一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法.pdf

本发明涉及一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，属于植物保护和生物技术领域。本发明的技术方案是保持目前基因克隆与表达的方法，如引物设计、PCR扩增、real-time PCR、连接、转化、蛋白表达均与常规相同，不同的是该基因为稻瘟病菌侵染水稻后期高度表达的基因，与前人研究的稻瘟病菌基因多为稻瘟病菌侵染早期高度表达的基因有区别，其编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa，其体外表达产物按照0.5mg/ml～2.5mg/ml的浓度直接接种到致伤的丽江新团黑谷水稻叶片后能引起水稻叶片产生病斑。本发明比传统稻瘟病菌致病性测定方法简便、快速。

1、  一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，保持目前基因克隆与表达的方法，包括引物设计、PCR扩增、real-time PCR、连接、转化、蛋白表达方法均与常规相同，其特征在于该基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa，其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下：
ATGAAGTTCTCTGCCGCCCTTTTGACCACCATCACCGCCACCGGC
GCCAACGCTCTCTGGTTCGTGCCGCCTCAATATACGACCAATCAAC
ACCTCCAGACTTATTTCCGAGCCTATCCCGGGTGTGTTGCGCATTG
CGAGACATGGTCTAAGTCCTCACAAGGCGGTAGAATGACAAACAT
CGCCACCATTCAAGCCAATTGCCAAGCCGAGTGCAACACAATCTT
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该基因的体外表达产物按照0.5mg/ml～2.5mg/ml浓度直接接种到致伤的水稻叶片后引起水稻叶片致伤点周围产生褐色斑点。

2、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：进行PCR扩增的引物序列为：
P04-F：5’-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3′
P04-R：5’-CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3′。

3、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：real-time PCR扩增的引物序列为：
NIP04-F：5′-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3’；
NIP04-R：5′-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3’。

4、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：体外表达产物按照0.50mg/ml的浓度接种丽江新团黑谷水稻品种的致伤叶片。

5、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：体外表达产物按照1.11mg/ml的浓度接种丽江新团黑谷水稻品种的致伤叶片。

6、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：体外表达产物按照1.51mg/ml的浓度接种丽江新团黑谷水稻品种的致伤叶片。

7、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：体外表达产物按照2.02mg/ml的浓度接种丽江新团黑谷水稻品种的致伤叶片。

8、  根据权利要求1所述的一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，其特征是：体外表达产物按照2.5mg/ml的浓度接种丽江新团黑谷水稻品种的致伤叶片。

一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种稻瘟病菌侵染后期高度表达的基因及其编码产物的体外功能检测的方法，属于植物保护和生物技术领域。
背景技术：
稻瘟病菌是研究较多植物致病真菌，其侵染过程始于分生孢子着落到寄主表面，分生孢子依靠顶端的胶状物紧紧粘着在植物组织表面，在有水滴的条件下很快萌发形成发芽管，并分化出附着胞。形成强大的压力使侵入栓能够直接穿透寄主组织的角质层。成功侵入后，侵染菌丝就大量生长，分化出多胞有分枝的菌丝体，在植物细胞内和细胞间延伸，最后形成病斑，产生分生孢子，开始新的侵染。
在侵染过程中，水稻和稻瘟病菌都有大量的基因参与。仅病菌方面，就包括大类基因：第一类是与侵染有关的形态分化过程信号识别基因；第二类是与毒性相关的毒性决定因子和无毒基因，第三类是与病菌侵染水稻组织后定殖扩展相关的基因。关于侵染早期的基因研究得较多，识别疏水信号的MPG1、PTH11基因，进行信号传递的CPKA，MAC1、MAGB，PMK1，MST7和MST11等基因，参与黑色素合成的ALB1、BUF1和RSY1基因，附着胞膨压形成的PTH2基因，侵入栓形成的PLS1、MST12，MPS1、GAS1、PDE1、CYP1等基因，此外还有一些无毒基因，包括PWL2，AVR1-CO39，AVR-Pita，ACE等。对于稻瘟病菌感染建立后在寄主组织内定殖发展阶段的基因调控则研究得还不多。仅有P型ATP酶基因PDE1和MgAPT2基因，MHP1与Woronin体形成的HEX1，而且其与病原菌在寄主体内扩展的机制还不不清楚。我们从含有信号肽的小蛋白中，发现了一个表达产物能够在水稻叶片上引起坏死斑的基因，通过RT-PCR检测，表明其在感染的第四天达到最高，其表达量变化的特征表明该基因主要在侵染的后期大量表达，可以作为稻瘟病病斑的形成和致病基因的研究的候选基因。
目前，参与稻瘟病菌侵染早期的相关基因的研究已经取得了长足的发展，而对稻瘟病菌侵染后期表达的基因却研究得较少。而且以往采用传统的将稻瘟病菌株喷雾接种水稻叶片，10天后观察叶片表型变化的致病性测定方法，这种方法容易受到气候、以及人为条件等环境因子的影响，现在还没有一种直接用基因的原核表达产物接种致伤水稻叶片，以快速测定基因是否是致病基因的方法。
发明内容：
本发明的主要目的是克服现有传统稻瘟病菌致病性测定方法的不足，提供一种快速、简便和准确的测定方法。
本发明的技术方案是保持目前基因克隆与表达的方法，包括引物设计、PCR扩增、real-time PCR、连接、转化、蛋白表达方法均与常规相同，其特征在于该基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa，其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下：
ATGAAGTTCTCTGCCGCCCTTTTGACCACCATCACCGCCACCGGCGC
CAACGCTCTCTGGTTCGTGCCGCCTCAATATACGACCAATCAACACCT
CCAGACTTATTTCCGAGCCTATCCCGGGTGTGTTGCGCATTGCGAGAC
ATGGTCTAAGTCCTCACAAGGCGGTAGAATGACAAACATCGCCACCA
TTCAAGCCAATTGCCAAGCCGAGTGCAACACAATCTTTGAAATTGGT
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该基因的体外表达产物按照0.5mg/ml～2.5mg/ml浓度直接接种到致伤的丽江新团黑谷水稻叶片后能引起水稻叶片产生病斑，这种测定方法比传统瘟病菌致病性测定方法简便、快速。
PCR扩增的引物序列为：
P04-F：5′-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3′
P04-R：5’-CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3′
real-time PCR扩增的引物序列为：
NIP04-F：5′-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3’
NIP04-R：5′-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3’
本发明的有益效果是该基因为稻瘟病菌侵染水稻后期高度表达的基因。采用其表达产物直接接种到致伤水稻叶片上，可直接定性地获得水稻的抗感和与蛋白互作的情况，克服了传统致病性测定方法周期长、环境因子影响大等弊端，最终达到为今后稻瘟病菌致病性测定提供简便有效的方法的目的。具体表现在以下两点：1.该基因为稻瘟病菌侵染水稻后期高度表达的基因，与前人研究的稻瘟病菌基因多为稻瘟病菌侵染早期高度表达的基因有区别。2.体外表达产物直接接种到水稻叶片上，两天后能直接观察到水稻叶片的表型变化，定性获得蛋白与水稻互作的情况，克服了传统致病性测定周期长、环境因子影响大等弊端。
具体实施方案：
实施例一：
基因的编码产物是小蛋白，由88个氨基酸组成，相对分子量为8.8kDa，其编码基因的核酸序列和氨基酸序列如下：
ATGAAGTTCTCTGCCGCCCTTTTGACCACCATCACCGCCACCGGCGC
CAACGCTCTCTGGTTCGTGCCGCCTCAATATACGACCAATCAACACCT
CCAGACTTATTTCCGAGCCTATCCCGGGTGTGTTGCGCATTGCGAGAC
ATGGTCTAAGTCCTCACAAGGCGGTAGAATGACAAACATCGCCACCA
TTCAAGCCAATTGCCAAGCCGAGTGCAACACAATCTTTGAAATTGGT
CAATAA
MKFSAALLTTITATGANALWFVPPQYTTNQHLQTYFRAYPGCVAHCET
WSKSSQGGRMTNIATIQANCQAECNTIFEIGQ
PCR扩增的引物序列为：
P04-F：5’-CGCGGATCCATGAAGTTCTCTGCCGCCC-3′
P04-R：5’-CGCGTCGACTTATTGACCAATTTCAAAG-3′
real-time PCR扩增的引物序列为：
NIP04-F：5′-GTGCCGCCTCAATATACGAC-3’
NIP04-R：5′-ACCGCCTTGTGAGGACTTAG-3’
将该基因的表达产物于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4；200mM NaCl；1mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是将该基因的原核表达产物按照0.5mg/ml的浓度接种到水稻品种丽江新团黑谷的致伤叶片上。对照是将空载体的原核表达产物按照0.5mg/ml的浓度接种到致伤的水稻叶片上，两天后观察水稻叶片表型变化，结果见表1
表1基因原核表达产物接种丽江新团黑谷水稻品种致伤叶片48小时表型变化