一种检测凝血酶原基因多态性的试剂盒、方法及用途.pdf

本发明涉及含有用PCR方法检测凝血酶原基因多态性的特异性引物、探针的试剂盒，以及该试剂盒检测凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型的荧光定量聚合酶链式反应方法和在预测血栓性疾病发生风险中的用途。属于医药领域。

1.  一种荧光定量聚合酶链式反应方法检测凝血酶原基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的特异性引物、探针和检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的特异性引物、探针。

2.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的
正向引物为：5’-CCGCTGGTATCAAATGGG-3’；
反向引物为：5’-CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3’。

3.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的
野生型探针为：VIC-CTCAGCGAGCCTCAATG-MGB；
突变型探针为：FAM-CTCAGCAAGCCTCAATG-MGB。

4.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，含有PCR反应混合液和Taq DNA聚合酶。

5.  如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶的含量为1-10U/ul，优选5U/ul。

6.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，含有凝血酶原基因G20210A多态性位点野生型和突变型的阳性对照。

7.  如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照选自基因组DNA、RNA或者克隆到载体上的DNA片段。

8.  应用权利要求1-7所述的试剂盒检测凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型的荧光定量聚合酶链式反应方法。

9.  如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的基因扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。

10.  如权利要求1-7所述的试剂盒在预测血栓性疾病发生风险中的用途。

一种检测凝血酶原基因多态性的试剂盒、方法及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种凝血酶原基因多态性的检测试剂盒、方法和用途。更具体的，本发明涉及通过聚合酶链式反应方法，提供一种分析编码凝血酶原的基因位点多态性的试剂盒、方法和用途。
背景技术
先天性血栓性疾病也称遗传性血栓形成倾向，是由于凝血，抗凝和纤溶系统某个环节的特异性障碍而引起的一类疾病，以复发性静脉血栓为主要临床表现，大多属先天遗传性，常首发于青少年时期。据西欧部分地区统计，发病率在20/100000以上，超出先天性出血性疾病。
继发于一些疾病的高凝状态和血栓形成与原发于凝血、抗凝血机理缺陷的先天性血栓性疾病不同，常表现为止血，抗血栓机理非特异性，多环节的变化，病因多数是复合性的。生理或一些体外的因素也可导致高凝状态，如高龄、妊娠、产后、剧烈运动、情绪激动、寒冷、吸烟、高脂饮食、药物(口服避孕药)等。不少内科疾病引起的高凝状态和血栓形成包括：①肿瘤；②自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎，Behcet综合征；③内分泌及代谢性疾病：糖尿病、肾上腺皮质功能亢进；④肾脏疾病：肾病综合征；⑤肝脏疾病；⑥心、脑血管疾病：心绞痛、心肌梗塞、脑血栓、脑栓塞、短暂性脑缺血、闭塞性脉管炎，原发性高血压；⑦血液病：弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓增生综合征；⑧肺部疾病：肺栓塞、慢性阻塞性肺炎、成人呼吸困难综合征；⑨高粘血症：白血病、红细胞增多症镰形红细胞病、高免疫球蛋白血症；⑩高脂血症。
静脉血栓形成(venous thrombosis，VT)在发达国家年发病率1‰，且随年龄增长呈递增现象。儿童的发病率1/10万，老年人接近1％。静脉血栓形成多发生在下肢深静脉，与其相关的主要并发症是血栓后遗综合征及致死性的肺动脉栓塞，发生率分别是20％及1％～2％。我国尚缺乏大规模血栓流行病学的调查资料。从近些年我科收治的病人来看，静脉血栓形成是常见病、多发病。研究证明，凝血因子的基因多态性与血栓形成密切相关。静脉血栓是一种多因子疾病，既有遗传因素，又有后天获得的一些危险因素。因子V和因子II(凝血酶原)是两种最常见的影响家族性血栓形成倾向的因子，家族性血栓形成倾向是一种威胁健康甚至造成死亡的疾病。用常规临床检测方法通常很难发现静脉血栓，但是，对于有家族史以及有其他严重疾病的患者，通过遗传预置筛查检测有关致病因子，可能是预防这类疾病的一种合适途径。
凝血酶原基因(F2)定位于人类第11号染色体(11p1-q12)短臂上，其编码的蛋白在应对伤害的凝血过程中发挥着重要的作用。F2编码的蛋白凝血酶原在凝血因子X和凝血因子V、磷酸酯以及钙离子的激活作用下转化成凝血酶并且帮助引发凝血链级反应。
凝血酶原基因最常见的突变发生在3′未翻译端区域，具体的位置是碱基对20210的碱基G→A的置换。这一突变增加了F2mRNA转录翻译的效率，其结果就是凝血酶原转录数量的增加，而这将有利于功能性凝血酶原蛋白的翻译表达，最终会导致高凝状态。凝血酶原(20210G→A)的突变不论是杂合子和纯合子均表现为半显性，会导致静脉栓塞的发生以及复发的风险的增加。由凝血酶原(20210G→A)杂合突变在没有其他先天遗传易感因素或者后天的环境易感因素的条件下导致的静脉栓塞的相对危险度是非突变体的2-4倍。
凝血酶原常见的基因多态性为单核苷酸基因多态性(SNP)，即同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定可靠的高通量的检测凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型的试剂盒、方法和用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
应用凝血酶原基因多态性位点的特异性引物和探针对样本DNA进行聚合酶链式反应，同时进行荧光标记探针荧光信号的扫描判定基因型的一种检测凝血酶原基因基因型的试剂盒，该试剂盒包含检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的基因特异性引物和探针。
其中，检测凝血酶原基因多态性位点的正向引物为：5’-CCGCTGGTATCAAATGGG-3’；反向引物为：5’-CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3’。
检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的野生型探针为：VIC-CTCAGCGAGCCTCAATG-MGB；突变型探针为：FAM-CTCAGCAAGCCTCAATG-MGB。
本发明提供的试剂盒，还可以含有PCR反应混合液和Taq DNA聚合酶等PCR应用试剂。其中，PCR反应混合液含有100mM Tris-HCl、100mM KCl、5.0uM MgCl₂、0.4mMdATP、0.4mM dCTP、0.4mM dGTP、0.4mM dTTP；Taq DNA聚合酶的含量为1-10U/ul，优选5U/ul。
本发明提供的试剂盒，还可以含有凝血酶原基因G20210A多态性位点野生型和突变型的阳性对照。阳性对照选自基因组DNA、RNA或者克隆到载体上的DNA片段，其中载体为质粒载体。
同时，本发明还提供应用检测凝血酶原基因的试剂盒检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的方法。
其中，检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的基因扩增程序为：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
其中，检测凝血酶原基因多态性位点的正向引物为：5’-CCGCTGGTATCAAATGGG-3’；反向引物为：5’-CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3’。检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的野生型探针为：VIC-CTCAGCGAGCCTCAATG-MGB；突变型探针为：FAM-CTCAGCAAGCCTCAATG-MGB。
同时，本发明又提供检测凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型的试剂盒在预测血栓性疾病风险中的用途。其中，血栓性疾病包括静脉血栓栓塞性疾病和动脉血栓栓塞性疾病。
其中，检测凝血酶原基因多态性位点的正向引物为：5’-CCGCTGGTATCAAATGGG-3’；反向引物为：5’-CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3’。检测凝血酶原基因G20210A多态性位点的野生型探针为：VIC-CTCAGCGAGCCTCAATG-MGB；突变型探针为：FAM-CTCAGCAAGCCTCAATG-MGB。
检测凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型的试剂盒在预测血栓性疾病风险中的用途中，当样本G20210A多态性位点基因型为AA纯合突变型，提示患者血栓性疾病的风险高，应该提前进行生活干预和药物干预，以延缓和减轻血栓形成的风险；当样本G20210A多态性位点基因型为杂合型，提示患血栓性疾病的风险较高，应该提前进行生活干预和药物干预，以延缓和减轻血栓形成的风险；当样本G20210A多态性位点基因型为野生型，发生血栓性疾病的风险较杂合型和变异型较小，应该警惕，进行生活干预。
本发明检测样本基因型的步骤为：
1.样本处理
2.样本如果为DNA样本，则需要测定样本的浓度，并将样本浓度调整至合适的范围。
如果样本为RNA则需要转录成为cDNA。
3.配置PCR反应混合物：PCR反应混合液：2.5ul；
                     引物+探针：1ul；
                     H2O：6.5ul；
                     总计：10ul。
4.F2基因片段的扩增
PCR反应程序如下
94℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
3.目的基因多态性荧光扫描和基因型判定
在ABI 7900仪器或者类似的仪器上扫描荧光类型，使用SDS软件分析扫描结果。根据阳性对照的扫描结果和荧光扫描结果判定样本的基因型。
4.个体发生血栓性疾病风险的预测
根据基因型进行患者血栓形成危险的预测。具体的，如果基因型为F2第20210G→A纯合突变型，则血栓形成的危险远远高于野生型。
本发明的生物样品选自DNA样本，RNA样本以及人工合成的寡核苷酸样本。
本发明所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
本发明提供的试剂盒可以具体地含有：
1、PCR反应试剂，具体包括：
(1)引物，包括针对凝血酶原基因基因不同多态性位点的正向引物和反向引物，它们能扩增含有凝血酶原基因基因特定突变位点的基因片断；
(2)2×PCR反应混合液：1.0ml[100mM Tris-HCl，100mM KCl，pH8.3(20℃)]；5.0uMMgCl₂；各0.4mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸水配制，pH 7.0；
(3)Taq DNA聚合酶(5U/ul)；Taq酶保存缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mMKCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％NP40，0.5％(v/v)，Tween 20，50％甘油；
(4)dNTP
(5)Mg²⁺
(6)PCR用水：灭菌的双蒸水或者注射用水。
2、特异性的荧光标记的探针
探针5’端的标记荧光基团可以是FAM、ROX、TET、HEX、TAMRA、CY3、CY5、JOE、Texas red等中间的一种，3’端的标记基团可以是TAMRA，NFQ中的一种。
3、标准品，包括阳性对照，即分别含有凝血酶原(F2)基因G20210A多态性位点的野生型质粒DNA和突变型质粒DNA。阴性对照：经DNAase I处理的双蒸水。
本发明的优点是：以特异性引物5’-CCGCTGGTATCAAATGGG-3’、5’-CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3’和探针VIC-CTCAGCGAGCCTCAATG-MGB、FAM-CTCAGCAAGCCTCAATG-MGB为核心，在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型的试剂，并提供一种通过检测PCR扩增生物核酸样品检测凝血酶原基因G20210A多态性的试剂盒、试剂盒通过检测生物样品确定该生物样品凝血酶原基因G20210A多态性，以及通过检测生物样品预测血栓性疾病发生风险的用途。本发明PCR模板制备方法操作简单，无需特殊设备，PCR扩增后采用检测荧光信号的方法直接检测PCR产物从而得到基因型结果，不涉及到如电泳的污染和对于环境可能造成的污染，而且大通量高效率，准确性高，特别适合临床和科研的大规模人群使用，应用广泛。根据凝血酶原基因G20210A多态性结果对血栓性疾病发生风险进行预测。本发明可以提前通过特定基因型的分析预测血栓性疾病发生的风险，从而可以提前干预，指导临床用药，预防和提前干预影响血栓性疾病发生的因素，降低血栓性疾病的发生率，减少医疗成本。
本发明特别针对凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型设计了PCR扩增引物和探针，与常规的扩增引物和探针相比较，扩增效率高、特异性好、省时，能够直接根据PCR产物的片段大小鉴定该位点的基因型，无需后续的检测步骤和相应的试剂、设备，有更好的使用价值。
附图说明
图1是凝血酶原基因G20210A阳性对照质粒构建过程中基因片段PCR结果
M：100bp Ladder；1：PCR结果
图2是20个患者凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型荧光扫描的结果。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施方式
实施例1
下面以凝血酶原基因G20210A阳性对照质粒为实施例对本发明做进一步的详细阐述。
1.引物和模板
基因片段扩增使用下列引物：
正向引物为：5’-CCGCTGGTATCAAATGGG-3’；
反向引物为：5’-CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3’。
模板采用人类基因组DNA(编号AI011611，浓度15ng/μl)
2.基因片段扩增
配置PCR扩增混合物：
模板(1515ng/μl)：3μl；
10×PCR buffer(-MgCl₂)：1μl；
50mM MgCl₂：0.3μl；
10mM dNTP：0.2μl；
20μM引物混合物：0.2μl；
5U/μl Taq酶：0.05μl；
无菌双蒸水：5.25μl；
Total：10μl。
PCR扩增条件为：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
PCR扩增后的结果见附图1。
3.PCR产物纯化
1).PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察条带位置，切胶称重。
2).采用德国MN公司Nucleospin Extract II胶纯化试剂盒纯化PCR产物，最终用40μl洗提液洗脱。
4.AT克隆
采用Promega公司的pGEM-Teasy kit试剂盒进行AT克隆，按照说明书操作。
配置连接体系：
Teasy vector：1μl；
2×连接缓冲液：5μl；
T4DNA连接酶：1μl；
纯化后的PCR产物：1μl；
无菌双蒸水：2μl。
4℃连接过夜。
5.连接产物的转化
1).取5μl连接产物，加入100μl DH5a感受态细菌，轻轻混匀冰上静置20分钟。
2).将混合物在42℃循环水浴热休克90秒，置于冰上2分钟。
3).混合物中加入1ml 37℃预温的LB培养液，37℃振荡(180rpm)培养1小时。
4).将200μl转化产物涂于含有100mg/ml氨苄青霉素的LB培养板(含1mol/lIPTG 4μl，20mg/ml X-gal 40μl)上，37℃倒置培养10h。
5).从LB培养板上挑取白色菌落，接种于2ml含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡(250rpm)培养过夜。
6.阳性质粒的鉴定
1).阳性质粒的酶切鉴定
取1ml菌液，碱裂解法小提质粒，加20μl无菌双蒸水溶解。用EcoRI进行酶切鉴定，配制酶切体系：10×buffer H：1μl；
EcoR I(12U/μl)：0.3μl；
质粒：1μl；
无菌双蒸水：7.7μl。
37℃水浴酶切2小时，结果如附图1：从结果可以看出，酶切可以得到200bp大小的酶切片段，证明序列正确。
2).阳性质粒序列测定
由步骤1筛选得到的阳性克隆3送交北京诺赛基因组研究中心进行基因序列测定，测序结果显示，阳性克隆序列和已知凝血酶原基因序列完全一致，证明阳性质粒序列正确。
7.阳性质粒大规模培养和纯化
将筛选得到的阳性克隆接种1L LB培养基中，37℃摇床振荡培养过夜后，采用碱裂解法纯化质粒。低温(-20℃)冻存。
实施例2
下面以有家族性血栓形成倾向的个体的凝血酶原基因多态性基因型检测过程为实施例对本发明作进一步的详细描述。
我们应用本试剂盒检测10个有家族性血栓形成倾向个体的凝血酶原基因基因型，流程如下：
1.样本处理：
由于样本为基因组DNA，采用紫外分光光度计检测样本的DNA浓度，并将DNA浓度稀释至30-100ng/ml
2.凝血酶原基因特异性PCR扩增混合液的配置
配置凝血酶原基因扩增混合液：PCR反应混合液：2.5ul；
                            特异性引物+探针：1ul；
                            H2O：6.5ul；
                            总计：10ul。
3.聚合酶链式反应(PCR)扩增特异性的凝血酶原基因G20210A基因片段：
1)将配制好的PCR反应混合物加入PCR反应管中。
2)凝血酶原基因片段扩增
按照下列条件扩增凝血酶原基因片段
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。
4.PCR反应结果的荧光扫描：
将扩增后的PCR反应管放入ABI 7900HT荧光定量PCR中，使用SDS软件扫描PCR反应结果。扫描结果见附图2。
5.样本基因型的判定
根据荧光扫描结果进行样本基因型判定的标准：根据荧光扫描结果分别判定凝血酶原基因G20210A多态性基因型。具体的基因型判定结果见表1。
具体的判定标准如下
如样本在凝血酶原基因G20210A多态性为GG基因型，则判为野生型；如样本在凝血酶原基因G20210A多态性为GA基因型，则判为杂合型；如样本在凝血酶原基因G20210A多态性为AA基因型，则判为纯合型。
6.根据样本基因型进行血栓性疾病风险的预测和提前干预。
根据上述检测结果，第7号样本为AA纯合突变型，提示患血栓性疾病的风险高，应该提前进行生活干预和药物干预，以延缓和减轻血栓形成的风险；第3号、5号和9号样本为杂合型，提示患血栓性疾病的风险较高，应该提前进行生活干预和药物干预，以延缓和减轻血栓形成的风险；其余样本为野生型，发生血栓性疾病的风险较杂合型和变异型较小，应该警惕，进行生活干预。
表1.10个待检样本的凝血酶原基因G20210A多态性位点基因型

<110>北京华安佛医药研究中心有限公司
     深圳奥萨医药有限公司
<120>一种检测凝血酶原基因多态性的试剂盒、方法及用途
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
ccgctggtat caaatggg            18
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ccagtagtat tactggctct tcctg    25
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
ctcagcgagc ctcaatg    17
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
ctcagcaagc ctcaatg    17