烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基序肽Asp f3sup5-9/sup及其扩展短肽.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610366965.1	申请日：	20160530
公开号：	CN105859855A	公开日：	20160817
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C07K14/38,G01N33/68,G01N33/569	主分类号：	C07K14/38,G01N33/68,G01N33/569
申请人：	复旦大学
发明人：	顾少华,霍克克,徐万祥,高岩,石晶,季朝能,谢毅
地址：	200433 上海市杨浦区邯郸路220号
优先权：	CN201610366965A
专利代理机构：	上海正旦专利代理有限公司	代理人：	陆飞;陆尤
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内容摘要

本发明属于生物检测技术领域，具体为烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基序肽及其扩展短肽。本发明的烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基序肽为Asp f 35‑9，最小基序肽的扩展短肽为Asp f 31‑9、Asp f 32‑10、Asp f 33‑11、Asp f 34‑12和Asp f 35‑13，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6所示。它们可作为抗原单独或组合用于特异检测烟曲霉感染患者血清。

权利要求书

1.一种烟曲霉Aspf3蛋白的最小表位基序肽，其特征在于具有SEQ.IDNo.l所示氨基酸序列，记为Aspf3，其一字简写氨基酸序列为KAGDS。 2.一种含如权利要求1所述烟曲霉Aspf3蛋白的最小表位基序肽的扩展短肽，其特征在于：具有SEQ.IDNo.2所示氨基酸序列，记为Aspf3，扩展9肽一字简写氨基酸序列为MSGLKAGDS；或者，具有SEQ.IDNo.3所示氨基酸序列，记为Aspf3，扩展9肽一字简写氨基酸序列为SGLKAGDSF；或者，具有SEQ.IDNo.4所示氨基酸序列，记为Aspf3，扩展9肽一字简写氨基酸序列为GLKAGDSFP；或者，具有SEQ.IDNo.5所示氨基酸序列，记为Aspf3，扩展9肽一字简写氨基酸序列为LKAGDSFPS；或者，具有SEQ.IDNo.6所示氨基酸序列，记为Aspf3，扩展9肽一字简写氨基酸序列为KAGDSFPSD；在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 3.如权利要求1所述的表位最小基序肽在制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物中的应用。 4.如权利要求2所述的表位最小基序肽的扩展短肽单独或组合在制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿发生的烟曲霉主要抗原蛋白Asp f3的线性B细胞表位（B cell epitope, BCE,或称抗原表位或决定簇）及其最小基序肽，以及这些表位基序肽的应用。

背景技术

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌，易感人群吸入其孢子，定植于肺部，从而产生三种曲霉病：导致咯血的曲霉肿、导致肺纤维化的变应性支气管炎和具有较高死亡率的侵袭性曲霉病（Warris A,et al. The biology ofpulmonary aspergillus infections. J Infect, 69 Suppl 1:S36-41,2014）。

血清免疫学指标对于曲霉病的诊断非常重要（Chabi ML,et al. Pulmonaryaspergillosis. Diagn Interv Imaging, 96(5):435-42,2015）。GM（Galactomannan，半乳甘露聚糖）和BG（（1,3）-β-D-glucans，（1,3）-β-D -葡聚糖）是烟曲霉细胞壁的多糖成分，随着孢子的萌发和菌丝体的生长而进入宿主的血循环，因此可分别用GM和BG单抗检测血清中相应的循环抗原，为目前临床上诊断烟曲霉感染的常用方法，但在特异性和灵敏度方面存在一定的局限性（廖万清.侵袭性真菌感染的实验室诊断. 检验医学，25(7)：503-506，2010）。已有的研究表明利用烟曲霉免疫原性强的体外重组蛋白，可以检测感染者血清中相应的循环抗体，但单个重组蛋白同样在特异性和灵敏度方面存在一定的局限性（SarfatiJ,et al. Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. DiagnMicrobil infect Dis, 55(4):279-91,2006）。一个蛋白抗原的长表位肽可能与其它抗原蛋白的抗体起交叉反应，因此鉴定蛋白抗原表位的最小基序可以提高检测的特异性；将多个蛋白抗原表位的最小基序组成嵌合肽可以提高检测的灵敏度。

Asp f3作为变应原之一，功能为过氧化物酶体蛋白，其命名由世界卫生组织和国际免疫学会联合会变应原命名分委员会（ World Health Organization andInternational Union of Immunological Societies (WHO/IUIS) AllergenNomenclature Sub-committee）批准同意（http://www.allergen.org/search.php?TaxSource=Fungi Ascomycota）。人体感染烟曲霉后，免疫系统产生相应的抗Asp f3的IgG、IgE和IgA抗体（Kurup VP, et al. Specific antibodies to recombinant allergens ofAspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ABPA.Clin Mol Allergy,4:11,2006）。鉴定Asp f 3的抗原表位最小基序，将其和烟曲霉其它抗原表位肽的最小表位基序构建检测血清嵌合肽，有助于提高诊断烟曲霉感染的特异性和灵敏度。因此，我们用大肠杆菌表达Asp f3，经镍柱纯化后免疫新西兰白兔，得到Asp f3抗血清。用改良的生物合成肽策略表达相互重叠9个氨基酸残基、覆盖Asp f3全长的18肽融合蛋白，继而用Asp f3抗血清进行免疫印迹，鉴定阳性18肽；对阳性18肽进一步构建相互重叠8个氨基酸残基的9肽融合蛋白，鉴定最小表位基序（Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitopeon human zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. JReprod Immunol, 81: 9-16, 2009）。

发明内容

本发明的目的在于提供烟曲霉Asp f3蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小基序肽的扩展短肽，同时提供含所述基序肽的短肽的应用。

本发明提供的烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基序肽，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，记为Asp f 35-9 ，一字简写的氨基酸序列为：KAGDS。

本发明还提供烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基序肽Asp f 35-9的扩展短肽（9肽），其序列如SEQ. ID No.2-- SEQ. ID No.6所示，其中：

SEQ. ID No.2：X1X2X3X4KAGDS，记为Asp f 31-9。

其中，X1是M，X2是S，X3是G，X4是L，为最小基序Asp f 35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

SEQ. ID No.3：X1X2X3KAGDSX4，记为Asp f 32-10。其中，X1是S，X2是G，X3是L，X4是F，为最小基序Asp f 35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

SEQ. ID No.4：X1X2KAGDSX3X4，记为Asp f 33-11。其中，X1是G，X2是L，X3是F，X4是P，为最小基序Asp f 35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

SEQ. ID No.5：X1KAGDSX2X3X4，记为Asp f 34-12。其中，X1是L，X2是F，X3是P，X4是S，为最小基序Asp f 35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

SEQ. ID No.6：KAGDSX1X2X3X4，记为Asp f 35-13。其中，X1是F，X2是P，X3是S，X4是D，为最小基序Asp f 35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

本发明的内容进一步具体描述如下：

1. 根据烟曲霉Af293菌株的Asp f3（NCBI accession No：XP_747849）的蛋白序列，依据大肠杆菌密码子偏好性，全合成Asp f3编码基因，从EcoR I和Hind Ⅲ酶切位点克隆于pET-21(b+)质粒，构建pET-21(b)-Asp f3重组质粒；将C端带有6×His标签的重组质粒pET-21(b)-Asp f3转入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达得到重组Asp f3蛋白；通过镍柱亲和层析后获得纯化Asp f3蛋白；纯化Asp f3蛋白免疫新西兰白兔，得到高特异性兔抗Asp f3抗血清（图1）；

2. 用pXXGST-1融合表达质粒，构建相互重叠9个氨基酸残基、覆盖Asp f3全长的GST188-18肽融合蛋白（Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitope onhuman zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. J ReprodImmunol, 81: 9-16, 2009）。继而用兔Asp f3抗血清进行免疫印迹，以pXXGST-2表达的GST188为对照，鉴定得到其中的一个阳性18肽：Asp f31-18msglkagdsfpsdvvfsy（图2）。构建相互重叠8个氨基酸残基、覆盖Asp f31-18的GST-9肽融合蛋白，免疫印迹鉴定得到5个阳性9肽：Asp f31-9 msglkagds、Asp f32-10sglkagdsf、Asp f33-11glkagdsfp、Asp f34-12lkagdsfps和Asp f35-13kagdsfpsd，其共有序列Asp f35-9kagds为Asp f3抗原最小表位基序肽（图3）。

本发明所述的表位最小基序肽Asp f 35-9可用于制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物。

本发明所述的表位最小基序肽的扩展短肽Asp f 31-9、Asp f 32-10、Asp f 33-11、Asp f 34-12、Asp f 35-1单独或组合用于制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物。

附图说明

图1 兔抗Asp f3抗血清ELISA结果。1号、2号、3号和4号为Asp f3免疫兔血清，对照为免疫前兔血清。

图2 Asp f3 18肽融合蛋白电泳和免疫印迹图。上方蓝色条带为电泳图谱，下方黑色条带为免疫印迹图谱。0号泳道为pXXGST-2表达的GST188，1至18号泳道为跨域Asp f3全长、相互重叠9个氨基酸残基的18肽与GST188融合蛋白；由于Asp f3全长168aa，故18号泳道为Asp f3153-168。其中1号泳道免疫印迹阳性条带为Asp f31-18。

图3 Asp f35-9最小表位肽基序免疫印迹图。1-1表示Asp f31-9，1-2表示Asp f32-10，1-3表示Asp f33-11，1-4表示Asp f34-12，1-5表示Asp f35-13，1-6表示Asp f36-14，箭头表示免疫印迹反应阳性条带。最小表位基序肽为Asp f35-9kagds。

具体实施方式

本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J. 萨姆布鲁克和D.W. 拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”（科学出版社，2002）和[美]E. 哈洛和D. 莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南” （科学出版社，2002）中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。

材料和方法：

1. pET-21(b+) 质粒和E.coli BL21（DE3）菌株购自德国Novagen公司，热诱导表达质粒pXXGST-1和对照质粒pXXGST-2由本专利发明人构建(专利号：200710173305.2)；

2. 限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sal I购自美国New England Biolabs公司， DL2000DNA分子量标准购于北京康为世纪生物科技有限公司，T4 DNA连接酶和预染蛋白分子量标准购自美国Thermo-Fermentas公司，小鼠6 × His单克隆抗体和弗氏完全佐剂以及弗氏不完全佐剂购于美国Sigma公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，0.2umPVDF膜购自美国Millipore公司，ECL化学发光显色液购自美国GE公司；

3. Gel Extraction凝胶回收试剂盒和Plasmid Mini质粒小量抽提试剂盒购于美国Omega公司；

4. 新西兰白兔购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；

5. Asp f3基因全由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为覆盖Asp f3全长且相互重叠9个氨基酸残基的18肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段以及覆盖免疫印迹反应18肽且相互重叠8个氨基酸残基的9肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海杰李生物技术有限公司合成。DNA重组子测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。

Asp f35-9最小表位肽基序鉴定的具体步骤如下：

1.烟曲霉Asp f3的表达与纯化

1.1 表达载体pET-21(b)-Asp f3的构建

根据烟曲霉Af293菌株的Asp f3（NCBI accession No：XP_747849）的蛋白序列，依据大肠杆菌密码子偏好性，由上海旭冠生物科技发展有限公司全合成基因，分别从EcoR I和Hind Ⅲ酶切位点克隆于pET-21(b+)，构建pET-21(b)-Asp f3重组质粒，Asp f3蛋白的全长为168个氨基酸。

1.2 重组Asp f3表达

将C端带有6×His标签的重组质粒pET-21(b)-Asp f3取1μL（约100ng/μL）转化到10μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，冰上冷却5min，加入900μLLB液体培养基37℃复苏40min～60min，最后10000r/min离心1min弃去约800 μL培养基，其余混匀后涂氨苄青霉素抗性的LB平板。待菌液被培养基吸收后37℃倒置培养16～24h。

挑取单克隆菌落于含50μg/mL氨苄青霉素的3mL LB液体培养基中，37℃培养过夜。翌日，按照1:50的比例将过夜菌转接至新的3mL LB液体培养基中，氨苄青霉素的工作浓度不变，37℃培养约2.5～3h（OD600为0.6~0.8）后，取出1mL菌液样本作为诱导前对照，其余菌液加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，表达条件为37℃培养4h。取500 μL诱导后菌液样本，10000r/min离心5min，收集菌体，用150μL 1×PBS缓冲液溶菌，并加入50 μL 4×SDS-PAGE Loading Buffer混匀，沸水煮样7～10min保存待用。

配制2块相同的12%的SDS-PAGE胶，按照同样的顺序（蛋白分子量marker→诱导前全菌蛋白→诱导后全菌蛋白）和同样的上样量（5 μL）在同一电泳系统内进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳完成后，其中一块胶用于考马斯亮蓝R250染色分析诱导表达条带，另一块用小鼠6 × His单克隆抗体为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western-blot验证。实验结果表明成功表达了重组Asp f3蛋白。

1.3 重组Asp f3蛋白的纯化

选取表达量高的单克隆菌株作为保种菌。取保种菌10μL接入50mL含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜。次日，按照1:50的比例将菌液转入500mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，用1mM IPTG诱导4h，5000r/min 4℃离心5min，弃去培养基收集菌体。菌体称重（事先称好500mL塑料瓶的重量）后，加入菌体重量10陪的1×startbuffer（1g菌体加10mL 1×start buffer ；start buffer: 50mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑，1mM β-巯基乙醇），重悬菌体。用高压细胞破碎机在合适的压力下破菌，重复破菌3次后，4℃、15000rpm离心30分钟，收集上清。5mL His Trap HP预装柱事先用5倍柱体积的纯水冲净，并以5倍柱体积以上的Start Buffer平衡。上样完毕后，以StartBuffer冲洗柱子，去除未吸附的蛋白。以含40 mM 咪唑浓度的Start Buffer冲洗柱子，尽量去除杂蛋白，随后设置15mL 长度，12%-100% Elution Buffer （50mM Na2HPO4/NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0）洗脱，收集目的蛋白。与此同时将pET-21(b)空质粒作为阴性对照与实验重组质粒pET-21(b)-Asp f3做平行实验，并收集两个空质粒的诱导前菌体及IPTG诱导4h后菌体，用于SDS-PAGE电泳。

分别收集全菌液、上清和纯化产物20ul，加入工作浓度为1×SDS Loading BufferLoading混匀，煮沸5min，冷却后取10μL上样，用于变性SDS-PAGE电泳检测。将蛋白条带和预计分子量测吻合，纯度达到80%以上的样品合并，并进行超滤、浓缩处理，用Bradford法估测纯化后蛋白浓度。用像素计算软件估测详细的纯化蛋白的纯度。

2. 兔抗重组蛋白Asp f3抗血清的制备

取1mg Asp f3纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行初次免疫；3周后取0.5mg Asp f3纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行第一次加强免疫；2周后取0.5mg Asp f3纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行第二次加强免疫；第二次加强免疫一周后，在实验兔子的耳缘静脉取血约3～5mL，离心得到抗血清，ELISA法检测抗体效价后备用。

3. Asp f35-9最小表位肽基序鉴定。

3.1 Asp f31-18阳性表位肽鉴定

依据Asp f3基因序列公开信息，设计跨越Asp f3全序列的系列相互重叠9个氨基酸残基的18肽编码DNA正负链片段（正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’），外送DNA合成。将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20 μmol/μL储存液（根据DNA合成报告单数据），各取10 μL储存液和20 ddH2O于1.5 mLEppendorf管中，94℃水浴加热5 min,自然降至室温后，在15 μL反应体积中吸入2 μL退火片段、1 μL 约200 ng/μL经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒、1 μL T4 DNA连接酶和其1.5 μL缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21（DE3）宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3 mL LB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-18肽融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认（与对照蛋白电泳迁移率相差约2 kDa），挑取各重组克隆外送进行DNA测序。将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3 mL LB 培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2 ～ 3 h 至菌体浓度达到0.6 ～0.8 OD后，调高温度至42℃热诱导4 h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min，进行15％SDS-PAGE。用兔抗Asp f3抗血清为一抗，羊抗兔IgG /HRP为二抗，进行免疫印迹。Asp f31-18为阳性表位肽之一。

3.2 Asp f35-9最小表位基序肽鉴定

以pXXGST-1为表达载体，构建表达跨越Asp f31-18、相互重叠8个氨基酸残基的系列9肽GST188融合蛋白，用兔抗Asp f3抗血清为一抗，羊抗兔IgG /HRP为二抗，进行免疫印迹，Aspf31-9 msglkagds、Asp f32-10sglkagdsf、Asp f33-11glkagdsfp、Asp f34-12lkagdsf ps和Aspf35-13kagdsfpsd为阳性表位肽，其共有序列Asp f35-9kagds为Asp f3抗原最小表位基序肽。

应用例1

应用Asp f31-9、Asp f32-10、Asp f33-11、Asp f34-12和Asp f35-13检测血清中Asp f3抗体

1. 用Asp f3蛋白免疫新西兰白兔后取血清，以免疫前血清为对照，4只实验兔的Aspf3抗体滴度均达到1.28×105以上（图1），其中4号兔滴度最高，用于后续免疫印迹反应；

2. 以pXXGST-1为载体，表达Asp f31-9、Asp f32-10、Asp f33-11、Asp f34-12、Asp f35-13和Asp f36-14融合蛋白；

3. 表达的Asp f31-9、Asp f32-10、Asp f33-11、Asp f34-12、Asp f35-13和Asp f36-14融合蛋白进行15% SDS-PAGE电泳；

4. 将电泳凝胶蛋白条带电转移至PVDF膜，印迹膜用封闭液（TBSTM）封闭后，用封闭缓冲液（TBST）洗膜，然后以一定比例稀释的实验兔血清为一抗，4℃振荡孵育过夜；

5. 次日，用TBST洗膜后将印迹膜置于TBSTM中，加入一定比例稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，室温震荡孵育1.5h。用TBST洗膜3遍后将膜置于TBS缓冲液中，加入ECL化学发光剂，约1min后进行曝光，判断检测结果。包含最小表位基序肽Asp f35-9kagds的Asp f31-9、Asp f32-10、Asp f33-11、Asp f34-12和Asp f35-13印迹反应为阳性；而Asp f36-14agdsfpsdV由于缺少包含于最小表位基序肽Asp f35-9中的第5位残基k，印迹反应为阴性（图3）。

尽管本发明描述了Asp f3蛋白抗原表位最小基序Asp f35-9kagds，以及可单独和/或组合用含最小基序的9肽或9肽融合蛋白研制用作检测人烟曲霉感染的抗原肽（或化学合成或融合表达），但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序9肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基序肽Asp f35-9及其扩展短肽

<130> 001

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 5

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Ser Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ser Phe

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Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ser Phe Pro

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<212> PRT

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Leu Lys Ala Gly Asp Ser Phe Pro Ser

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Lys Ala Gly Asp Ser Phe Pro Ser Asp

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610366965.1 (22)申请日 2016.05.30 (71)申请人复旦大学地址 200433 上海市杨浦区邯郸路220号 (72)发明人顾少华霍克克徐万祥高岩石晶季朝能谢毅 (74)专利代理机构上海正旦专利代理有限公司 31200 代理人陆飞陆尤 (51)Int.Cl. C07K 14/38(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/569(2006.01) (54)发明名称烟曲霉Asp f3蛋白的线性抗原表位最小基。

2、序肽Asp f35-9及其扩展短肽 (57)摘要本发明属于生物检测技术领域，具体为烟曲霉Aspf3蛋白的线性抗原表位最小基序肽及其扩展短肽。本发明的烟曲霉Aspf3蛋白的线性抗原表位最小基序肽为Aspf35-9，最小基序肽的扩展短肽为Aspf31-9、 Aspf32-10、 Aspf 33-11、 Aspf34-12和Aspf35-13，其氨基酸序列如 SEQIDNo.1SEQIDNo.6所示。它们可作为抗原单独或组合用于特异检测烟曲霉感染患者血清。权利要求书1页说明书6页序列表2页附图2页 CN 105859855 A 2016.08.17 CN 105859。

3、855 A 1.一种烟曲霉Aspf3蛋白的最小表位基序肽，其特征在于具有SEQ.IDNo.l所示氨基酸序列，记为Aspf35-9，其一字简写氨基酸序列为KAGDS。 2.一种含如权利要求1所述烟曲霉Aspf3蛋白的最小表位基序肽的扩展短肽，其特征在于：具有SEQ.IDNo.2所示氨基酸序列，记为Aspf31-9，扩展9肽一字简写氨基酸序列为 MSGLKAGDS；或者，具有SEQ.IDNo.3所示氨基酸序列，记为Aspf32-10，扩展9肽一字简写氨基酸序列为 SGLKAGDSF；或者，具有SEQ.IDNo.4所示氨基酸序列，记为Aspf33-11，扩展9肽一字。

4、简写氨基酸序列为 GLKAGDSFP；或者，具有SEQ.IDNo.5所示氨基酸序列，记为Aspf34-12，扩展9肽一字简写氨基酸序列为 LKAGDSFPS；或者，具有SEQ.IDNo.6所示氨基酸序列，记为Aspf35-13，扩展9肽一字简写氨基酸序列为 KAGDSFPSD；在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 3.如权利要求1所述的表位最小基序肽在制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物中的应用。 4.如权利要求2所述的表位最小基序肽的扩展短肽单独或组合在制备作为临床诊断由烟。

5、曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 105859855 A 2 烟曲霉Aspf3蛋白的线性抗原表位最小基序肽Aspf35-9及其扩展短肽技术领域 0001 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿发生的烟曲霉主要抗原蛋白Aspf3的线性B细胞表位（Bcellepitope,BCE,或称抗原表位或决定簇）及其最小基序肽，以及这些表位基序肽的应用。背景技术 0002 烟曲霉（Aspergillusfumigatus）是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌，易感。

6、人群吸入其孢子，定植于肺部，从而产生三种曲霉病：导致咯血的曲霉肿、导致肺纤维化的变应性支气管炎和具有较高死亡率的侵袭性曲霉病（WarrisA,etal.Thebiologyof pulmonaryaspergillusinfections.JInfect,69Suppl1:S36-41,2014）。 0003 血清免疫学指标对于曲霉病的诊断非常重要（ChabiML,etal.Pulmonary aspergillosis.DiagnIntervImaging,96(5):435-42,2015）。 GM （Galactomannan，半乳甘露聚糖）和BG （（1,3）。

7、 - -D-glucans，（1,3） - -D-葡聚糖）是烟曲霉细胞壁的多糖成分，随着孢子的萌发和菌丝体的生长而进入宿主的血循环，因此可分别用GM和BG单抗检测血清中相应的循环抗原，为目前临床上诊断烟曲霉感染的常用方法，但在特异性和灵敏度方面存在一定的局限性（廖万清.侵袭性真菌感染的实验室诊断.检验医学， 25(7)： 503-506， 2010）。已有的研究表明利用烟曲霉免疫原性强的体外重组蛋白，可以检测感染者血清中相应的循环抗体，但单个重组蛋白同样在特异性和灵敏度方面存在一定的局限性（Sarfati J,etal.Recombinantantigensasd。

8、iagnosticmarkersforaspergillosis.Diagn MicrobilinfectDis,55(4):279-91,2006）。一个蛋白抗原的长表位肽可能与其它抗原蛋白的抗体起交叉反应，因此鉴定蛋白抗原表位的最小基序可以提高检测的特异性；将多个蛋白抗原表位的最小基序组成嵌合肽可以提高检测的灵敏度。 0004 Aspf3作为变应原之一，功能为过氧化物酶体蛋白，其命名由世界卫生组织和国际免疫学会联合会变应原命名分委员会（WorldHealthOrganizationand InternationalUnionofImmunologicalSocietie。

9、s(WHO/IUIS)Allergen NomenclatureSub-committee）批准同意（http:/www.allergen.org/search.php? TaxSource=FungiAscomycota）。人体感染烟曲霉后，免疫系统产生相应的抗Aspf3的IgG、 IgE和IgA抗体（KurupVP,etal.Specificantibodiestorecombinantallergensof AspergillusfumigatusincysticfibrosispatientswithABPA.ClinMolAllergy, 4:11,2006）。鉴定A。

10、spf3的抗原表位最小基序，将其和烟曲霉其它抗原表位肽的最小表位基序构建检测血清嵌合肽，有助于提高诊断烟曲霉感染的特异性和灵敏度。因此，我们用大肠杆菌表达Aspf3，经镍柱纯化后免疫新西兰白兔，得到Aspf3抗血清。用改良的生物合成肽策略表达相互重叠9个氨基酸残基、覆盖Aspf3全长的18肽融合蛋白，继而用Aspf3抗血清进行免疫印迹，鉴定阳性18肽；对阳性18肽进一步构建相互重叠8个氨基酸残基的9肽融合蛋白，鉴定最小表位基序（Xu,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitope 说明书 1/6 页 3 CN 10585985。

11、5 A 3 onhumanzonapellucidaprotein-4usingpeptidebiosynthesisstrategy.J ReprodImmunol,81:9-16,2009）。发明内容 0005 本发明的目的在于提供烟曲霉Aspf3蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小基序肽的扩展短肽，同时提供含所述基序肽的短肽的应用。 0006 本发明提供的烟曲霉Aspf3蛋白的线性抗原表位最小基序肽，其氨基酸序列为 SEQIDNo.1所示，记为Aspf35-9，一字简写的氨基酸序列为： KAGDS。 0007 本发明还提供烟曲霉Aspf3蛋白的线性抗原表位最小基序。

12、肽Aspf35-9的扩展短肽（9肽），其序列如SEQ.IDNo.2-SEQ.IDNo.6所示，其中： SEQ.IDNo.2： X1X2X3X4KAGDS，记为Aspf31-9。 0008 其中， X1是M， X2是S， X3是G， X4是L，为最小基序Aspf35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 0009 SEQ.IDNo.3： X1X2X3KAGDSX4，记为Aspf32-10。其中， X1是S， X2是G， X3是L， X4是F，为最小基序Aspf35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合。

13、，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 0010 SEQ.IDNo.4： X1X2KAGDSX3X4，记为Aspf33-11。其中， X1是G， X2是L， X3是F， X4是P，为最小基序Aspf35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 0011 SEQ.IDNo.5： X1KAGDSX2X3X4，记为Aspf34-12。其中， X1是L， X2是F， X3是P， X4是S，为最小基序Aspf35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 0012 SEQ.。

14、IDNo.6： KAGDSX1X2X3X4，记为Aspf35-13。其中， X1是F， X2是P， X3是S， X4是D，为最小基序Aspf35-9扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。 0013 本发明的内容进一步具体描述如下： 1.根据烟曲霉Af293菌株的Aspf3 （NCBIaccessionNo： XP_747849）的蛋白序列，依据大肠杆菌密码子偏好性，全合成Aspf3编码基因，从EcoRI和Hind酶切位点克隆于 pET-21(b+)质粒，构建pET-21(b)-Aspf3重组质粒；将C端带有6His标签。

15、的重组质粒pET- 21(b)-Aspf3转入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达得到重组Aspf3蛋白；通过镍柱亲和层析后获得纯化Aspf3蛋白；纯化Aspf3蛋白免疫新西兰白兔，得到高特异性兔抗Aspf3抗血清（图1）； 2.用pXXGST-1融合表达质粒，构建相互重叠9个氨基酸残基、覆盖Aspf3全长的 GST188-18肽融合蛋白（Xu,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeon humanzonapellucidaprotein-4usingpeptidebiosynthesisstrategy.JReprod Immun。

16、ol,81:9-16,2009）。继而用兔Aspf3抗血清进行免疫印迹，以pXXGST-2表达的 GST188为对照，鉴定得到其中的一个阳性18肽： Aspf31-18msglkagdsfpsdvvfsy （图2）。构建相互重叠8个氨基酸残基、覆盖Aspf31-18的GST-9肽融合蛋白，免疫印迹鉴定得到5个阳性9 肽： Aspf31-9msglkagds、 Aspf32-10sglkagdsf、 Aspf33-11glkagdsfp、 Aspf34-12lkagdsf 说明书 2/6 页 4 CN 105859855 A 4 ps和Aspf35-13kagdsfpsd，其。

17、共有序列Aspf35-9kagds为Aspf3抗原最小表位基序肽（图 3）。 0014 本发明所述的表位最小基序肽Aspf35-9可用于制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物。 0015 本发明所述的表位最小基序肽的扩展短肽Aspf31-9、 Aspf32-10、 Aspf33-11、 Aspf34-12、 Aspf35-1单独或组合用于制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物。附图说明 0016 图1兔抗Aspf3抗血清ELISA结果。 1号、 2号、 3号和4号为Aspf3免疫兔血清。

18、，对照为免疫前兔血清。 0017 图2Aspf318肽融合蛋白电泳和免疫印迹图。上方蓝色条带为电泳图谱，下方黑色条带为免疫印迹图谱。 0号泳道为pXXGST-2表达的GST188， 1至18号泳道为跨域Aspf3全长、相互重叠9个氨基酸残基的18肽与GST188融合蛋白；由于Aspf3全长168aa，故18号泳道为Aspf3153-168。其中1号泳道免疫印迹阳性条带为Aspf31-18。 0018 图3Aspf35-9最小表位肽基序免疫印迹图。 1-1表示Aspf31-9， 1-2表示Aspf32 -10， 1-3表示Aspf33-11， 1-4表示Aspf34-12，。

19、 1-5表示Aspf35-13， 1-6表示Aspf36-14，箭头表示免疫印迹反应阳性条带。最小表位基序肽为Aspf35-9kagds。具体实施方式 0019 本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及美J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版 “分子克隆：实验室手册”（科学出版社， 2002）和美E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的 “抗体技术实验指南” （科学出版社， 2002）中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。

20、。 0020 材料和方法： 1.pET-21(b+)质粒和E.coliBL21 （DE3）菌株购自德国Novagen公司，热诱导表达质粒pXXGST-1和对照质粒pXXGST-2由本专利发明人构建(专利号： 200710173305.2)； 2.限制性内切酶EcoRI、 BamHI、 SalI购自美国NewEnglandBiolabs公司， DL2000 DNA分子量标准购于北京康为世纪生物科技有限公司， T4DNA连接酶和预染蛋白分子量标准购自美国Thermo-Fermentas公司，小鼠6His单克隆抗体和弗氏完全佐剂以及弗氏不完全佐剂购于美国Sigma公司，辣根过氧化物酶。

21、（HRP）标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自美国SantaCruzBiotechnology公司， 0.2umPVDF膜购自美国 Millipore公司， ECL化学发光显色液购自美国GE公司； 3.GelExtraction凝胶回收试剂盒和PlasmidMini质粒小量抽提试剂盒购于美国 Omega公司； 4.新西兰白兔购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司； 5.Aspf3基因全由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。两端分别为BamHI和SalI 粘性末端，中间为覆盖Aspf3全长且相互重叠9个氨基酸残基的18肽编码DNA序列加TAA终说明书 3/6。

22、页 5 CN 105859855 A 5 止密码子的正负链DNA片段以及覆盖免疫印迹反应18肽且相互重叠8个氨基酸残基的9肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海杰李生物技术有限公司合成。 DNA重组子测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。 0021 Aspf35-9最小表位肽基序鉴定的具体步骤如下： 1.烟曲霉Aspf3的表达与纯化 1.1表达载体pET-21(b)-Aspf3的构建根据烟曲霉Af293菌株的Aspf3 （NCBIaccessionNo： XP_747849）的蛋白序列，依据大肠杆菌密码子偏好性，由上海旭冠生物科技发展有限公司全合成基因，分别。

23、从EcoRI和 Hind酶切位点克隆于pET-21(b+)，构建pET-21(b)-Aspf3重组质粒， Aspf3蛋白的全长为168个氨基酸。 0022 1.2重组Aspf3表达将C端带有6His标签的重组质粒pET-21(b)-Aspf3取1 L （约100ng/ L）转化到10 L 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42热激90s，冰上冷却5min，加入900 L LB液体培养基37复苏40min60min，最后10000r/min离心1min弃去约800 L培养基，其余混匀后涂氨苄青霉素抗性的LB平板。待菌液被培养基吸收后37倒置培养1624。

24、h。 0023 挑取单克隆菌落于含50 g/mL氨苄青霉素的3mLLB液体培养基中， 37培养过夜。翌日，按照1:50的比例将过夜菌转接至新的3mLLB液体培养基中，氨苄青霉素的工作浓度不变， 37培养约2.53h （OD600为0.60.8）后，取出1mL菌液样本作为诱导前对照，其余菌液加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，表达条件为37培养4h。取500 L诱导后菌液样本， 10000r/min离心5min，收集菌体，用150 L1PBS缓冲液溶菌，并加入50 L4SDS-PAGELoadingBuffer混匀，沸水煮样71。

25、0min保存待用。 0024 配制2块相同的12%的SDS-PAGE胶，按照同样的顺序（蛋白分子量marker诱导前全菌蛋白诱导后全菌蛋白）和同样的上样量（5 L）在同一电泳系统内进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳完成后，其中一块胶用于考马斯亮蓝R250染色分析诱导表达条带，另一块用小鼠 6His单克隆抗体为一抗、 HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western-blot验证。实验结果表明成功表达了重组Aspf3蛋白。 0025 1.3重组Aspf3蛋白的纯化选取表达量高的单克隆菌株作为保种菌。取保种菌10 L接入50mL含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养。

26、基中37培养过夜。次日，按照1:50的比例将菌液转入500mL含50 g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，用1mMIPTG诱导4h， 5000r/min4离心5min，弃去培养基收集菌体。菌体称重（事先称好500mL塑料瓶的重量）后，加入菌体重量10陪的1start buffer （1g菌体加10mL1startbuffer； startbuffer:50mMNa2HPO4/NaH2PO4， pH8.0， 300mMNaCl， 10mM咪唑， 1mM -巯基乙醇），重悬菌体。用高压细胞破碎机在合适的压力下破菌，重复破菌3次后， 4、 15000rpm离心30分钟。

27、，收集上清。 5mLHisTrapHP预装柱事先用5 倍柱体积的纯水冲净，并以5倍柱体积以上的StartBuffer平衡。上样完毕后，以Start Buffer冲洗柱子，去除未吸附的蛋白。以含40mM咪唑浓度的StartBuffer冲洗柱子，尽量去除杂蛋白，随后设置15mL长度， 12%-100%ElutionBuffer （50mMNa2HPO4/NaH2PO4， 300mMNaCl， 250mM咪唑， pH8.0）洗脱，收集目的蛋白。与此同时将pET-21(b)空质粒作为阴性对照与实验重组质粒pET-21(b)-Aspf3做平行实验，并收集两个空质粒的诱导前菌体。

28、及说明书 4/6 页 6 CN 105859855 A 6 IPTG诱导4h后菌体，用于SDS-PAGE电泳。 0026 分别收集全菌液、上清和纯化产物20ul，加入工作浓度为1SDSLoadingBuffer Loading混匀，煮沸5min，冷却后取10 L上样，用于变性SDS-PAGE电泳检测。将蛋白条带和预计分子量测吻合，纯度达到80%以上的样品合并，并进行超滤、浓缩处理，用Bradford法估测纯化后蛋白浓度。用像素计算软件估测详细的纯化蛋白的纯度。 0027 2.兔抗重组蛋白Aspf3抗血清的制备取1mgAspf3纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后皮。

29、下注射新西兰白兔，进行初次免疫； 3周后取0.5mgAspf3纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行第一次加强免疫； 2周后取0.5mgAspf3纯化蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行第二次加强免疫；第二次加强免疫一周后，在实验兔子的耳缘静脉取血约35mL，离心得到抗血清， ELISA法检测抗体效价后备用。 0028 3.Aspf35-9最小表位肽基序鉴定。 0029 3.1Aspf31-18阳性表位肽鉴定依据Aspf3基因序列公开信息，设计跨越Aspf3全序列的系列相互重叠9个氨基酸残基的18肽编码DNA正负链片段（正链。

30、5 -端加5 -gatcc,3 -端加taag-3 ；负链5 -端加5 - tcgactta， 3 -端加g-3 ），外送DNA合成。将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20 mol/L储存液（根据DNA合成报告单数据），各取10L储存液和20ddH2O于1 .5mL Eppendorf管中， 94水浴加热5min,自然降至室温后，在15 L反应体积中吸入2 L退火片段、 1 L约200ng/ L经BamHI和SalI双酶切的pXXGST-1质粒、 1 LT4DNA连接酶和其1.5 L缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21 （DE3）宿主菌，涂布含A。

31、mp的LB平板上，于37培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3mLLB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-18肽融合蛋白经15SDS-PAGE分析确认（与对照蛋白电泳迁移率相差约2kDa），挑取各重组克隆外送进行DNA测序。将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3mLLB培养液中，于30振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中， 30振荡培养23h至菌体浓度达到0.6 0.8OD后，调高温度至42热诱导4h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5min，进行15 SDS。

32、-PAGE。用兔抗Aspf3抗血清为一抗，羊抗兔IgG/HRP为二抗，进行免疫印迹。 Aspf31-18 为阳性表位肽之一。 0030 3.2Aspf35-9最小表位基序肽鉴定以pXXGST-1为表达载体，构建表达跨越Aspf31-18、相互重叠8个氨基酸残基的系列9肽 GST188融合蛋白，用兔抗Aspf3抗血清为一抗，羊抗兔IgG/HRP为二抗，进行免疫印迹， Asp f31-9msglkagds、 Aspf32-10sglkagdsf、 Aspf33-11glkagdsfp、 Aspf34-12lkagdsfps和Asp f35-13kagdsfpsd为阳性表位肽，其。

33、共有序列Aspf35-9kagds为Aspf3抗原最小表位基序肽。 0031 应用例1 应用Aspf31-9、 Aspf32-10、 Aspf33-11、 Aspf34-12和Aspf35-13检测血清中Aspf3抗体 1.用Aspf3蛋白免疫新西兰白兔后取血清，以免疫前血清为对照， 4只实验兔的Asp f3抗体滴度均达到1.28105以上（图1），其中4号兔滴度最高，用于后续免疫印迹反应； 2.以pXXGST-1为载体，表达Aspf31-9、 Aspf32-10、 Aspf33-11、 Aspf34-12、 Aspf35-13和 Aspf36-14融合蛋白；说明书 5/6 页。

34、7 CN 105859855 A 7 3.表达的Aspf31-9、 Aspf32-10、 Aspf33-11、 Aspf34-12、 Aspf35-13和Aspf36-14融合蛋白进行15%SDS-PAGE电泳； 4.将电泳凝胶蛋白条带电转移至PVDF膜，印迹膜用封闭液（TBSTM）封闭后，用封闭缓冲液（TBST）洗膜，然后以一定比例稀释的实验兔血清为一抗， 4振荡孵育过夜； 5.次日，用TBST洗膜后将印迹膜置于TBSTM中，加入一定比例稀释的HRP标记的羊抗兔 IgG为二抗，室温震荡孵育1.5h。用TBST洗膜3遍后将膜置于TBS缓冲液中，加入ECL化学发光剂。

35、，约1min后进行曝光，判断检测结果。包含最小表位基序肽Aspf35-9kagds的Aspf31-9、 Aspf32-10、 Aspf33-11、 Aspf34-12和Aspf35-13印迹反应为阳性；而Aspf36-14agdsfpsdV由于缺少包含于最小表位基序肽Aspf35-9中的第5位残基k，印迹反应为阴性（图3）。 0032 尽管本发明描述了Aspf3蛋白抗原表位最小基序Aspf35-9kagds，以及可单独和/ 或组合用含最小基序的9肽或9肽融合蛋白研制用作检测人烟曲霉感染的抗原肽（或化学合成或融合表达），但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，。

36、即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序9肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。说明书 6/6 页 8 CN 105859855 A 8 SEQUENCELISTING 复旦大学烟曲霉Aspf3蛋白的线性抗原表位最小基序肽Aspf35-9及其扩展短肽 001 6 PatentInversion3.3 1 5 PRT 1 LysAlaGlyAspSer 15 2 9 PRT 2 MetSerGlyLeuLysAlaGlyAspSer 15 3 9 PRT 3 SerGlyLeuLysAlaGlyAspSerPhe 15 4 9 PRT 4 GlyLeuLysAlaGlyAspSerPhePro 15 序列表 1/2 页 9 CN 105859855 A 9 5 9 PRT 5 LeuLysAlaGlyAspSerPheProSer 15 6 9 PRT 6 LysAlaGlyAspSerPheProSerAsp 15 序列表 2/2 页 10 CN 105859855 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 105859855 A 11 图3 说明书附图 2/2 页 12 CN 105859855 A 12 。

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