甲醚、四氢呋喃、二氧六环等)、腈类(乙 腈、丁二腈等)、酮类(丙酮、2-丁酮等)、酰胺类(N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等)、 砜类(二甲亚砜等)以及它们的混合物。水或水与有机溶剂混合物的溶剂体积一般为式V化 合物质量的0.5～100倍，优选1～50倍，更优选5～30倍。
该方法中氧化反应温度一般为-20℃至溶剂沸点温度，优选-10～50℃，更优选0～ 30℃。
该方法中还可以进一步包括将制得的氧化物B或其盐(式III化合物)进行分离纯 化，分离纯化方法可采为本技术领域内常规的方法，如：重结晶、色谱分离、冷冻干燥等。
该方法中氧化物B或其盐在一些实施方案中被分离为具有至少0.1％的纯度，或者 至少0.5％的纯度，或者至少1％的纯度，或者至少5％的纯度，或者至少10％的纯度，或者至 少15％的纯度，或者至少25％的纯度，或者至少50％的纯度，或者至少75％的纯度，或者至 少95％的纯度。该纯度一般为HPLC面积归一化法的纯度。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种培美曲塞氧化物B(即式IV化合物中 的氧化物B部分，且手性中心B-3为S型)的制备方法，该方法包括将培美曲塞(即式V化合物 中的酸部分，且手性中心*为S型)溶解于水或水与选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、乙腈、丙酮、N， N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜等组成的混合溶剂，加入过氧化氢进行氧 化，其中控制该溶液体系含水重量大于5％，优选大于20％，更优选大于50％。其中混合溶剂 体积为培美曲塞质量的1～50倍，优选5～30倍。过氧化氢用量为式V化合物摩尔量的0.1～ 50倍，优选1～30倍。氧化反应温度一般为-10～50℃，优选0～30℃。所制得的培美曲塞氧化 物B在一些实施方案中被分离为具有至少0.1％的纯度，或者至少0.5％的纯度，或者至少 1％的纯度，或者至少5％的纯度，或者至少10％的纯度，或者至少15％的纯度，或者至少 25％的纯度，或者至少50％的纯度，或者至少75％的纯度，或者至少95％的纯度。该纯度一 般为HPLC面积归一化法的纯度。
在另一个具体的实施方案中，本发明提供了一种培美曲塞氧化物B二钠盐、二钾盐 或二锂盐(即式IV化合物中的二钠盐、二钾盐或二锂盐，且手性中心A-3为S型)的制备方法， 该方法包括将培美曲塞二钠盐、二钾盐或二锂盐(即式V化合物中的二钠盐、二钾盐或二锂 盐，且手性中心*为S型)溶解于水中，加入过氧化氢进行氧化。其中水体积为培美曲塞二钠 盐、二钾盐或二锂盐质量的1～50倍，优选5～30倍。过氧化氢用量为式V化合物摩尔量的0.1 ～50倍，优选1～30倍。氧化反应温度一般为-10～50℃，优选0～30℃。所制得的培美曲塞氧 化物B二钠盐、二钾盐或二锂盐在一些实施方案中被分离为具有至少0.1％的纯度，或者至 少0.5％的纯度，或者至少1％的纯度，或者至少5％的纯度，或者至少10％的纯度，或者至少 15％的纯度，或者至少25％的纯度，或者至少50％的纯度，或者至少75％的纯度，或者至少 95％的纯度。该纯度一般为HPLC面积归一化法的纯度。可用制备液相色谱、冷冻干燥等相结 合的方法对该培美曲塞氧化物B二钠盐、二钾盐或二锂盐进行进一步的分离纯化，得到固体 物。
在另一个具体的实施方案中，本发明提供了一种培美曲塞氧化物B二钠盐、二钾盐 或二锂盐(即式IV化合物中的二钠盐、二钾盐或二锂盐，且手性中心A-3为S型)的制备方法， 该方法包括将培美曲塞氧化物A二钠盐、二钾盐或二锂盐溶解于水中。温度一般为-10～50 ℃，优选0～30℃。所制得的培美曲塞氧化物B二钠盐、二钾盐或二锂盐在一些实施方案中被 分离为具有至少0.1％的纯度，或者至少0.5％的纯度，或者至少1％的纯度，或者至少5％的 纯度，或者至少10％的纯度，或者至少15％的纯度，或者至少25％的纯度，或者至少50％的 纯度，或者至少75％的纯度，或者至少95％的纯度。该纯度一般为HPLC面积归一化法的纯 度。可用制备液相色谱、冷冻干燥等相结合的方法对该美曲塞氧化物B二钠盐、二钾盐或二 锂盐进行进一步的分离纯化，得到固体物。
在另一个具体的实施方案中，培美曲塞氧化物B或其盐(即式IV化合物中的二钠 盐、二钾盐或二锂盐，且手性中心A-3为S型)在用制备液相色谱分离纯化时，会发生以下方 式的互变：
互变体I
根据不同的分离条件的控制(如分离温度、分离时间等)，互变体I所占培美曲塞氧 化物B或其盐的质量百分比有一定变化，一般小于50％，优选小于40％，更优选30％。所制得 的培美曲塞氧化物B或其互变体，或它们的混合物(包括它们的二钠盐、二钾盐或二锂盐)在 一些实施方案中被分离为具有至少0.1％的纯度，或者至少0.5％的纯度，或者至少1％的纯 度，或者至少5％的纯度，或者至少10％的纯度，或者至少15％的纯度，或者至少25％的纯 度，或者至少50％的纯度，或者至少75％的纯度，或者至少95％的纯度。该纯度一般为HPLC 面积归一化法的纯度。
本发明的再一目的是，将式III化合物或/和式IV化合物用于培美曲塞及其能(式I 化合物)质量控制对照品的用途。具体来说是式III化合物(优选培美氧化物A及二钠盐)或/ 和式IV化合物(优选培美曲塞氧化物B及二钠盐)用于培美曲塞及二钠盐的制备、储存和使 用过程中质量控制对照品和杂质测试。
本发明提供了一种测定培美曲塞及其盐的杂质的方法，该方法包括：
(1)提供一种已知量和/或特性的式III化合物(优选培美氧化物A及二钠盐)或/和 式IV化合物(优选培美曲塞氧化物B及二钠盐)的参照样品；
(2)提供一种培美曲塞或其盐(优选二钠盐)样品；
(3)用HPLC测定参照样品和培美曲塞或其盐(优选二钠盐)样品中的III化合物或 其盐，或/和式IV化合物或其盐的含量。
在上述测试方法中，培美曲塞或其盐样品中的III化合物或其盐或/和式IV化合物 或其盐的含量不大于0.5％，更优选的含量为不大于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、 0.1％或0.05％。
所说的HPLC法一般包括外标法、内标法、相对保留时间以及校正因子法等。
外标法可以包括：提供一种式III化合物或/和式IV作参照样品，用HPLC测试；提供 一种含培美曲塞或其盐样品，在相同条件下用HPLC测试；根据测试结果计算式III化合物 或/和式IV化合物在培美曲塞或其盐样品中的量。
在一个外标法的具体实施方案中，本发明测定培美曲塞或其盐的方法，该方法包 括以下步骤：
a)定量配制含式III化合物或/和式IV化合物或其盐的参比溶液，在一组条件下注 入HPLC柱，获得HPLC图谱，其中参比溶液中式III化合物或/和式IV化合物的量和/或特性是 已知的；
b)定量配制含培美曲塞或其盐的供试溶液，在相同组条件下注入HPLC柱，获得 HPLC图谱；
c)通过对比步骤a)和步骤b)的HPLC图谱上色谱峰的保留时间或相对保留时间和 峰面积/或峰高计算出式III化合物或/和式IV化合物在培美曲塞或其盐供试品中的含量。
内标法包括：提供一种式III化合物或/和式IV作参照样品，以培美曲塞或其盐为 内标物，通过HPLC测试得出相对保留时间和校正因子；提供一种培美曲塞或其盐样品，用相 同条件HPLC的测试；根据测试结果及相对保留时间和校正因子计算式III化合物或/和式IV 化合物在培美曲塞或其盐样品中的存在和/或量。
在一个内标法的具体实施方案中，本发明的测定培美曲塞及其盐的杂质的方法， 该方法包括：定量配制含式III化合物(优选培美氧化物A及二钠盐)或/和式IV化合物(优选 培美曲塞氧化物B及二钠盐)和含培美曲塞或其盐(优选二钠盐)作为内标物的参比溶液，在 一组条件下注入HPLC柱，获得第一HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)，其中参比 溶液中式III化合物(优选培美氧化物A及二钠盐)或/和式IV化合物(优选培美氧化物B及二 钠盐)和培美曲塞或其盐(优选二钠盐)的量和/或特性是已知的；定量配制含培美曲塞或其 盐(优选二钠盐)的供试溶液，在相同组条件下注入HPLC柱，获得第二HPLC图谱(该图谱可以 是一张，也可以是一组)；通过第一HPLC图谱计算出色谱峰的相对保留时间和校正因子，对 比第二HPLC图谱上色谱峰的相对保留时间和峰面积/或峰高计算出式III化合物或/和式IV 化合物在培美曲塞或其盐供试品中的存在和/或量。
上述校正因子法，该方法包括提供一种式III化合物或/和式IV作参照样品，通过 与培美曲塞或其盐HPLC的对比测试得出校正因子；提供一种培美曲塞或其盐样品，用相同 条件HPLC的测试；用式III化合物或/和式IV化合物对培美曲塞或其盐样品中的相应杂质进 行定位；根据测试结果及校正因子计算式III化合物或/和式IV化合物在培美曲塞或其盐样 品中的存在和/或量。
在一个校正因子法的具体实施方案中，本发明的测定培美曲塞及其能的杂质的方 法，该方法包括：定量配制含式III化合物或/和式IV化合物的参比溶液和含培美曲塞或其 盐的参比溶液，这两种参比溶液可以混合配制(即含式III化合物或/和式IV化合物和含培 美曲塞或其盐的参比溶液)，也可以是分别单独配制，在一组条件下注入HPLC柱，获得第一 HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)，其中参比溶液中式III化合物或/和式IV化 合物和培美曲塞或其盐的量和/或特性是已知的；定量配制含培美曲塞或其盐的供试溶液， 在相同组条件下注入HPLC柱，获得第二HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)；向含 培美曲塞或其盐的供试溶液中加入一定量的含式III化合物或/和式IV化合物的溶液，在相 同组条件下注入HPLC柱，获得第三HPLC图谱(该图谱用于式III化合物或/和式IV化合物的 定位)；通过第一HPLC图谱计算出色谱峰的校正因子，通过第三HPLC图谱的定位，通过第二 HPLC图谱上III化合物或/和式IV化合物色谱峰的峰面积计算出式III化合物或/和式IV化 合物在培美曲塞或其盐供试品中的存在和/或量。
上述相对保留时间法，该方法包括：提供一种式III化合物或/和式IV作参照样品， 用HPLC测试；提供一种培美曲塞或其盐样品，用相同条件HPLC的测试；在培美曲塞或其盐样 品中定量加入式III化合物或/和式IV化合物，用相同条件HPLC的测试；根据测试结果计算 式III化合物或/和式IV化合物在培美曲塞或其盐样品中的存在和/或量。
在一个相对保留时间法的具体实施方案中，本发明的测定培美曲塞及其盐的杂质 的方法，该方法包括：定量配制含式III化合物或/和式IV化合物的参比溶液，在一组条件下 注入HPLC柱，获得第一HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)，其中参比溶液中式 III化合物或/和式IV化合物的量和/或特性是已知的；定量配制含培美曲塞或其盐的供试 溶液，在相同组条件下注入HPLC柱，获得第二HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一 组)；向含培美曲塞或其盐的供试溶液中加入定量的含式III化合物或/和式IV化合物的参 比溶液，在相同组条件下注入HPLC柱，获得第三HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一 组)；通过HPLC图谱上的保留时间和/或峰面积计算出式III化合物或/和式IV化合物在培美 曲塞或其盐供试品中的存在和/或量。
上述测定的方法进一步还可包括，以书面形式备案III化合物或/和式IV化合物的 化学特性或/和其作为杂质在培美曲塞或其盐供试品中的存在和/或量。
上述的本发明的测定培美曲塞及其盐的杂质的方法，其中所述的培美曲塞或其盐 优选培美曲塞或培美曲塞二钠；所述的III化合物或其盐优选培美曲塞氧化物A、(5R，6R)- 培美曲塞氧化物A、(5S，6S)-培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二钠盐、(5R，6R)-培美曲 塞氧化物A二钠盐或(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二钠盐；所述的IV化合物或其盐优选培美曲 塞氧化物B、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B、(5R，6S)-培美曲塞氧 化物B、(5R，6R)-培美曲塞氧化物B、培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二 钠盐、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐或(5R，6R)-培 美曲塞氧化物B二钠盐。
上述的本发明的测定培美曲塞及其盐的杂质的方法，培美曲塞或其二钠盐样品中 的III化合物或其盐或/和式IV化合物或其盐的含量不大于0.5％，更优选的含量为不大于 0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％。
上述方法中HPLC柱可以是反相柱也可以是正相柱，其中优选反相HPLC柱，更优选 反相C18HPLC柱；流动相可采用用含水、乙腈、甲酸铵溶液、磷酸盐溶液等或其混合物的溶液 进行洗脱；检测波长为226～300nm，优选254nm。
在一具体实施方案中，本发明的测定培美曲塞的杂质的方法，该方法包括：
(1)提供一种已知量和/或特性的III化合物或/和式IV化合物作参照样品；
(2)提供一种培美曲塞样品；
(3)用HPLC法确定培美曲塞样品中培美曲塞氧化物A、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A、 (5S，6S)-培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物B、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B、(5S，6R)-培美 曲塞氧化物B、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B或/和(5R，6R)-培美曲塞氧化物B的量，
其中，式III化合物选自培美曲塞氧化物A、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A、(5S，6S)- 培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二钠盐、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A二钠盐或(5S，6S)- 培美曲塞氧化物A二钠盐；式IV化合物选自培美曲塞氧化物B、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B、 (5S，6R)-培美曲塞氧化物B、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B、(5R，6R)-培美曲塞氧化物B、培美 曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钠 盐、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐或(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐。
上述方法具体操作如下：
定量配制含式III化合物或/和式IV化合物的参比溶液，在一组条件下注入HPLC 柱，获得第一HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)，其中参比溶液中式III化合物 或/和式IV化合物的量和/或特性是已知的；定量配制含培美曲塞的供试溶液，在相同组条 件下注入HPLC柱，获得第二HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)；通过对比第一和 第二HPLC图谱上色谱峰的保留时间或相对保留时间和峰面积/或峰高计算出式III化合物 或/和式IV化合物在培美曲塞供试品中的存在和/或量。
上述方案中，式III化合物或其盐优选培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二钠 盐；式IV化合物或其盐优选培美曲塞氧化物B、培美曲塞氧化物B二钠盐。
在另一具体实施方案中，本发明提供了的测定培美曲塞二钠的杂质的方法，该方 法包括：
(1)提供一种已知量和/或特性的式III化合物或其盐或/和式IV化合物或其盐的 参照样品；
(2)提供一种培美曲塞二钠样品；
(3)用HPLC法确定培美曲塞二钠样品中培美曲塞氧化物A二钠盐、(5R，6R)-培美曲 塞氧化物A二钠盐、(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二钠盐、培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6S)- 培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二 钠盐或/和(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐的存在或/和量，
其中，式III化合物选自培美曲塞氧化物A、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A、(5S，6S)- 培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二钠盐、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A二钠能或(5S，6S)- 培美曲塞氧化物A二钠盐；式IV化合物选自培美曲塞氧化物B、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B、 (5S，6R)-培美曲塞氧化物B、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B、(5R，6R)-培美曲塞氧化物B、培美 曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钠 盐、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐或(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐。
该方法具体操作如下：
定量配制含式III化合物或/和式IV化合物的参比溶液，在一组条件下注入HPLC 柱，获得第一HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)，其中参比溶液中式III化合物 或/和式IV化合物的量和/或特性是已知的；定量配制含培美曲塞二钠的供试溶液，在相同 组条件下注入HPLC柱，获得第二HPLC图谱(该图谱可以是一张，也可以是一组)；通过对比第 一和第二HPLC图谱上色谱峰的保留时间或相对保留时间和峰面积/或峰高计算出式III化 合物或/和式IV化合物在培美曲塞二钠供试品中的存在和/或量。
上述方案中式III化合物或其盐优选培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二钠盐； 式IV化合物或其盐优选培美曲塞氧化物B、培美曲塞氧化物B二钠盐。
在一个示例性的实施例方案中，本发明的测定培美曲塞二钠的杂质的方法，该方 法包括：取一定量的培美曲塞氧化物A二钠盐或/和培美曲塞氧化物B二钠盐，精密称定，加 入流动相定量溶解(0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈体积比为94∶6)，即得参比溶液，取参比溶 液定量注入以十八烷基硅烷键合硅胶反相柱为色谱柱的HPLC色谱仪，用此流动相进行洗 脱，记录HPLC图谱；取一定量的培美曲塞二钠，精密称定，用上述流动相定量溶解即得供试 溶液，取供试溶液定量注入同样测试条件的HPLC色谱仪，记录HPLC图谱；通过对比参比溶液 HPLC图谱和供试溶液HPLC图谱中的保留时间和/或峰面积，计算出培美曲塞二钠供试溶液 中杂质培美曲塞氧化物A二钠盐或/和培美曲塞氧化物B二钠盐的含量。当然，也可以通过相 对保留时间、校正因子等方法达到同样目的。
上述通过参比溶液和供试溶液的HPLC测试并计算供试溶液中杂质的含量的方法 是本技术领域内常规方法。如要进一步提高测试的准确性，可以对测试方法进行必要的方 法学验证。
另外，本发明还提供了减少式V化合物在储存中过程转化为式III化合物或/和式 IV化合物的方法，该方法包括：对式V化合物进行抽真空储存或对式V化合物充氮保护储存， 储存温度一般为-40～40℃。
在一个具体实施方案中，一种减少培美曲塞在储存中过程转化为培美曲塞氧化物 A或/和培美曲塞氧化物B的方法，该方法对培美曲塞进行抽真空储存或充氮保护储存，储存 温度一般为-40～40℃，优选-20～30℃。
在一个具体实施方案中，一种减少培美曲塞二钠在储存中过程转化为培美曲塞氧 化物A二钠盐或/和培美曲塞氧化物B二钠盐的方法，该方法包括对培美曲塞二钠进行抽真 空储存或充氮保护储存，储存温度一般为-40～40℃，优选-30～10℃。
上述方法中“抽真空”和“充氮保护”是本技术领域内常规方法，如可在真空充气包 装机内完成抽真空包装，在真空充气包装机内依次进行抽真空，充氮气可完成抽充氮包装。 包装材料内层可采用一层或多层聚乙烯塑料袋，外层可采用一层或多层铝塑复合袋。
上述所有本发明的测定培美曲塞及其盐的杂质的方法，培美曲塞或其二钠盐样品 中的III化合物或其盐或/和式IV化合物或其盐的含量不大于0.5％，更优选的含量为不大 于0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％、0.1％或0.05％，其中，式III化合物或其盐选自培美 曲塞氧化物A、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A、(5S，6S)-培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二 钠盐、(5R，6R)-培美曲塞氧化物A二钠盐，(5S，6S)-培美曲塞氧化物A二钠盐和它们的混合 物；式IV化合物或其盐选自培美曲塞氧化物B、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B、(5S，6R)-培美曲 塞氧化物B、(5R，6S)-培美曲塞氧化物B、(5R，6R)-培美曲塞氧化物B、培美曲塞氧化物B二钠 盐、(5S，6S)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5S，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐、(5R，6S)-培美曲 塞氧化物B二钠盐、(5R，6R)-培美曲塞氧化物B二钠盐和它们的混合物，优选方案，式III化 合物或其盐优选培美曲塞氧化物A、培美曲塞氧化物A二钠盐和它们的混合物；式IV化合物 或其盐优选培美曲塞氧化物B、培美曲塞氧化物B二钠盐和它们的混合物。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步说明，可以使本领域专业技术人员更全面的 理解本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。实施例中使用的术语和缩写具有通常的 含义。如“℃”、“g”、“mg”、“ml”、“1HNMR”、“13CNMR”、“HPLC”分别是指摄氏度、克、毫克、毫 升、质子核磁共振、碳13核磁共振、高效液相色谱。在核磁共振数据中，“s”代表单峰，“d”代 表双峰，“m”代表多重峰。
实施例1
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“培美曲塞氧化物A”)的合成
培美曲塞2g，加入甲醇10ml(测得含水量为0.2％)，通入过氧化氢气体约0.3g，保 持内温0～5℃搅拌反应10小时，即得含有培美曲塞氧化物A甲醇溶液。
HPLC：7.0％
(+)ESI-MS：460.1
实施例2
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸(即式III化合物手性中心A-3为R构型)的合成
N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰 基]-D-谷氨酸(即式V化合物手性中心为R构型)0.5g，加入N，N-二甲基甲酰胺8ml(测得含水 量为0.9％)，通入氧气约0.1g，保持内温25～30℃搅拌反应50小时，即得含有N-[4-[2-[2- 氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰 基]-D-谷氨酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液。
HPLC：0.9％
(+)ESI-MS：460.1
实施例3
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠(简称为“培美曲塞氧化物A二钠盐”)的合成
培美曲塞二钠0.5g，直接通入氧气约0.6g，保持内温70～80℃搅拌反应72小时，即 得含有培美曲塞氧化物A二钠盐的培美曲塞二钠。
HPLC：0.2％
(+)ESI-MS：460.1
按此方法更换不同培美曲塞的盐做反应原料可以制备以下培美曲塞氧化物A的其 它盐：
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“培美曲塞氧化物A二钾盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“培美曲塞氧化物A二锂盐”)
实施例4
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠(即式III化合物手性中心A-3为R构型)的合成
N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰 基]-D-谷氨酸二钠(即式V化合物手性中心为R构型的二钠盐)1g，加入N，N-二甲基甲酰胺 8ml(测得含水量为0.5％)，通入过氧化氢气体约0.1g，保持内温15～20℃搅拌反应48小时， 即得含有N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠的N，N-二甲基甲酰胺溶液。
HPLC：1.3％
(+)ESI-MS：460.1
按此方法更换不同式V化合物手性中心为R构型的盐做反应原料可以制备以下式 III化合物的其它盐：
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠盐
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钾盐
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-5，6-环氧-1-羟基-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶- 5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二锂盐
实施例5
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“培美曲塞氧化物B”)的合成
培美曲塞1.5g，加入N，N-二甲基甲酰胺25ml，30％的过氧化氢水溶液8ml，保持内 温10～15℃搅拌反应32小时。得含有培美曲塞氧化物B的N，N-二甲基甲酰胺溶液。
HPLC：13.2％
(+)ESI-MS：478.1
实施例6
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸(即式IV化合物手性中心B-3为R构型)的合成
N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰 基]-D-谷氨酸(即式V化合物手性中心为R构型)0.8g，加入二甲亚砜15ml，30％的过氧化氢 水溶液5.5ml，保持内温25～30℃搅拌反应72小时，即得含有N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢- 4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸的溶液。
HPLC：35％
(+)ESI-MS：478.1
实施例7
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠(简称为“培美曲塞氧化物B二钠盐”)的合成
取培美曲塞二钠盐0.3g，加入2ml水溶解，加入30％的过氧化氢水溶液2ml，，5～10 ℃搅拌反应48小时，即得含培美曲塞氧化物B二钠盐的水溶液。
HPLC：70.8％
(+)ESI-MS：478.1
按此方法更换不同培美曲塞的盐做反应原料可以制备以下培美曲塞氧化物B的其 它盐：
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钾盐(简称为“培美曲塞氧化物B二钾盐”)
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二锂盐(简称为“培美曲塞氧化物B二锂盐”)
实施例8
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠(即式IV化合物手性中心B-3为R构型的二钠盐)的合成
N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰 基]-D-谷氨酸二钠(即式V化合物手性中心为R构型的二钠盐)3g，加入水15ml，30％的过氧 化氢水溶液18ml，保持内温5～10℃搅拌反应30小时，即得含有N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二 氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基]乙基]苯甲酰基]-D谷氨酸二钠的 水溶液。
HPLC：45.5％
(+)ESI-MS：478.1
按此方法更换不同式V化合物手性中心为R构型的盐做反应原料可以制备以下式 IV化合物的其它盐：
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钠盐
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二钾盐
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-D-谷氨酸二锂盐
实施例9
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸二钠(简称为“培美曲塞氧化物B二钠盐”)的合成
取培美曲塞杂质A二钠盐0.1g，加入10ml水溶液，2～8℃搅拌反应12小时，即得含 培美曲塞杂质B二钠盐HPLC为70％的水溶液。
HPLC：68.5％
(+)ESI-MS：478.1
实施例10
N-[4-[2-[2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1，5，6-三羟基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5- 基]乙基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(简称为“培美曲塞氧化物B”)的分离纯化
培美曲塞二钠固体2g，加入水10ml，30％的过氧化氢水溶液15ml，保持内温0～10 ℃搅拌反应24小时，反应液用高压液相柱色谱进行分离(流动相为水∶乙腈∶甲酸体积比为9 ∶1∶0.001)，收集保留时间为38～40min馏分。所得馏分在-50～-40℃下冷冻干燥48小时，得 培美曲塞氧化物B80mg。
HPLC：96％
(+)ESI-MS：478.1
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：9.18(2H，s)，8.67(1H，s)，8.45(1H，s)，7.79～ 7.81(2H，d)，7.22～7.31(2H，d)，7.39(1H，s)，6.30(1H，s)，3～4(1H，s)，5.16(1H，s)，4.33 ～4.37(1H，m)，2.85(2H，m)，2.30～2.37(2H，m)，2.00～2.12(1H，m)，2.00～2.12(1H，m)， 1.92～1.97(1H，m)。
1HNMR(500MHz，D2O)δ(ppm)：7.74～7.75(2H，d)，7.40～7.45(2H，d)，5.31(1H，s)， 4.35(1H，s)，2.87～3.002.85(2H，m)，2.19～2.30(1H，m)，2.36(2H，m)，2.19～2.30(1H，m)， 2.04～2.04(1H，m)。
13CNMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：178.7，170.2，168，164.1，163.6，145.5/145.3， 128.6，131.2，128.8，127.5，127.5，79.9/79.6，72.9，69.1，64.6，54.5，31.1，30.6，29.8， 28.1，26.7，
实施例11
培美曲塞二钠中杂质培美曲塞氧化物A二钠盐和培美曲塞氧化物B二钠盐的测定 (外标法)
分别取培美曲塞氧化物A二钠盐和氧化物B二钠盐约5mg，精密称定，加流动相溶解 并稀释至10ml，即得每1ml中约含0.5mg的参比溶液。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅 烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm，ACEC18柱)；0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈为流动 相，并采用以下条件进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。精密 量取参比溶液25μl，注入液相色谱仪，分别记录氧化物A和氧化物B的二钠盐峰面积或者峰 高。
取培美曲塞二钠约5mg，精密称定，加流动相溶解并稀释至10ml，即得每1ml中约含 0.5mg的供试溶液。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm× 250mm，5μm，ACEC18柱)；0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈为流动相，并采用以下条件进行梯度 洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。精密量取供试溶液25μl，注入液相 色谱仪，记录供试溶液色谱图中培美曲塞氧化物A和氧化物B的二钠盐的峰面积或峰高。
通过对比参比溶液和供试溶液中培美曲塞氧化物A和氧化物B二钠盐的峰面积或 峰高计算出该供试样品含培美曲塞氧化物A和氧化物B二钠能的量。
培美曲塞氧化物A二钠盐：0.25％
培美曲塞氧化物B二钠盐：0.13％
仪器：Agilent液相色谱仪
色谱柱：ACEC18柱(4.6mm×250mm，5μm)
柱温：25℃
检测波长：254nm
流速：1.5ml/min
进样体积：25μl
流动相：0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈(94∶6)，并采用以下条件进行梯度洗脱
时间(分钟) 0.03mol/L甲酸铵溶液(％) 乙腈(％) 0 94 6 20 --> 3 90 10 6 90 10 8 87.5 12.5 21 87.5 12.5 30 45 55 35 35 65 38 94 6 50 94 6
按此方法可以测试培美曲塞及其盐中培美曲塞氧化物A或B及它们的二锂盐和二 钾盐、镁盐、钙盐、锌盐及二氨盐等的含量。
实施例12
培美曲塞二钠中杂质培美曲塞氧化物A二钠盐和培美曲塞氧化物B二钠盐的测定 (内标法)
分别取培美曲塞氧化物A和B的二钠盐约12.5mg，精密称定，加流动相溶解并稀释 至25ml，摇匀，即得含培美曲塞氧化物A和B的二钠盐的对照品溶液。另取培美曲塞二钠对照 品约12.5mg，精密称定，加流动相溶解并稀释至25ml，摇匀，即得培美曲塞二钠对照品溶液。 分别精密量取培美曲塞氧化物A的对照品溶液和培美曲塞二钠对照品溶液各0.5ml，加流动 相稀释至100ml，摇匀，即得浓度分别为2.5μg/ml的混合对照品溶液1；再分别精密量取培美 曲塞氧化物B的二钠盐和培美曲塞二钠对照品溶液各0.5ml，加流动相稀释至100ml，摇匀， 即得浓度分别为2.5μg/ml的混合对照品溶液2。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm，ACEC18柱)；0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈为流动相， 并采用以下条件进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。分别精 密量取上述1和2混合对照品溶液各25μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。根据浓度和峰面积 或峰高分别计算培美曲塞氧化物A和B的二钠盐的校正因子。
另取培美曲塞二钠供试品约12.5mg，精密称定，加流动相溶解并稀释至25ml，即得 每1ml中约含0.5mg的供试溶液。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂(4.6mm×250mm，5μm，ACEC18柱)；0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈为流动相，并采用以下条 件进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为25℃；流速为1.5ml/min。精密量取供试品溶液 25μl，注入液相色谱仪，记录供试溶液色谱图中培美曲塞氧化物A和氧化物B的二钠盐的峰 面积或峰高。
通过计算出的校正因子和供试溶液中培美曲塞氧化物A和氧化物B二钠盐的峰面 积或峰高计算出该供试样品含培美曲塞氧化物A和氧化物B二钠盐的量。
培美曲塞氧化物A二钠盐：0.42％
培美曲塞氧化物B二钠盐：0.58％
仪器：Agilent液相色谱仪
色谱柱：ACEC18柱(4.6mm×250mm，5μm)
柱温：25℃
检测波长：254nm
流速：1.5ml/min
进样体积：25μl
流动相：0.03mol/L甲酸铵溶液-乙腈(94∶6)，并采用以下条件进行梯度洗脱
时间(分钟) 0.03mol/L甲酸铵溶液(％) 乙腈(％) 0 94 6 3 90 10 6 90 10 8 87.5 12.5 21 87.5 12.5 30 45 55 35 35 65 38 94 6 50 94 6
实施例13
培美曲塞二钠的保存
分别取同一批培美曲塞二钠2g，进行如下包装：
A、内层用聚乙烯塑料袋，外层可用铝塑复合袋包装；
B、内层用真空充气包装机进行抽真空，外层用铝塑复合袋包装；
C、内层用真空充气包装机抽真空，再充氮气，外层用铝塑复合袋包装。
以上三个包装分别在2～8℃冷藏24个月后进行氧化物A和氧化物B二钠盐含量测 定，测定结果如下：
以上HPLC测试条件同实施例11
从上表可知，在B、C条件下保存了，培美曲塞二钠稳定性明显优于A条件下的保存。