一种检测土壤纤维素酶活性的分析方法.pdf

本发明涉及一种检测土壤中纤维素酶活性的分析方法：1)称取筛分的土壤风干样品n份于n支粗试管中，向各试管中加入醋酸缓冲溶液，使用旋涡振荡器振荡，在振荡条件下取土壤悬液至96微孔板(占有n个微孔)，向n-1个孔中加入4-MUB-7-β-D-纤维二糖苷底物溶液，另一孔中加入等量水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入等量底物溶液和等量水作为无土壤对照，恒温条件下振荡培养；2)培养结束后向微孔板中加入NaOH终止反应；3)多功能酶标仪对反应产物进行荧光测定；4)计算纤维素酶活性。本发明的优点为：1)与传统方法相比，减短了培养时间，省略了过滤等操作程序，简化了操作步骤；2)微孔板内的荧光物质可通过多功能酶标仪在15s内同时获得测定数据，允许大量样品同时进行测定；3)准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。

1.  一种检测土壤中纤维素酶活性的分析方法，其特征在于：
1)以已知系列浓度的MUB溶液为标准物，采用酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；作为测定的标准曲线；以MUB标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；
2)分别称取n份3-5g过1-2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中，n为≥3的正整数，向各试管中加入30-50ml 0.45-0.55mol·L^-1pH5.0-6.0的醋酸缓冲溶液，使用微量进液枪在旋涡振荡条件下取100μl土壤悬液加入微孔板中，占有n个微孔，向n-1个孔中加入10mM 4-MUB-β-D-纤维二糖苷100μl，另一孔中加入100μl水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入100μl底物溶液和100μl水作为无土壤对照；25℃-30℃条件下振荡培养2.5-3.5h；分别向孔内加入100μl 2-2.5mol·L^-1NaOH终止反应；
3)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；在多功能酶标仪上测定荧光度为A；
4)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；
4)在多功能酶标仪上测定荧光度为A
5)根据MUB的量计算出酶活性；计算公式为：x＝[S*(30-50)]/(V*b*T)
式中：x为纤维素酶活性(单位：μmol MUB·g^-1·h^-1)，S为步骤4所获得的荧光物质的浓度，V为反应体系内的溶液总体积(单位ml)，b为称取的土壤重量(单位：g)，T为培养时间(单位：h)。

2.  根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述标准曲线的制作及测定过程如下，①配制0.5mol·L^-1pH5.5醋酸缓冲液；②应用0.5mol·L^-1pH5.5醋酸缓冲液配制浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.25，和1.0mol·L^-1MUB标准液，配制方法：称取MUB 0，0.176，0.881，1.762，4.404和1.762g定容至100ml，摇匀即可，此液需当日配制；③待土壤样品培养结束后向微孔中加入100μl此系列溶液和100μl水，100μl 2-2.5mol·L^-1NaOH后进行荧光测定；此系列溶液中含有MUB0，0.1，0.5，1.0，2.5，10μmol；④标准曲线每个点3-5次重复；⑤根据已知浓度的MUB量及通过荧光检测数据得到工作标准曲线。

3.  根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述微孔板为96微孔板，使用96微孔板作为反应体系承载物，其应用使得大量土壤样品的同时测定成为可能，提高检测效率。

一种检测土壤纤维素酶活性的分析方法
技术领域
本发明涉及土壤中纤维素酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中纤维素酶活性的分析方法。
背景技术
进入和累积在土壤中的碳水化合物是在土壤糖酶的作用下参与碳素循环的，纤维素和半纤维素是构成碳水化合物的主要种类，纤维素至其单体-葡萄糖的水解，是在纤维素酶复合体的多酶系统的不同酶的作用下，经若干阶段进行的。土壤中的纤维素酶复合体由四种糖酶所组成：1，4-β-葡聚糖内切酶、1，4-β-葡聚糖外切酶、1，4-β-葡糖苷外切酶和纤维二糖酶。它们分别参与纤维素分解的不同阶段。通常测得的土壤纤维素酶活性，是该种酶复合体的作用的总和。纤维素酶活性常常被用作指示土壤肥力的指标，因为它参与土壤有机质的分解，另外，纤维素酶的活性与腐殖质的含量间存在着相关性，在土壤纤维素的分解与腐殖质的形成间存在着一定的联系。总的说来，土壤纤维素酶的活性反映了土壤形成的生物气候及生态学条件、土壤生物化学过程的强度及土壤肥力水平。土壤纤维素酶活性受土壤条件、农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响，在进行土壤肥力评价时，常常需要测定在不同条件下的纤维素活性进行说明，因此，建立一种相对快速准确的纤维素酶活性的检测方法具有很重要的意义。
有关土壤纤维素酶活性的测定基本都是参照周礼恺在1984年所著《土壤酶学》一书中的方法(该方法译自Pancholy和Rice在1973年发表于SoilScience Society of American Proceedings中的方法)。该种方法步骤繁琐，且显色物质不稳定，测定重现性较差，而后Schinner和van Mersi在1996年所著的专著Methods in Soil Biology中对测定方法进行了改进，显色物质较稳定，重现性较好，但同样地，其测定过程比较复杂，所耗时间较长，且在显色过程中所需试剂氰化钾为剧毒试剂，难以获得，并增加了在测定过程中的对操作人员的危险性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检验土壤中纤维素酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对纤维素酶活性的测定步骤和终产物的检测方法进行了改进，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。其原理为使用荧光共轭物质作为测定底物，通过酶解产生荧光物质，通过多功能酶标仪对此产物进行荧光检测，进而计算出参与此反应的纤维素酶活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)以已知系列浓度的MUB溶液为标准物，采用酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；作为测定的标准曲线；以MUB标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；
2)分别称取n份3-5g过1-2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中，n≥3，向各试管中加入30-50ml 0.45-0.55mol·L<sup>-1</sup> pH5.0-6.0的醋酸缓冲溶液，使用微量进液枪在旋涡振荡条件下从粗试管中取100μl土壤悬液加入微孔板中，占有n个微孔，向其中n-1个孔中加入10mM的底物溶液(4-MUB-7-β-D-纤维二糖苷，MUB为荧光物质4-羟甲基-7-香豆素)100μl，另一孔中加入100μl水作为无底物对照；向第n+1个孔中加入100μl底物溶液和100μl水作为无土壤对照；25℃-30℃条件下振荡培养2.5-3.5h；分别向孔内加入100μl 2-2.5mol·L<sup>-1</sup> NaOH终止反应；
3)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；在多功能酶标仪上测定荧光度为A；
4)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；
5)根据MUB的量计算出酶活性；计算公式为：x＝(S*40)/(V*b*T)
式中：x为纤维素酶活性(单位：μmol MUB·g<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup>)，S为步骤4所获得的荧光物质的浓度，V为反应体系内的溶液总体积(单位ml)，b为称取的土壤重量(单位：g)，T为培养时间(单位：h)。
所述标准曲线的制作及测定过程如下，①配制0.5mol·L<sup>-1</sup> pH5.5醋酸缓冲液；②应用0.5mol·L<sup>-1</sup> pH5.5醋酸缓冲液配制浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.25，和1.0mol·L<sup>-1</sup>MUB标准液，配制方法：称取MUB 0，0.176，0.881，1.762，4.404和1.762g定容至100ml，摇匀即可，此液需当日配制；③向微孔中加入100μl此系列溶液和100μl水，100μl 2-2.5mol·L<sup>-1</sup>NaOH后进行荧光测定；此系列溶液中含有MUB0，0.1，0.5，1.0，2.5，10μmol；④标准曲线每个点3-5次重复；⑤根据已知浓度的MUB量及通过荧光检测数据得到工作标准曲线。
本发明使用荧光共轭物质4-MUB-7-β-D-纤维二糖苷作为测定底物，此物质被酶水解后产生荧光物质MUB，MUB在365nm处激发，在470nm处会检测到荧光，此种底物的使用是此测试方法改进的关键。所述微孔板通常为96微孔板，使用96微孔板作为反应体系承载物，其应用使得大量土壤样品的同时测定成为可能，提高检测效率。
本发明方法改进的依据
土壤中的纤维素酶的测定结果是1，4-β-葡聚糖内切酶、1，4-β-葡聚糖外切酶、1，4-β-葡糖苷外切酶和纤维二糖酶的总称，是由增值的和裂解的微生物细胞释放出来、累积在土壤中的胞外酶，它们都参与土壤中纤维素的分解转化过程。酶活性均是用底物的减少量和产物的生成量来进行表征，传统分光光度法测定土壤纤维素酶活性是使用羧甲基纤维素钠作为测定底物，酶解后的产物葡萄糖使用显色剂显色后通过分光光度计测定出其在690nm条件下的吸光度，此种方法所需测试时间较长(反应体系培养时间，酶解产物提取等)，操作较复杂，劳动量较大。而本改进方法依据的是一种荧光检测手段，此检测方法灵敏度高，对待测液的需求量较小，所以将反应体系(土壤悬液、底物及相应缓冲液)置于微孔板内进行即可，反应后在酶标仪上可同时获得所有微孔内的荧光物质的量，另外，因土壤量及底物量较小，所以只需较短的培养时间即可完成反应，此法简化操作步骤，大大提高测定效率。但与传统方法相比同样具有对仪器依赖性较大的缺点。
与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有：
1)反应体系培养时间较短，培养后无需过滤或离心等提取步骤，直接加入终止剂进行终止反应后在多功能酶标仪上进行测定，且微孔内的荧光物质可在15s内同时获得测定数据，允许大量样品同时进行测定，提高工作效率；
2)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好；
3)所需试剂品种减少，易获得，测定过程无需剧毒试剂，提高测定过程的安全性。
具体实施方式
试剂配制：
1.0.5mol·L<sup>-1</sup> pH 5.5醋酸缓冲液：溶解41g无水乙酸钠于蒸馏水中，定容至1l；吸取60ml冰乙(醋)酸于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容。将1l无水乙(醋)酸钠溶液和45ml冰乙(醋)酸稀释液混合，用乙(醋)酸调节pH到5.5；
2.10mmol·L<sup>-1</sup>乙二醇甲醚溶液：称取0.98g乙二醇甲醚于1l常量瓶中，用500ml水溶解后定容至刻度；
3.10mmol·L<sup>-1</sup>底物(4-MUB-β-D-纤维二糖苷)溶液：0.5184g底物(4-MUB-β-D-纤维二糖苷)于100ml容量瓶中，用试剂2溶解并定容至刻度；
4.2mol·L<sup>-1</sup>NaOH溶液：80g NaOH溶于800ml水中，转移至1l容量瓶中定容。
操作步骤：
1)标准曲线的制作及测定过程如下，①配制0.5mol·L<sup>-1</sup> pH5.5醋酸缓冲液；②应用0.5mol·L<sup>-1</sup> pH5.5醋酸缓冲液配制浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.25，和1.0mol·L<sup>-1</sup>MUB标准液，配制方法：称取MUB 0，0.176，0.881，1.762，4.404和1.762g定容至100ml，摇匀即可，此液需当日配制；③向微孔中加入100μl此系列溶液和100μl水，100μl 2mol·L<sup>-1</sup>NaOH后进行荧光测定；此系列溶液中含有MUB0，0.1，0.5，1.0，2.5，10μmol；④标准曲线每个点3次重复；⑤根据已知浓度的MUB量及通过荧光检测数据得到工作标准曲线。
2)分别称取n份3-5g过1-2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中，n≥3，向各试管中加入30-50ml 0.5mol·L<sup>-1</sup> pH5.5的醋酸缓冲溶液，使用微量进液枪在旋涡振荡条件下取100μl土壤悬液加入96微孔板(占有n个微孔)，向n-1个孔中加入10mmol·L<sup>-1</sup>底物溶液(4-MUB-7-β-D-木糖苷，MUB为荧光物质4-羟甲基-7-香豆素)100μl，另一孔中加入100μl水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入100μl底物溶液和100μl水作为无土壤对照；30℃条件下振荡培养3h；
3)分别向孔内加入100μl 2mol·L<sup>-1</sup> NaOH终止反应；
4)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；
5)在多功能酶标仪上测定荧光度为A
6)以MUB标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；
7)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；
8)根据MUB的量计算出酶活性；
计算公式为：x＝(S*40)/(V*b*T)
式中：x为纤维素酶活性(单位：μmol MUB·g^-1·h^-1)，S为步骤6所获得的荧光物质的量，V为反应体系内的溶液总体积(单位ml)，b为称取的土壤重量(单位：g)，T为培养时间(单位：h)
实施例1
本实施例所使用的土壤采自江苏省无锡市安镇镇年余农场(31°37’N，120°28’E)稻-麦轮作FACE(Free-air Carbon Elevation开放式CO₂浓度增高)系统平台，平台共有3个FACE试验圈和5个对照圈，FACE试验圈保持CO₂浓度比对照圈高200μmol·mol^-1。土壤类型为水耕人为土(俗称黄泥土)。两个处理即为CO₂浓度增高和对照，CO₂浓度增高处理3次重复，对照5次重复，在小麦生长的成熟期采样并用上述方法检测土壤纤维素酶活性。
每种土壤的具体分析步骤如下：
1)分别称取3份3g过2mm筛的土壤风干样品于粗试管中，向各试管中加入40ml 0.5mol·L^-1 pH5.5的醋酸缓冲溶液，使用微量进液枪在旋涡振荡条件下取100μl土壤悬液加入微孔板(占有n个微孔)，向n-1个孔中加入10mmol·L^-1底物溶液(4-MUB-β-D-纤维二糖苷，MUB为荧光物质4-羟甲基-7-香豆素)100μl，另一孔中加入100μl水作为无底物对照，向第n+1个孔中加入100μl底物溶液和100μl水作为无土壤对照，30℃条件下振荡培养3h；
2)分别向孔内加入100μl 2mol·L^-1NaOH终止反应；
3)将微孔板置入多功能酶标仪进行荧光检测，发射光波长365nm，测定光波长470nm；
4)在多功能酶标仪上测定荧光度为A
5)以MUB标准溶液的系列浓度和测定的吸光值A`制作工作标准曲线，得到斜率b；
6)根据吸光值A和斜率b，计算所测滤液中MUB的浓度S，S＝A*b；
7)根据MUB的量计算出酶活性；
计算公式为：x＝(S*40)/(V*b*T)
式中：x为纤维素酶活性(单位：μmol MUB·g^-1·h^-1)，S为步骤6所获得的荧光物质的量，V为反应体系内的溶液总体积(单位ml)，b为称取的土壤重量(单位：g)，T为培养时间(单位：h)
试验结果如下：

由表中数据可以看出，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。
实施例2
本实施例所使用的三种黑土均采于黑龙江省绥化市海伦县：处理1土壤为大豆连作，处理2土壤为水稻连作，处理3土壤为玉米连作。三种不同种植制度的土壤均过2mm筛后进行测定。具体步骤同实施例1。
试验结果如下：

表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。