技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及利用专用引物及相应酶切方案检测稻瘟病菌中的无毒基因。
背景技术
由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病，是世界水稻生产中的首要病害。稻瘟病菌与水稻寄主之间的 互作符合Flor的“基因对基因学说”，即若稻瘟病菌具有无毒基因，而水稻品种携带相应的抗病基因，水稻 就会对稻瘟病菌产生抗性。无毒基因是寄主与病原物互作中能够改变寄主细胞状态的一类重要病原物基因 ---激发子的重要成员。寄主植物中每一个显性的抗性基因，在病原真菌中对应存在一个显性的无毒基因； 寄主的抗病基因产物以直接或间接的方式对病原菌的无毒基因产物进行识别启动防卫反应，进而产生对该 病原菌的抗性。只有寄主植物中存在相应的抗病基因，而病菌中又存在相应的无毒基因，植株才能表现出 抗病性，继而引发病原菌与寄主植物的非亲和反应，促使局部细胞发生过敏性细胞坏死，以阻止病原微生 物在植株体内的扩展[Liu JL et al.，2010]。鉴定稻瘟病菌的无毒基因，有助于人们根据不同地区流行菌株的 无毒基因型选择具有相应抗病基因的水稻品种进行合理布局，同时育种家可根据田间主要流行菌株所携带 的无毒基因利用分子标记辅助手段选育具有相应抗病基因的水稻品种进行栽培和推广，从而减少农药的使 用和稻瘟病对水稻生产造成的威胁。
稻瘟病抗性基因Pik位于水稻11染色体长臂，对许多中国稻瘟病小种有较强的、稳定的抗性 [Fjellstrom et al.，2004]，该基因具有4个等位基因，分别为pik-p，pik-m，pik-s及pik-h。稻瘟病菌无毒基因 AVR-pik于2009年被克隆[YoshidaK et al.，2009]，目前已知5种等位基因类型，分别为AVR-pik-A，AVR-pik-B， AVR-pik-C，AVR-pik-D，AVR-pik-E，其中AVR-pik-D为该基因进化之初最先发现的类型，可为 pik/pik-p/pik-m所识别，而其它几种类型为该基因在与水稻品种抗病基因共同进化中陆续出现的突变型 [Hiroyuki Kanzaki et al.，2012]。这些无毒基因可为pik抗病等位基因识别的范围相对于AVR-pik-D类型小一 些，如AVR-pik-B仅可与抗病基因pikm和pikp间发生非亲合反应(不发病)，因此准确鉴定这种类型的等位 基因，用以检测田间流行稻瘟病菌株的特异性，可有助于人们根据水稻品种所携带的抗病基因进行合理布 局，减轻稻瘟病的危害。
发明内容
为准确鉴定稻瘟病菌所携带的无毒基因，进而有针对性选育及推广具有相应抗稻瘟病基因的水稻品 种，减轻稻瘟病的危害，本发明提供了一种用于检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B的方法，可以用于稻瘟 病菌所携带无毒基因的检测，以为品种布局及抗病品种选育提供参考。
本发明提供如下解决方案：
一种用于检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B是否存在的引物对DNA，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明进一步提供SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对在检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B 上的用途。
一种检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B是否存在的方法，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序 列为引物，扩增待检测DNA，若扩增出503bp大小的特异性片段且扩增子含有如SEQ ID NO：3所示序 列即为含有无毒基因AVR-pik-B。
一种区分稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B与其它等位基因的方法，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 所示序列为引物，PCR扩增待检测DNA，获503bp的扩增产物，进一步以NIaIII酶消化，若PCR产物不能为NlaIII 酶消化，则待检测DNA中存在无毒基因AVR-pik-B；若PCR产物酶切后可获367bp和136bp两个DNA片段，则 表明待检测DNA中存在稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B的等位基因AVR-pik-A、AVR-pik-C、AVR-pik-D或 AVR-pik-E。
上述引物及酶切方法对优选稻瘟病菌丝所提取的DNA进行鉴定，检测是否携带稻瘟病菌无毒基因 AVR-pik-B，检测方便，准确率高，可为稻瘟病抗病育种及品种布局提供参考。
附图说明
图1是以稻瘟病菌DNA为模板，以SEQ ID NO：1和ISEQ ID NO：2所示序列为引物扩增产物经NlaIII 酶消化后的凝胶电泳图；
其中，M：600bp分子量标记(TIANGEN MD101)，200ng；片段长度分别为：100bp，200bp，300bp， 400bp，500bp，600bp。
A：AVR-pik-A；B：AVR-pik-C；C：AVR-pik-D；D：AVR-pik-B：E：AVR-pik-E
CK：为PCR产物酶切前的电泳条带；EC：为PCR产物酶切后的电泳条带。
其中AVR-pik-A、AVR-pik-C、AVR-pik-D和AVR-pik-E的扩增产物NIaIII酶消化后获得367bp和136bp 两个DNA片段，而AVR-pik-B的扩增产物经NIaIII酶消化后为仍为503bp。
图2是以田间分离的6株稻瘟病菌DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物 扩增产物经NlaIII酶消化后的凝胶电泳图；
其中，M：600bp分子量标记(TIANGEN MD101)，200ng；片段长度分别为：100bp，200bp，300bp， 400bp，500bp，600bp。
1，2，3，4，5，6分别为不同菌株扩增产物经NlaIII酶消化后的电泳结果，可见1，2，3，5号菌株PCR产物酶切 后仍为1条长约500bp的片段，而4号和6号菌株的PCR产物酶切后获两条片段，序列长度约为370bp及130bp。
图3是经鉴定具无毒基因AVRpik-B的稻瘟病菌在4个pik及其等位基因单基因系上的接种鉴定结果。
几个品种对该菌株的抗性表现分别为：pikm和pikp表现高抗，piks表现中感，pik表现感病，丽江新 团黑谷表现高感。
图4是以田间分离的6株稻瘟病菌DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物 扩增产物的凝胶电泳图；
其中，M：600bp分子量标记(TIANGEN MD101)，200ng；片段长度分别为：100bp，200bp，300bp， 400bp，500bp，600bp。
1，2，3，4，5，6分别为不同菌株扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
实施例1：DNA提取、PCR扩增和电泳分析
一、稻瘟病菌丝体培养
挑取适量稻瘟病菌丝，接种于200ml液体培养基(每升液体培养基中含KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、 MgSO40.5g、CaCl20.1g、葡萄糖20g及酵母膏5g)中，25℃及120r/m震荡培养6d，5000r/m离心10分 钟收集菌丝体，置于灭菌滤纸上在37℃烘箱中放置36h，烘干后保存于-20℃备用。
二、DNA提取(CTAB法)：
称取0.1g烘干菌丝体在液氮中研磨，待液氮蒸发完后(注意：勿使样品融化)，迅速转入含65℃预热过 的提取液(1M Tris pH8.0，100mM；5M NaCl，1.0M；0.5M EDTA，20mM；10％CTAB，2.0％)400μL的 离心管中。轻轻摇匀。
60～65℃水浴30～60分钟，每10分钟轻轻摇动均匀。
加等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，温和摇动，使成乳状液。
室温下(温度不低于15℃)，12000r/min离心5min，取上清液。
用大孔Tip头小心抽取上清液200μL加入预冷的2倍体积的无水乙醇(或等体积的异戊醇)，-20℃的条件 下放置20分钟以上，5000r/min离心5分钟，收集沉淀。
70％乙醇洗涤沉淀1～2次。
打开管盖，放洁净场所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。
100μLTE(Tris-Hcl10mM，PH8.0；EDTA1mM，PH8.0)溶解沉淀，并稀释至100μg/mL，-20℃保存备用。
三、PCR扩增：
PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
1.反应体系如下：
2×Taq PCR Master Mix(艾德莱PC0902)10μL，10μM的引物各0.5μL，100μg/mL的模板DNA1μL， ddH2O8μL。
3.PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延 伸10min，4℃保存。
四、PCR产物检测及纯化
取4μLPCR产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳，经goldview染色，应用凝胶成像系统记录试验结果。
利用PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN M1419)对产物进行纯化。
五、酶切试验
酶切反应体系(20μL)：10×NEB4缓冲液2μL，纯化PCR产物≤1μg，100×BSA0.2μL，内切酶0.5μL， 灭菌ddH2O补足至20μL
酶切条件：37℃温育3.5h。
六、酶切后的产物电泳检测
取4μL酶切产物，在1％琼脂糖凝胶中电泳，经goldview染色，应用凝胶成像系统记录试验结果。
实施例2：稻瘟病菌中无毒基因AVR-pik-B的检测
一、从田间采集的稻瘟病菌经分离纯化，按照实施例1中的方法培养稻瘟病菌并提取菌丝DNA，再进 行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶中电泳检测扩增结果，从图2可见，以6株稻瘟病菌的DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物扩增均可获得500bp左右的序列。
二、按照实施例1的方法进行PCR产物纯化及酶切，酶切产物取4μL，在1％琼脂糖凝胶中电泳，经 goldview染色，应用凝胶成像系统记录试验结果(图3)。从图3可见，1，2，3，5号菌株的PCR产物酶切后 仍为1条长约500bp的片段，而4号和6号菌株的PCR产物酶切后获两条片段，序列长度约为370bp及130bp， 表明1，2，3，5号菌株携带无毒基因AVR-pik-B。
三、第一步获取的6个稻瘟病菌的PCR扩增产物送北京中美泰和公司测序，结果表明1，2，3，5号菌 株PCR产物序列与SEQ ID NO：3所示序列一致，进一步证明其携带的确为无毒基因AVR-pik-B。
实施例3：携带无毒基因AVR-pik-B的稻瘟病菌株与不同水稻单基因系间的互作
将携带无毒基因AVR-pik-B的稻瘟病菌移植于燕麦片番茄汁琼脂培养基上，25～27℃条件下培养5～7d， 待菌丝长满，用灭菌的棉签擦掉气生菌丝后保湿培养，稻瘟病菌会大量产孢。待4个抗稻瘟病水稻单基因 系(pik、pikp、pikm、piks)和丽江新团黑谷(无抗病基因对照)的稻苗长至5叶1心时，将上述扩繁培 养的各菌株分生孢子分别用120ml无菌水清洗，用双层纱布过滤装入三角瓶中，配制孢子悬液(浓度为120 倍显微镜视野下有20个左右孢子)，分别隔离喷雾接种。接种后24h，用塑料膜覆于塑料盘上方的铁架上保 湿，在塑料膜上覆盖遮阳网防止阳光直射。于接种后7-10d调查，致病反应型和小种确定按全国稻瘟病菌 生理小种联合试验组(1980)统一标准进行评定。
调查记载标准：
0级 无病…………………………………………………………………………………………高抗(HR)
1级 仅有针尖大小的褐点……………………………………………………………………………抗(R)
2级 稍大的褐点………………………………………………………………………………………抗(R)
3级 圆形稍大的灰色小病斑，边缘褐色，病斑直径1～2mm……………………………………中抗(MR)
4级 典型纺锤形病斑，长1～2cm，通常局限于两条主脉之间。为害面积2％以 下……………………………………………………………………………………………………中感(MS)
5级 典型病斑，为害面积3％～10％………………………………………………………………中感(MS)
6级 典型病斑，为害面积11％～25％…………………………………………………………………感(S)
7级 典型病斑，为害面积26％o～50％…………………………………………………………………感(S)
8级 典型病斑，为害面积51％～75％……………………………………………………………高感(HS)
9级 全部叶片枯死………………………………………………………………………………高感(HS)
由图4可见，接种后7d，pikp和pikm两个单基因系叶片上无病斑，对携带毒基因AVR-pik-B的稻瘟 病菌表现高抗；piks单基因系上有直径大于2mm左右的病斑，对该菌株表现为中感；而单基因系pik及无 任何抗稻瘟病基因的丽江新团黑谷叶片上均出现直径大于2cm的梭形病斑，且为害面积较大，对稻瘟病分 别表现为感和高感。该接种试验结果表明具无毒基因AVR-pik-B的稻瘟病菌可为携带pikm和pikp抗病基 因的水稻品种所识别，提示育种家进行品种选育时可选择具这两个抗病基因的亲本进行品种的抗性改良， 品种推广时亦可选择携带pikm和pikp抗病基因的水稻品种进行合理布局，避免稻瘟病的发生。