一菌双酶生产光学纯L丙氨酸的方法.pdf

本发明公开了一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法，包括摇瓶种子培养和发酵，利用一种假单胞菌产生两种酶：L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以富马酸铵盐为底物，直接生成L-丙氨酸，通过改变体系反应条件，加入L-丙氨酸消旋酶抑制剂，得到光学纯度的L-丙氨酸。本发明减少整个L-天冬氨酸生产环节及设备投资，减轻环境污染；L-丙氨酸收率高，光学纯度≥99.99％，满足特殊要求厂家对高光学纯度L-丙氨酸的需求。

1、  一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法，包括摇瓶种子培养和发酵，其特征在于：
a、利用一种假单胞菌产生两种酶：L-天冬氨酸酶、L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以富马酸铵盐为底物，加入L-丙氨酸消旋酶抑制剂，得到光学纯度的L-丙氨酸；
b、种子培养基和培养条件(质量百分比)：富马酸0.8～1.2％，蛋白胨0.8～1.2％，菌玉米浆0.6～0.8％，硫酸镁0.01～0.03％，磷酸二氢钾0.01～0.02％，余量为纯净水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度29±2℃；
c、发酵培养基(质量百分比)：谷氨酸钠1.0～2.0％，蛋白胨1.0～1.2％，玉米浆0.6～0.8％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.01～0.03％，余量为纯净水，用氨水调pH值至6.0～8.0；
发酵培养条件：培养温度29±2℃，通风比1∶2，罐压0.05MPa。

一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法
技术领域
本发明涉及L-丙氨酸的生产方法，具体涉及一种用酶法生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
近年来，手性药物的研究方兴未艾，国内有多家生产手性药物的公司。不同的手性药物，表现在药效、副作用上有很大的差异。L-丙氨酸是一种广为使用的药物手性源，比如生产L-氨基丙醇、VB₆、S-2-氯乙酸、安尿通等。
国内外企业在使用L-丙氨酸的过程中，对其光学纯度要求越来越高。低光学纯度的L-丙氨酸合成药物，在使用时发现疗效低、副作用大。因此，研究一种高光学纯度的L-丙氨酸生产工艺势在必行。
国内现有宁波科瑞生物工程公司、北京怡康盛达生物技术有限公司、安徽省科苑(集团)股份有限公司等多家公司均生产L-丙氨酸产品，产品有食品级和工业级，生产的方法大都是利用假单胞菌产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，将L-天冬氨酸转化成L-丙氨酸。南京工业大学(南京化工大学)开展L-丙氨酸酶法合成的研究较早，利用假单胞菌获得高活性的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸为底物，采用游离细胞法转化生产L-丙氨酸，平均收率为90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准；并拥有酶法生产L-丙氨酸的发明专利，该技术可生产得到光学纯度的L-丙氨酸；同时成立了国家生化工程技术中心，中心拥有年产1000吨L-丙氨酸的生产技术。大连轻工业学院对中空纤维膜反应器，利用假单胞菌转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。中国药科大学也对L-丙氨酸酶法生产技术进行了研究，采用循环式生物反应器，利用固定化德阿昆合假单胞菌体的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。
已有的文献及专利有如下报道：
1、L-丙氨酸酶法工业生产的研究
在800升气升式发酵罐上配有假单胞菌Pse.NX-1，获得高L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活。以L-天冬氨酸为底物游离细胞法转化生产L-丙氨酸，每升培养液可转化L-天冬氨酸2kg，最高达2.5kg，提取得到L-丙氨酸1.2kg，平均收率90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准。(《工业微生物》1997，27(2)，17-20页)；
2、利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸
通过右边筛选得到一株具有高活性L-Asp-β-脱羧酶的菌株PseudomonasNX-1，对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细的研究，该株可以高效地转化L-Asp生成L-Ala，转化4-5d，每L培养液可转化L-Asp量高达1400g左右，生成L-Ala浓度高达90％以上，摩尔转化率近100％。(《南京化工学院学报》1995，17(1)，1-6页)；
3、游离细胞法与固定化细胞法生产L-丙氨酸的比较
利用假单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶从L-天冬氨酸为底物生产L-丙氨酸，具有2种方法，一种为游离细胞法，另一种为固定化细胞法。该文比较这2种方法的生产工艺、转化率、提取收率和生产成本后得出结论：采用游离细胞法生产L-丙氨酸优于固定化细胞法。(《工业微生物》1998，28(1)，38-39，44页)；4、D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备方法(《中国专利》申请(专利)号：02138553.X；公开(公告)号：CN1405317；公开(公告)日：2003.03.26)
该制备方法是培养假单胞菌属微生物，产生高活力的L-天冬氨酸β-脱羧酶，采用游离细胞法，将含酶细胞或培养液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸盐的溶液混合，32℃-45℃下进行酶反应，然后用等电点结晶结合离子交换树脂法分离反应生成物，得到高化学纯度和光学纯度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
5、中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸
采用中空纤维膜反应器，利用假单胞菌P.dacunhaeDQ-pl转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，最适pH6.0，最适温度30℃，EDTA和Tween-80对细胞产酶有促进作用，游离细胞半衰期为93h。采用对流扩散式中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。(《食品与发酵工业》2003，29(1)，32-35页)；
6、用循环式生物反应器酶法生产L-丙氨酸
用固定化德阿昆合假单胞(Pseudomonas dacunhae)菌体的L-天冬氨酸β-脱羧酶，在新设计的生物反应器中转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。该反应器能不断缓慢溶解固体L-天冬氨酸，使反应系统的pH和底物浓度维持恒定。用80g固定化菌体为酶源，在69h内能将4.2kgL-天冬氨酸全部转化生成L-丙氨酸，且仅消耗较少的PLP和氨水。(《药物生物技术》1997，4(4)，212-215页)。
由上可知，现有的酶法生产L-丙氨酸的研究及生产报道，一般是利用假单胞菌产生L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，此法生产的产品光学纯度较低，一般≤95％，且生产环节多，成本高。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法，采用该方法生产的L-丙氨酸，其光学纯度及收率高、生产环节简化，成本低。
本发明为实现其目的所采取的技术方案包括摇瓶种子培养和发酵。本发明利用一种假单胞菌产生两种酶：L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以富马酸铵盐为底物，直接生成L-丙氨酸，通过改变体系反应条件，加入L-丙氨酸消旋酶抑制剂，得到光学纯度的L-丙氨酸。
L-天冬氨酸酶

底物：富马酸铵盐    产物：L-丙氨酸
种子培养基和培养条件(质量百分比，以下同)：富马酸0.8～1.2％，蛋白胨0.8～1.2％，菌玉米浆0.6～0.8％，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.01～0.03％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.01～0.02％，余量为纯净水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度29±2℃；
发酵培养基：谷氨酸钠1.0～2.0％，蛋白胨1.0～1.2％，玉米浆0.6～0.8％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.01～0.03％，余量为纯净水，用氨水调pH值至6.0～8.0；
发酵培养条件：培养温度29±2℃，通风比1∶2，罐压0.05MPa。
具体技术参数：
①种子培养基和培养条件：富马酸1.0％，蛋白胨1.0％，玉米浆0.8％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。在1000ml三角瓶中分装250ML培养基，接种后用摇床在29±2℃条件下培养24小时。
②发酵培养基：谷氨酸钠2.0％，蛋白胨1.0％，玉米浆0.8％，硫酸镁0.02％，0.01％磷酸二氢钾，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。
③发酵培养条件：定容后，121℃灭菌15分钟，冷却后将培养好的种子液按1％接种量接种培养，培养温度29±2℃，通风比1∶2，罐压0.05MPa，培养过程测定菌体生长OD值、pH值和酶活力。
④转化条件：
转化温度50℃，转化pH值6.5。
⑤离心条件：
转化温度50℃，转化pH值6.5。
⑥提取条件：
脱色温度70℃。
⑦干燥条件：
干燥温度90℃，干燥时间15分钟。
本发明的有益效果：L-丙氨酸是一种具有光学活性的氨基酸，主要用于生产L-氨基丙醇、(S)-2-二氯乙酸。本发明减少整个L-天冬氨酸生产环节及设备投资，减轻环境污染；L-丙氨酸收率高，光学纯度≥99.99％，满足特殊要求厂家对高光学纯度L-丙氨酸的需求。
具体实施方式
本发明先进行无菌培养得到一级种子，再到发酵罐进行扩大培养产酶，在反应罐进行转化，然后离心、脱色、过滤、浓缩、结晶、离心、干燥，产品化验合格后入库。
实施例1
配种子液1000ml，种子液配比(质量百分比，以下同)：富马酸1.0％，蛋白胨1.0％，玉米浆0.8％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。分装在5只1000ml三角瓶灭菌后，30℃接种斜面，摇床培养15h，摇床转速为90r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为谷氨酸钠2.0％，蛋白胨1.0％，玉米浆0.8％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.01％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件：培养温度29±2℃，通风比1∶2，罐压0.05MPa，培养26h。取发酵液配制500L转化液，加入富马酸铵盐25g，转化温度50℃，转化PH值6.5。70℃脱色，90℃干燥。得到产品21.24kg，产品光学纯度≥99.95％.
实施例2
配种子液2000ml，种子液配比为富马酸1.2％，蛋白胨1.1％，玉米浆0.9％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。分装在10只1000ml三角瓶灭菌后，30℃接种斜面，摇床培养18h，摇床转速为100r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为谷氨酸钠2.2％，蛋白胨1.1％，玉米浆0.9％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.02％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件：培养温度29±2℃，通风比1∶2，罐压0.05MPa，培养28h。取发酵液配制500L转化液，加入富马酸铵盐25g，转化温度55℃，转化PH值6.8。80℃脱色，100℃干燥。得到产品20.22kg，产品光学纯度≥99.95％.
实施例3
配种子液800ml，种子液配比为富马酸0.8％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.6％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.01％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。分装在4只1000ml三角瓶灭菌后，30℃接种斜面，摇床培养14h，摇床转速为110r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为谷氨酸钠1.8％，蛋白胨0.9％，玉米浆0.6％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.01％，余量为纯净水，用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件：培养温度29±2℃，通风比1∶3，罐压0.05MPa，培养20h。取发酵液配制500L转化液，加入富马酸铵盐25g，转化温度45℃，转化PH值6.0。60℃脱色，80℃干燥。得到产品20.01kg，产品光学纯度≥99.95％.
本发明的优点如下：
(1)利用一种微生物(假单胞杆菌)产生两种酶，即L-天冬氨酸酶和L-天门冬氨酸-β-脱羧酶，利用全细胞作为催化剂生产光学纯L-丙氨酸。
(2)利用该种微生物，以富马酸铵盐为底物，直接生产光学纯L-丙氨酸。
(3)通过改变体系反应条件，加入抑制L-丙氨酸消旋酶活性的物质，生产的产品光学纯度≥99.99％。
本发明与国内外同类技术主要区别在于：
(1)本技术只需要培养一种微生物，产生两种酶，而国内外同类技术利用两种微生物，分别产生两种酶。
(2)本技术反应物直接使用富马酸铵盐作为原料，而国内外同类技术利用L-天门冬氨酸作为原料。
(3)本技术生产的产品光学纯度≥99.99％，而国内外同类技术生产的产品光学纯度≤95％。
(4)其它：由于本技术使用一菌双酶技术，与国内外同类技术相比：减少了生产过程，节约设备投资，减少环境污染，降低了生产成本。