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1、(10)申请公布号 CN 103898057 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103898057 A (21)申请号 201410123113.0 (22)申请日 2014.03.28 CGMCC No8004 2013.07.18 CGMCC No8005 2013.07.18 CGMCC No8006 2013.07.18 CGMCC No8007 2013.07.18 CGMCC No8008 2013.07.18 C12N 5/09(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 哈尔滨医科大学 地址 1。
2、50081 黑龙江省哈尔滨市南岗区保健 路 157 号 (72)发明人 傅松滨 孟祥宁 贾学渊 刘鹏 孙文靖 金焰 张春玉 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 费碧华 (54) 发明名称 一种顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系及其制备 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞 系及其制备方法， 所述顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细 胞系为 U2OS/CDP310-8M、 U2OS/CDP10-7M、 U2OS/ CDP310-7M、 U2OS/CDP10-6M， 其 微 生 物 保 藏 号 分 别 为 CGMCC No.。
3、8004、 CGMCC No.8005、 CGMCC No.8006、 CGMCC No.8007。 另外， 不耐药的U2OS敏 感细胞系微生物保藏号为CGMCC No.8008， 保藏单 位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心。 本发明通过构建顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞 系建立了体外骨肉瘤细胞耐顺铂的模型， 为骨肉 瘤的临床治疗提供很好的基础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103898057 。
4、A CN 103898057 A 1/3 页 2 1.一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系， 其特征在于， 所述顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系为 U2OS/CDP310-8M、 U2OS/CDP10-7M、 U2OS/CDP310-7M、 U2OS/CDP10-6M， 其微生物保藏号分别 为 CGMCC No.8004、 CGMCC No.8005、 CGMCC No.8006、 CGMCC No.8007， 另外， 不耐药的 U2OS 敏感细胞系微生物保藏号为 CGMCC No.8008， 保藏日期均为 2013 年 7 月 18 日， 保藏单位为 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 2。
5、. 制备如权利要求 1 所述的顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： （1） 细胞培养 以人骨肉瘤 U2OS 细胞系为研究对象， 细胞培养用含 10% 胎牛血清的 IMDM 培养基， 在不 含青霉素、 链霉素的环境下， 于体积分数为5%的CO2、 37条件下常规培养， 耐药细胞连续培 养 5 个月后进行实验指标分析 ； （2） 细胞耐药浓度的确定 取生长状态良好的细胞， 用 0.01M 的 PBS 缓冲液冲洗， 用质量分数为 0.25% 的胰酶消化 之后进行稀释， 计数， 将稀释的细胞悬液以 2000 细胞 / 孔的细胞密度种入 96 孔板中， 细胞 贴壁后。
6、加入设置浓度梯度的 CDP， 此后再培养 72h， 之后经换液， 读数， 计算后得出细胞系对 CDP 的 IC50值， 以低于此值 8 10 倍浓度的 CDP 对细胞进行耐药， 观察细胞的生长速度及 状态， 待其生长稳定后进行下一数量级浓度的耐药培养 ； 确定人骨肉瘤 U2OS 敏感细胞系对 CDP 的耐药起始浓度为 310-8M， 以 3 倍递增为一 个浓度梯度， 确定的耐药细胞系为 U2OS/CDP310-8M、 U2OS/CDP10-7M、 U2OS/CDP310-7M、 U2OS/CDP10-6M ； （3） 细胞形态学分析 U2OS 敏感细胞置显微镜下观察到细胞贴壁生长， 体积中等，。
7、 大小均匀， 细胞呈椭圆形或 不规则形， 胞质较少， 细胞核较大， 核仁清晰 ； U2OS/CDP 耐药细胞在光镜下观察， 细胞贴壁 生长， 与敏感细胞比， 耐药细胞变得更加细长， 细胞呈椭圆形、 梭形或不规则形， 细胞核、 胞 质增大， 多核仁现象增多， 并且随耐药浓度增加细胞内空泡量增加， 高浓度耐药细胞不规则 形状程度严重， 细胞相互交织形成网状 ； （4） 耐药细胞系耐药指数分析 采用 MTT 比色法检测人骨肉瘤 U2OS 耐药细胞系对 CDP 的 IC50值 ； （5） 耐药细胞系细胞中期染色体标本制备 将处于对数生长期的细胞加入终浓度为 0.01g/mL 的秋水仙素， 37继续培养。
8、 1-2h， 将细胞用吸管吹打下来， 细胞悬液转入离心管中 1000r/min 离心 8min， PBS 冲洗两次， 加入 37预热的 0.075mol/L 的 KCL， 在 37水浴中低渗作用 11-15min， 逐滴加入 1mL 新鲜固定 液进行预固定， 其中， 新鲜固定液为甲醇与冰醋酸的体积比为 3:1， 1500r/min 离心 5min， 弃 上清加入10mL固定液， 轻轻混匀， 室温固定30min， 1500r/min离心5min， 重复一次， 弃上清， 视沉淀细胞量加入 1 1.5mL 固定液混匀， 将细胞悬液以 30cm 高度滴于预冷的载玻片上， 室温晾干， Giemsa 染液。
9、染色 5min， 流水冲洗， 晾干， 置于显微镜下观察 ； （6） 耐药细胞系增殖能力的变化 选取生长至 70% 80% 的 U2OS 敏感细胞及耐药细胞系细胞， 每种细胞分别接种到 7 块 96 孔板中， 每种细胞设置 6 个复孔， 在每个孔中加入相应细胞所需的不含药物的培养基， 在 权 利 要 求 书 CN 103898057 A 2 2/3 页 3 接种后的第 1 天， 用 MTT 法计算第一块板子的每种细胞的细胞数目， 第 2 天计算第二块板子 中的各种细胞数目， 以此类推直至完成每种细胞的 7 天生长情况检测， 绘制成图， 即为敏感 及各个耐药水平细胞的生长曲线 ； （7） Real。
10、-time PCR 检测可能参与 U2OS 对顺铂耐药基因的表达情况 细胞总 RNA 的提取 采用 TRIzol Reagent 总 RNA 提取试剂， 按说明书提供方法分别提取 U2OS 敏感及耐药 细胞系的总 RNA， 分别取上述几种细胞， 用浓度为 0.01M 的 PBS 冲洗 3 次， 加入适量 TRIzol Reagent， 室温放置5min裂解细胞， 吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf管中。 每 管加入 0.2mL 氯仿， 剧烈震荡 15s， 室温放置 2 3min， 4、 12000r/min 离心 15min， 将上层 水相移至干净 Eppendorf 。
11、管中， 加入 0.5mL 异丙醇， 轻轻混匀， 室温放置 10min， 4、 7500r/ min 离心 10min。弃上清， 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀， 7500r/min 离心 5min， 室温干燥 RNA 沉淀， 5 10min 后溶于适量 DEPC 水。质量分数为 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 样本的完整 性， 应用 Bio-Photometer 对提取的 RNA 进行定量测定 ； RNA 逆转录为 cDNA 利用 Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit（Roche） 试剂盒将提取的细 胞 mRNA 逆转录为 cDNA 。
12、； Real-time PCR 应用 Primer3.0software 设计并合成基因特异性引物， 将 qPCR 反应体系加入 96 孔板 中， 在 Roche LightCycler480 型荧光定量 PCR 仪 SYBR Green I/HRM Dye(465-510) 系统下 运行， 每一样本测量 3 次， 94 4min ； 94 30s， 60 30s， 72 30s， 共 45 个循环 ； 基因扩增 水平以 -actin 为内参进行比较， 计算不同实验的数据平均值 标准差， 应用 SPSS 软件 进行统计学分析。 3. 制备顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系的方法， 其特征在于， 。
13、包括以下步骤 ： （1） 耐药浓度设定 细胞培养 ； 测定敏感的肿瘤细胞对药物的 IC50值 ； 耐药起始的最低浓度从低于 IC50一个数量级开始， 递增的梯度依次是前一个浓度的 3 倍 ； （2） 耐药细胞的培养 从耐药起始的最低浓度开始， 维持培养细胞， 如果细胞形态、 生长速度、 细胞对 CDP 的 IC50值等方面无明显变化， 提高药物浓度， 进行下一药物浓度耐药细胞的培养， 如此进行不 同浓度耐药细胞系的建立， 此过程中观察加药初始阶段细胞的变化， 如果细胞大量死亡到 无法耐受的程度， 说明设定的浓度过高， 需要适当降低药物浓度 ； （3） 耐药细胞的检测 细胞形态学分析 耐药细胞耐。
14、药指数测定 采用MTT比色法检测人骨肉瘤U2OS耐药细胞系对顺铂的IC50值， 所得各耐药细胞系的 IC50值与敏感细胞系的 IC50值的比值即为耐药指数 ； 细胞中期染色体标本制备 权 利 要 求 书 CN 103898057 A 3 3/3 页 4 双微体是细胞中位于染色体外、 小的、 成对存在的无着丝粒、 无端粒的染色质小体， 是 癌基因和耐药基因重要载体， 收集不同耐药程度细胞的染色体标本， 分析顺铂耐药是否引 起细胞遗传学水平的改变 ； 细胞生长曲线， 分析各耐药细胞增殖的变化 耐药基因检测 收集稳定耐药五个月后的细胞， 提取细胞的RNA， 应用Real-time PCR， 对参与细。
15、胞摄入 与排出顺铂、 顺铂在细胞内的代谢、 细胞对顺铂所致损伤的应答等主要通路的关键基因进 行检测。 4. 权利要求 1 所述的顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103898057 A 4 1/7 页 5 一种顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系及其制备方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 骨肉瘤是骨骼系统常见的恶性肿瘤之一， 好发于青少年。 早期即可发生远处转移， 预后差， 表现为高度的基因组不稳定性、 非整倍性、 复杂的结构重组不平衡性和基因扩增。 。
16、目前， 临床上治疗骨肉瘤主要以手术和化疗为主。顺铂是常用的治疗骨肉瘤的一线用药之 一。然而肿瘤细胞耐药性的产生限制了化疗药物的临床效果， 给治疗带来了障碍。 0003 顺铂属于 DNA 交联剂类抗肿瘤化疗药， 使 DNA 链间共价交联， 阻断 DNA 复制、 转录 和重组， 从而杀伤肿瘤细胞。 其耐药性的产生机制主要包括以下几个方面 ： 减少药物在细胞 内的积累 （包括减少药物摄入和增加药物外排） ； 细胞内代谢降低药物毒性 ； 增强对药物所 致损伤的修复能力等。 0004 人体细胞摄取顺铂等铂类化合物依赖于细胞上的铜离子转运体 hCTR1。被摄入细 胞的顺铂， 部分进入细胞核与 DNA 形成。
17、铂 -DNA 加合物， 发挥抗肿瘤作用。部分顺铂一方面 与谷胱甘肽 （glutathione， GSH） 作用， 形成 Pt(GS)2 复合物， 通过 ATP 依赖的多药耐药蛋 白 MRP2（属于 ABC- 转运蛋白， 由 ABCC2 基因编码） ， 将此共价化合物排出细胞外 ； 另一方面 与细胞中的两种 P 型 -ATP 酶依赖的铜外排泵 ATP7A 和 ATP7B 上的铂结合位点结合， 介导顺 铂等铂类化合物在细胞内的转运和外排。所以在此过程中 hCTR1、 ATP7A 和 ATP7B 的表达， MRP2、 GSH 或与其代谢有关酶活性增高均有可能参与顺铂耐药的产生。在对顺铂耐药的研 究中。
18、发现， 许多耐药细胞表现出 hCTR1mRNA 表达降低 ； 多种肿瘤细胞中 MRP2 的过表达使其 对顺铂的耐受增加 ； 而反义干扰MRP2后， 则可以逆转肿瘤细胞对顺铂的耐受性。 此外， 将表 达 ATP7A 的载体转染到人卵巢癌细胞后， 细胞获得了对顺铂、 卡铂和奥沙利铂的耐受能力。 人 ATP7B， 与 ATP7A 约含有 65% 的共同氨基酸序列， 在多种顺铂耐药的肿瘤细胞 （卵巢癌， 胃 癌、 肺癌、 口腔鳞状细胞癌、 乳腺癌、 前列腺癌、 子宫内膜癌等） 中发现其过表达， 是顺铂耐药 性检测常用的分析指标之一。最新研究发现 ATP7A 和 ATP7B 蛋白受铜诱导人体转铜伴侣 A。
19、tox1的调节， 顺铂在胞浆可以与Atox1结合， 这阻止了顺铂进入细胞核与DNA的作用， 进而 增加细胞对顺铂的耐受。 0005 顺铂作为 DNA 损伤剂， 癌细胞对其所致损伤的修复能力的提高也是其产生抗药性 的重要原因之一。 核苷酸切除修复 （nucleotide excision repair， NER） 是DNA链间交联修 复的主要机制。 DNA链间交联修复始动于交联位点两侧复制叉在交联位点的汇聚。 复制叉无 法通过交联位点， 故在损伤位点两侧切割一条母链 DNA， 复制后产生双链断裂的 DNA， 最终 通过同源重组或非同源末端连接方式完成修复。 而另一条模板链跨越交联位点继续完成复 。
20、制， 最终保留交联损伤点。 NER修复包括转录耦联核苷酸切除修复 （transcription-coupled NER,TC-NER） 和全基因组核苷酸切除修复 （global genome NER,GG-NER） 。 研究发现， ERCC1、 XPD 是介导多种肿瘤细胞顺铂耐药的关键因子。ERCC2、 ERCC5、 XPA、 XPC、 XPF、 CSB 也与铂类 药物的敏感性相关。另外有研究报道， MMR 修复系统， 也是涉及顺铂耐药性维持的一个重要 说 明 书 CN 103898057 A 5 2/7 页 6 因子。虽然 MMR 不修复顺铂所致的 DNA 交联， 但该系统帮助检出顺铂 -D。
21、NA 加合物， 并且 MMR 蛋白产生相关信号诱导细胞凋亡发生。因此， MMR 的功能缺陷， 使本该发生凋亡的复制损伤 DNA 存在， 导致了顺铂耐药能力的增加。 0006 多途径涉及顺铂耐药性的产生， 不同的肿瘤细胞介导细胞耐药的形成机制也不尽 相同。为了更好地分析骨肉瘤对顺铂的耐药机制， 我们拟在体外建立骨肉瘤的顺铂耐药模 型。 发明内容 0007 本发明针对目前骨肉瘤治疗药物 - 顺铂耐药性的存在， 给骨肉瘤的治疗带来的障 碍， 提供了一种顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系及其制备方法， 本发明建立体外骨肉瘤细胞耐 顺铂的模型， 分析骨肉瘤细胞顺铂耐药后的形态学变化， 染色体水平变化， 生。
22、长性状改变， 并对肿瘤细胞对顺铂药物耐受的分子机制进行初步分析， 以期为骨肉瘤的临床治疗提供新 的策略。 0008 本发明采用药物逐步递增法诱导产生不同浓度的骨肉瘤细胞 U2OS 耐顺铂的 细胞系， 所述顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系为 U2OS/CDP310-8M、 U2OS/CDP10-7M、 U2OS/ CDP310-7M、 U2OS/CDP10-6M， 其微生物保藏号分别为CGMCC No.8004、 CGMCC No.8005、 CGMCC No.8006、 CGMCC No.8007。另外， 不耐药的 U2OS 敏感细胞微生物保藏号为 CGMCC No.8008， 保藏日期均为 。
23、2013 年 7 月 18 日， 保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心。 0009 本发明对各浓度耐药细胞的细胞形态学、 耐药指数以及增殖能力的分析表明耐药 模型成功建立。 0010 制备上述本发明顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系的方法 ： 0011 （1） 细胞培养 0012 以人骨肉瘤 U2OS 细胞系为研究对象， 细胞培养用含 10% 胎牛血清的 IMDM 培养基， 不含青霉素、 链霉素的环境下， 于体积分数为5%的CO2、 37条件下常规培养， 耐药细胞连续 培养 5 个月后进行实验指标分析。 0013 （2） 细胞耐药浓度的确定 0014 取生长状态良好的细胞， 用。
24、 0.01M 的 PBS 缓冲液冲洗， 用质量分数为 0.25% 的胰酶 消化之后进行稀释， 计数， 将稀释的细胞悬液以2000细胞/孔的细胞密度种入各孔中， 细胞 贴壁后加入设置浓度梯度的 CDP， 此后再培养 72h， 之后经换液， 读数， 计算后得出细胞系对 CDP 的 IC50值， 以低于此值的 8 10 倍浓度的 CDP 对细胞进行耐药， 观察细胞的生长速度 及状态， 待其生长稳定后进行下一数量级浓度的耐药培养。 0015 确定人骨肉瘤 U2OS 敏感细胞系对 CDP 的耐药起始浓度为 310-8M， 以 3 倍递增为 一个浓度梯度， 确定的耐药细胞系为 U2OS/CDP310-8M。
25、、 U2OS/CDP10-7M、 U2OS/CDP310-7M、 U2OS/CDP10-6M。 0016 （3） 细胞形态学分析 0017 U2OS 敏感细胞置显微镜下观察到细胞贴壁生长， 体积中等， 大小均匀， 细胞呈椭 圆形或不规则形， 胞质较少， 细胞核较大， 核仁清晰 ； U2OS/CDP 耐药细胞在光镜下观察， 细 胞贴壁生长， 与敏感细胞比， 耐药细胞变得更加细长， 细胞呈椭圆形、 梭形或不规则形， 细胞 说 明 书 CN 103898057 A 6 3/7 页 7 核、 胞质增大， 多核仁现象增多， 并且随耐药浓度增加细胞内空泡量增加， 高浓度耐药细胞 不规则形状程度严重， 细胞。
26、相互交织形成网状。 0018 （4） 耐药细胞系耐药指数分析 0019 采用 MTT 比色法检测人骨肉瘤 U2OS 耐药细胞系对 CDP 的 IC50值。 0020 （5） 耐药细胞系细胞中期染色体标本制备 0021 将处于对数生长期的细胞加入终浓度为 0.01g/mL 的秋水仙素， 37继续培养 1-2h， 将细胞用吸管吹打下来， 细胞悬液转入离心管中1000r/min离心8min， PBS冲洗两次， 加入 37预热的 0.075mol/L 的 KCL， 在 37水浴中低渗作用 11-15min， 逐滴加入 1mL 新 鲜固定液进行预固定， 其中， 新鲜固定液为甲醇与冰醋酸的体积比为 3:1。
27、， 1500r/min 离心 5min， 弃上清加入10mL固定液， 轻轻混匀， 室温固定30min， 1500r/min离心5min， 重复一次， 弃上清， 视沉淀细胞量加入 1 1.5mL 固定液混匀， 将细胞悬液以 30cm 高度滴于预冷的载 玻片上， 室温晾干， Giemsa 染液染色 5min， 流水冲洗， 晾干， 置于显微镜下观察。 0022 （6） 耐药细胞系增殖能力的变化 0023 选取生长至 70% 80% 的 U2OS 敏感细胞及耐药细胞系细胞， 每种细胞分别接种到 7 个 96 孔板中， 每种细胞设置 6 个复孔， 在每个孔中加入相应细胞所需的不含药物的培养 基， 在接种。
28、后的第 1 天， 用 MTT 法计算第一块板子的每种细胞的细胞数目， 第 2 天计算第二 块板子中的各种细胞数目， 以此类推直至完成每种细胞的 7 天生长情况检测， 绘制成图， 即 为相应各个敏感及耐药水平细胞的生长曲线。 0024 （7） Real-time PCR 检测可能参与 U2OS 对顺铂耐药基因的表达情况 0025 细胞总 RNA 的提取 0026 采用 TRIzol Reagent（Invitrogen Cat.No.15596-018）总 RNA 提取试剂， 按说 明书提供方法分别提取 U2OS 敏感及耐药细胞系的总 RNA， 分别取上述几种细胞， 用浓度为 0.01M 的 P。
29、BS 冲洗 3 次， 加入适量 TRIzol Reagent， 室温放置 5min 裂解细胞， 吹打均匀后以 1mL/ 管分装至 1.5mL Eppendorf 管中。每管加入 0.2mL 氯仿， 剧烈震荡 15s， 室温放置 2 3min， 4、 12000r/min 离心 15min， 将上层水相移至干净 Eppendorf 管中， 加入 0.5mL 异丙 醇， 轻轻混匀， 室温放置 10min， 4、 7500r/min 离心 10min。弃上清， 75% 乙醇洗涤 RNA 沉 淀， 7500r/min 离心 5min， 室温干燥 RNA 沉淀， 5 10min 后溶于适量 DEPC 水。
30、。质量分数为 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性， 应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定 量测定。 0027 RNA 逆转录为 cDNA 0028 利用 Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit（Roche） 试剂盒将提取 的细胞 mRNA 逆转录为 cDNA。 0029 Real-time PCR 0030 应用 Primer3.0software 设计并合成基因特异性引物， 将 qPCR 反应体系加入 96 孔板中， 在 Roche LightCycler480 型荧光定量 PCR 仪 SYBR Green I/H。
31、RM Dye（465-510） 系统下运行， 每一样本测量 3 次， 94 4min ； 94 30s， 60 30s， 72 30s， 共 45 个循环 ； 基 因扩增水平以-actin为内参进行比较， 计算不同实验的数据平均值标准差， 应用SPSS 软件进行统计学分析。 0031 制备顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 103898057 A 7 4/7 页 8 0032 （1） 耐药浓度设定 0033 细胞培养 ； 0034 测定敏感的肿瘤细胞对药物的 IC50值 ； 0035 耐药起始的最低浓度从低于 IC50一个数量级开始， 递。
32、增的梯度依次是前一个浓度 的 3 倍。 0036 （2） 耐药细胞的培养 0037 从耐药起始的最低浓度开始， 维持培养细胞， 如果细胞形态、 生长速度、 细胞对 CDP 的 IC50值等方面无明显变化， 提高药物浓度， 进行下一药物浓度耐药细胞的培养， 如此进行 不同浓度耐药细胞系的建立， 此过程中观察加药初始阶段细胞的变化， 如果细胞大量死亡 到无法耐受的程度， 说明设定的浓度过高， 需要适当降低药物浓度。 0038 （3） 耐药细胞的检测 0039 细胞形态学分析 0040 耐药细胞耐药指数测定 0041 采用MTT比色法检测人骨肉瘤U2OS耐药细胞系对顺铂的IC50值， 所得各耐药细胞。
33、 系的 IC50值与敏感细胞系的 IC50值的比值即为耐药指数。 0042 细胞中期染色体标本制备 0043 双微体是细胞中位于染色体外、 小的、 成对存在的无着丝粒、 无端粒的染色质小 体， 是癌基因和耐药基因重要载体， 收集不同程度的耐药细胞的染色体标本， 分析顺铂耐药 是否引起细胞遗传学水平的改变。 0044 细胞生长曲线， 分析各耐药细胞增殖的变化 0045 耐药基因检测 0046 收集稳定耐药五个月后的细胞， 提取细胞的RNA， 应用Real-time PCR， 对参与细胞 摄入与排出顺铂、 顺铂在细胞内的代谢、 细胞对顺铂所致损伤的应答等主要通路的关键基 因进行检测。 0047 本。
34、发明的有益效果 ： 0048 本发明建立了耐受不同浓度顺铂的骨肉瘤 U-2OS 耐药细胞系， 为后期顺铂耐药机 制的研究提供了良好的体外模型。 附图说明 0049 图 1 为 U2OS 敏感细胞和不同浓度顺铂耐药细胞形态图 ； 其中， A ： U2OS ； B ： U2OS/CDP310-8M ； C ： U2OS/CDP10-7M ； D ： U2OS/CDP310-7M ； E ： U2OS/CDP10-6M ； F ： U2OS/ CDP310-6M ； 0050 图 2 为 U2OS 敏感和不同浓度顺铂耐药细胞的细胞遗传学水平改变的中期染色 体标本图， 其中， A ： U2OS ； B。
35、 ： U2OS/CDP310-8M ； C ： U2OS/CDP10-7M ； D ： U2OS/CDP310-7M ； E ： U2OS/CDP10-6M ； 0051 图 3 是 U2OS 敏感和不同浓度顺铂耐药细胞的增殖能力改变的细胞生长曲线图 ； 0052 图 4 是 U2OS 敏感和不同浓度顺铂耐药细胞可能涉及的耐药基因表达变化 Real-time PCR 柱状图。 说 明 书 CN 103898057 A 8 5/7 页 9 具体实施方式 0053 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何。
36、限制。本领域技术人员 应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0054 实施例 1 制备一种顺铂耐药骨肉瘤 U2OS 细胞系 0055 1、 细胞培养 0056 以人骨肉瘤U2OS细胞系为研究对象， 人骨肉瘤U2OS细胞系购自上海细胞库， 顺铂 购自 Hospira Australia Pty Ltd。细胞培养用含 10% 胎牛血清的 IMDM 培养基， 不含青霉 素、 链霉素的环境下， 于体积分数为 5% 的 CO2、 37条件下常规培养。耐药细胞至少连续培 养 5 个月后进行实验指标分析。顺。
37、铂原液分装 -80保存， 使用时用质量分数为 0.9% 的生 理盐水稀释至相应的浓度。 0057 2、 细胞耐药浓度的确定 0058 用 MTT 比色法检测， 对初始耐药浓度进行确定。具体方法如下 ： 取生长状态良好 的细胞， 用 0.01M 的 PBS 缓冲液冲洗， 用质量分数为 0.25% 胰酶消化之后进行稀释， 计数， 将 稀释的细胞悬液以2000细胞/孔的细胞密度种入各孔中， 细胞贴壁后加入设置浓度梯度的 CDP， 此后再培养72h， 之后经换液， 读数， 计算后得出细胞系对CDP的IC50值。 以低于此值的 810倍浓度的CDP对细胞进行耐药。 观察细胞的生长速度及状态， 待其生长稳。
38、定后 （一个 月左右） 进行下一数量级浓度的耐药培养。 0059 实验测得人骨肉瘤 U2OS 敏感细胞系对 CDP 的 IC50值为 3.819107M， 故耐药起始 浓度为310-8M。 以3倍递增为一个浓度梯度。 最终确定的耐药细胞系为U2OS/CDP310-8M、 U2OS/CDP10-7M、 U2OS/CDP310-7M、 U2OS/CDP10-6M 等。 0060 3、 细胞形态学分析 0061 在细胞培养的过程中， 应用光学倒置显微镜密切观察并记录耐药过程中细胞形态 学的改变。 0062 U2OS 敏感细胞置显微镜下观察到细胞贴壁生长， 体积中等， 大小均匀， 细胞呈椭圆 形或不规。
39、则形， 胞质较少， 细胞核较大， 核仁清晰。U2OS/CDP 耐药细胞在光镜下观察， 细胞 贴壁生长， 与敏感细胞相比， 耐药细胞变得更加细长， 细胞呈椭圆形、 梭形或不规则形， 细胞 核、 胞质增大， 多核仁现象增多， 并且随耐药浓度增加细胞内空泡量增加。高浓度耐药细胞 不规则形状程度严重， 细胞将相互交织形成网状 （如图 1 所示， 150 倍镜下图片） 。 0063 4、 细胞耐药指数分析 0064 采用 MTT 比色法检测人骨肉瘤 U2OS 耐药细胞系对 CDP 的 IC50值。所得各耐药细 胞系的 IC50值与敏感细胞系的 IC50值的比值即为耐药指数 （Resistance Ind。
40、ex,RI） 。 0065 与敏感细胞相比， 耐药细胞对顺铂敏感性的改变及耐药指数分析， 如表 1 所示。与 敏感细胞相比， 耐药细胞系对 CDP 的 IC50值增高， 并且随着药物浓度的升高， 细胞对 CDP 的 敏感性下降， 对药物的耐受能力增强。说明耐药细胞系已经稳定建成。 0066 表 1U2OS 敏感和耐药细胞系的 IC50值以及耐药细胞系的耐药指数 说 明 书 CN 103898057 A 9 6/7 页 10 0067 0068 a: 耐药指数 = 耐药细胞的 IC50值 / 敏感细胞的 IC50值 0069 5、 本发明耐药细胞系细胞中期染色体标本制备 0070 为了解耐药细胞。
41、遗传学水平的改变， 制备各细胞的中期染色体标本。将处于对数 生长期的细胞加入终浓度为 0.01g/mL 的秋水仙素， 37继续培养 1-2h， 将细胞用吸管吹 打下来， 将细胞悬液转入离心管中 1000r/min 离心 8min， PBS 冲洗两次， 加入 37预热的 0.075mol/L 的 KCL， 在 37水浴中低渗作用 11-15min， 逐滴加入 1mL 新鲜固定液 （甲醇 : 冰 醋酸 =3:1） 进行预固定， 1500r/min 离心 5min， 弃上清加入 10mL 固定液， 轻轻混匀， 室温固 定 30min， 1500r/min 离心 5min， 重复一次， 弃上清， 加入。
42、适当固定液混匀， 将细胞悬液以一 定高度滴于预冷的载玻片上， 室温晾干。Giemsa 染液染色 5min， 流水冲洗， 晾干。置于显微 镜下观察， 拍照， 如图 2 所示， 可观察到骨肉瘤 U2OS 敏感和耐药细胞系的染色体高度不稳 定。 0071 6、 本发明耐药细胞系增殖能力的变化 0072 绘制本发明耐药细胞系细胞生长曲线。选取生长至 70% 80% 的敏感及各个耐药 梯度的细胞， 每种细胞分别接种到 7 个 96 孔板中， 每种细胞设置 6 个复孔。在每个孔中加 入相应细胞所需的培养基 （不含药物） 。在接种后的第 1 天， 用 MTT 法计算第一块板子的每 种细胞的细胞数目。第 2 。
43、天计算第二块板子中的各种细胞数目， 以此类推直至完成每种细 胞的 7 天生长情况， 绘制成图， 即为相应敏感及各个耐药水平细胞的生长曲线。 0073 如图 3 所示， 以培养时间为横坐标， 细胞培养 1 7 天的吸光度值为纵坐标， 绘制 生长曲线， 可见耐药细胞的增殖能力随着耐药浓度的增加而逐渐降低。 0074 7、 Real-time PCR 检测可能参与 U2OS 对顺铂耐药产生基因的表达 0075 （1） 细胞总 RNA 的提取 0076 采用TRIzol Reagent (Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂， 按说明 书提供方法分别提取 U2OS 。
44、敏感及耐药细胞系的总 RNA。分别取上述几种细胞， 0.01M PBS 冲洗 3 次， 加入适量 TRIzol Reagent， 室温放置 5min 裂解细胞， 吹打均匀后以 1mL/ 管分装 至 1.5mL Eppendorf 管中。每管加入 0.2mL 氯仿， 剧烈震荡 15s， 室温放置 2 3min， 4、 12000r/min 离心 15min。将上层水相移至干净 Eppendorf 管中， 加入 0.5mL 异丙醇， 轻轻混 匀， 室温放置10min， 4、 7500r/min离心10min。 弃上清， 75%乙醇洗涤RNA沉淀， 7500r/min 离心 5min。室温干燥 RN。
45、A 沉淀， 5 10min 后溶于适量 DEPC 水。质量分数为 1.0% 的琼脂 糖凝胶电泳检测 RNA 样本的完整性， 应用 Bio-Photometer 对提取的 RNA 进行定量测定。 0077 （2） RNA 逆转录为 cDNA 0078 利用 Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit（Roche） 试剂盒将提取 的细胞 mRNA 逆转录为 cDNA。 0079 （3） Real-time PCR 说 明 书 CN 103898057 A 10 7/7 页 11 0080 应用 Primer3.0software 设计并合成基因特异性引。
46、物。所有引物由 Invitrogen 公司合成。将 qPCR 反应体系加入 96 孔板中， 在 Roche LightCycler480 型荧光定量 PCR 仪 SYBR Green I/HRM Dye(465-510)系统下运行。 每一样本测量3次， 按照说明书提供的最佳 反应条件， 944min ； 9430s， 6030s， 7230s， 共45个循环 ； 基因扩增水平以-actin 为内参进行比较， 计算不同实验的数据平均值 标准差， 应用 SPSS 软件进行统计学分析。 结果如图 4 所示。 0081 结果显示 （1） 与药物在细胞内的积累相关的基因 hCTR1， ATP7A 与顺铂。
47、各浓度耐药 细胞都有明显的相关性， 而ATP7B仅在U2OS/CDP10-7M、 和U2OS/CDP10-6M细胞中略微升高 （p 值分别为0.037和0.035） ； ABCC2基因仅在U2OS/CDP310-7M耐药细胞中表现出统计学意义 （p=0.018） ， 这表明耐药细胞对顺铂摄入是主要通过 hCTR1， 而介导耐药细胞外排顺铂的主 要是 ATP7A 基因的表达产物。 （2） 顺铂代谢相关基因 ： -GSH 是谷胱甘肽合成的限速酶， 检 测结果发现其表达与各浓度耐药细胞明显相关， 表明耐药细胞对顺铂的解毒能力增强。 （3） 与顺铂所致损伤修复相关的基因 ： 损伤修复通路基因检测分析发。
48、现非同源末端连接通路的 关键基因 XRCC4 的表达与耐药细胞呈高度相关性 ； MSH3 基因的表达也表现出明显的差异， 表明非同源末端连接和错配修复在 U2OS 对顺铂的耐药中发挥重要作用。然而， 对核酸切除 修复基因的检测发现， 该修复通路的基因 XPA、 XPF 在敏感和耐药细胞间表达存在差异， XPD 基因仅在 U2OS/CDP310-7M 耐药细胞中存在差异表达 ； 对该通路关键基因 ERCC1 的表达分 析未检测到敏感和耐药细胞表达的差异， 究其原因还要进一步研究分析。另外， PDZK1 是文 献中报道的顺铂耐药标志， 在我们的耐药细胞中也检测到该基因与各浓度耐药细胞之间表 达的明显差异， 这也进一步表明我们耐药细胞已成功建立。 说 明 书 CN 103898057 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103898057 A 12 2/2 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103898057 A 13 。