技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明 涉及一种植物茎叶冷诱导基因表达启动子及其应用，该启动子能够在植物 转基因调控体系中在冷诱导条件下驱动目标基因在植株中表达。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物，冷害是影响水稻生产的重要限制因子 之一。低温冷害对水稻产量的影响主要表现为结实率降低，花粉发育延 迟，花药开裂不畅，影响受精结实，导致产量降低。水稻育种家们渴望 通过育种手段，将地方资源的强耐冷性转移到栽培品种上，以提高耐冷 性，降低冷害引起的水稻产量损失。但地方耐冷稻种资源往往不利性状 较多，改良难度极大。因此，迫切需要发掘水稻耐冷种质资源及优异基 因，从而培育出水稻耐冷新品种。
迄今，国内外的研究人员进行了坚持不懈的探索与研究，开展了抗 冷胁迫新品种选育工作，取得了一定成绩。仲康等（2007）将锌指蛋白 类似蛋白OsCOIN基因在水稻中过量表达使转基因水稻中脯氨酸含量升 高，提高植物的耐冷性。张红生等（2009）将水稻锌指蛋白ZFP245基因 在水稻中过量表达，发现超量表达ZFP245基因水稻在冷胁迫下使脯氨酸 积累相关基因OsP5CS和脯氨酸转运基因OsProT基因的表达量提高，促 使脯氨酸的量增加，增强植物的耐冷性。余淑美等（2010）发现MYBS3 超量表达水稻能在4℃条件下处理后可以存活，且不影响其主要农艺性状。 另外，对一些包括DREB/CBF、NAC等转录因子的过量表达可以提高水稻的 耐冷性。
目前，随着分子生物学、生物信息学的飞速发展和转基因技术的日趋 成熟，通过现代基因工程技术进行分子育种已成为改良水稻耐冷性的一 种高效途径。
我国水稻资源丰富，从水稻种发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷 诱导启动子，将对水稻耐冷品种的选育具有重要的理论及实际意义，在农 业领域将具有广阔的应用和市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动外源基因在冷诱导条件下特异性表达的 启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本 文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、 高粱或燕麦，优选为水稻。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物茎叶冷诱导表达启 动子Poscold3，所述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来 源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）的水稻茎叶冷诱导表达启 动子Poscold3，本文中称为Poscold3或启动子Poscold3。
优选地，本发明提供的植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3的DNA序 列为SEQ ID No:1所示的序列，即Poscold3或启动子Poscold3。
另一方面，本发明提供一种植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3，其 DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少90%同源性；或者，所 述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3为在SEQ ID No:1所示的DNA序 列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位 基因或衍生物；或者所述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物茎叶冷诱导表达启动子 Poscold3序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标 基因在冷诱导条件下在植物茎叶中特异性表达。
本发明所提到的冷诱导指的是对转基因植株施加一段时间的低温（例 如，4摄氏度），从而通过本发明的启动子诱导特定基因表达。
另一方面，本发明还提供一种包含上述植物茎叶冷诱导表达启动子 Poscold3的表达盒。
又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含 上述的植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3，在所述重组表达载体中，所 述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3连接于待表达的基因序列的上游； 优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为 pCAMBIA1391-Poscold3，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列 即Poscold3或启动子Poscold3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载 体，本文中称为pCAMBIA1391-Poscold3。更优选地，所述基因为具有耐 冷性的基因。
另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的 上述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3、上述表达盒、或上述重组表达 载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上 述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3、上述表达盒、上述重组表达载体。 其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
再一方面，本发明提供上述植物茎叶冷诱导表达启动子Poscold3在培 育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物茎叶冷诱 导表达启动子Poscold3连接于载体的待表达的基因序列上游（例如，将所 述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表 达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。本发明中的待表达基因 优选为具有耐冷性的基因。
并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子 叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No：1 中相同）：
需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表 示的序列“aacgagcata acccgagcca ga”为获得启动子过程中使用的正向引物的 留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“cagcgagag aacacaaact cac”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序 列与反向引物的相应序列互补），共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则 为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子 既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA 序列。
综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1833bp的DNA 序列，并将其命名为Poscold3（序列表中的SEQ ID No:1）。将该序列经酶 切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即 重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农 杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因 水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在冷诱导处理后，整体上的Gus 基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1833bp的序列具有驱动基因 表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻冷诱导处理后特异性表 达。
本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成 型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植 物表达载体，经转化后，在冷诱导处理后可驱动靶标基因在植株的茎叶中 特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物的茎叶中的表达量，增加转基 因的效果。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子Poscold3能够调控基因在植株的茎叶中在 预定条件下集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作 物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株的茎叶中表达， 代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的耐冷转 基因植物品种。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将Poscold3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图， 其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391- Poscold3示意图，其中示出了利用Poscold3启动子驱动位于其下游的GUS 基因表达；
图2为萌发21天后的Poscold3::GUS转基因植株组织染色图。在28℃ 条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根（A）、茎（B）、叶（C） 均无GUS活性，而经4℃冷处理24小时，染色后在根（D）中无GUS表 达，但在茎（E）、叶（F）中均有GUS强烈表达（标尺=10mm）。
图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这 些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实 施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的Poscold2启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare） 全基因组序列，依据水稻PCole1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的 载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391（图1中的A部分， 该载体来自于CAMBIA，为公开使用载体，在安徽省农业科学院农业部转 基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus 基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带SalI，酶切位 点（GTCGAC），反向引物（SEQ ID No:3）5’端带EcoRI，酶切位点 （GAATTC），引物序列如下：
正向引物：GTCGACAACGAGCATAACCCGAGCCAGA SalI
反向引物：GAATTCGTGAGTTTGTGTTCTCTCGCTG EcoRI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子Poscold3的获得
以水稻品种日本晴的DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动 子Poscold3，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s， 执行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1833bp，将其连接到 PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上， 按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进 而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳 性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如 图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克 隆即为所要获得的启动子Poscold3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
植物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子Poscold3的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒， 用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子Poscold3片段。同时利用SalI和EcoRI 对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的Poscold3 片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接， 得到启动子Poscold3与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391- Poscold3（图1B），利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生 物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），从冻融法所得产物中提取阳性 质粒，用SalI和EcoRI进行酶切验证，验证结果如图3中所示。
利用启动子Poscold3驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。 用含有1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸 泡种子40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无 次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下， 将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽 分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后 用于农杆菌转化。
采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组 表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子 筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai， et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.）等提出的方法。
共获得28株pCAMBIA1391-Poscold3植株（Poscold3：：gus转基因水 稻植株）。
步骤2、冷处理和GUS组织化学染色
植株经过4℃冷处理24小时后进行GUS染色，染色方法参照Jefferson (Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的 方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。 脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
把萌发21天后的Poscold3::GUS转基因植株组织进行染色。如图2中 所示，其中，A-C分别为在28℃条件下正常生长的水稻植株的根、茎、叶 经24小时染色后的结果，从图中可以看出，根（A）、茎（B）、叶（C）均 无GUS活性。图2中D-F为对水稻植株的根、茎、叶在4℃下冷处理24 小时再进行染色的结果，如图所示，在染色后在根（D）中无GUS表达,但 在茎（E）、叶（F）中均有GUS强烈表达。
从以上实验结果可以看出，本发明的启动子在冷诱导条件下，能够驱 动转基因植株的茎和叶特异性表达，而其他部位不会特异性表达。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员 可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求的范围。