核桃青皮中一种新的酚苷化合物的制备方法和用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610296216.6	申请日：	20160508
公开号：	CN105859805A	公开日：	20160817
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07H15/203,C07H1/08,A61P35/00	主分类号：	C07H15/203,C07H1/08,A61P35/00
申请人：	黑龙江中医药大学
发明人：	周媛媛,武斌,付起凤
地址：	150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和平路24号
优先权：	CN201610296216A
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内容摘要

本发明属于医药技术领域，涉及从核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）的青果皮中提取分离得到具有体外抗肿瘤活性的一种新的酚苷化合物及其制备方法。本发明方法以核桃青皮为原料，经过醇提，大孔树脂富集纯化，硅胶柱层析和凝胶柱层析，再结合制备HPLC纯化得到了一种新的酚苷化合物4‑羟基苯丙酮‑4‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基(1→6)‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷[4‑hydroxypropiophenone‑4‑O‑β‑D‑glucopyranosyl (1→6)‑β‑D‑glucopyranoside]。本发明所涉及的原料容易大量获取，且该新化合物经实验证实对胃癌、肝癌和乳腺癌等细胞均具有较好的抑制作用。

权利要求书

1.一种酚苷化合物，其特征在于，其结构式如式（I）所示：。 2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）醇提：将核桃青皮（来源为核桃楸JuglansmandshuricaMaxim的青果皮）鲜品低温40℃烘干，得到的5kg干燥品为原料，采用乙醇回流提取3次，分别为，第1次用30L60%乙醇提取2.5h，第2次25L60%乙醇提取2h，第3次用20L60%乙醇提取2h，过滤，合并3次滤液，减压回收溶剂，减压干燥，得干膏状提取物；（2）富集纯化：将上述步骤（1）中醇提所得干膏状提取物用水分散至相对密度为1.30±0.05的溶液，经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化，分别以水、20%乙醇、30%乙醇依次洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分；（3）正相硅胶柱分离：将上述步骤（2）中所得30%乙醇洗脱部分进行正相硅胶柱色谱分离，分别以体积配比为8:1、3:1、1:1、和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度淋洗，每一个比例淋洗3.5个柱体积，将其中二氯甲烷-甲醇体积配比为3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂得到分离产物；（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经上述步骤（3）分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱，以甲醇:水=2:3（V/V）洗脱3个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液；收集后面两个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品；（5）制备HPLC分离：将上述步骤（4）中所得粗品采用甲醇溶解进入制备型HPLC，流动相为体积比为32:68的甲醇和水混合溶液，洗脱流速为3mL/min，保留时间t=22.6min～22.8min阶段内收集馏分后，回收干燥即得。 3.权利要求1所述酚苷化合物，4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物方面的应用。 4.根据权利要求3所述的4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为人胃癌肿瘤、人肝癌肿瘤或人乳腺癌肿瘤。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有癌细胞抑制作用的新化合物的制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命的一类疾病，世界卫生组织(WHO)专家预测，至2020年全球人口将达80亿癌症新发病例将达到2000万，将有1200万人死于癌症。癌症已成为危及人类健康的主要杀手。目前为止，肿瘤的常用化疗的治疗方法就是使用抗肿瘤的化学药品对肿瘤患者进行治疗，该法对原发灶，转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用，但缺点也是十分明显的，如对细胞无特异性，有强大的毒副作用，产生抗药性等。所以从理论上讲，化疗不能杀灭体内所有的肿瘤细胞，患者体内总会有残存肿瘤细胞，是其复发，转移的根源。因此开发新的优效药物来满足临床治疗的需要是摆在医药工作者面前一项十分迫切的任务。

经大量的临床报道证实，青龙衣对食道癌胃癌、肝癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤有非常明显的抑制作用，能缓解肿瘤病人的临床症状，减轻其痛苦。但目前对其产生抗肿瘤作用药效物质基础的确定意见尚不一致，亟待构建青龙衣活性成分分子库。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，扩大治疗肿瘤药物的资源、来源，提供一种新的具有肿瘤细胞抑制作用的化合物。

为了达到上述目的，本发明提供了4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其结构式如下：

本发明还提供了4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法：以核桃青皮为原料，依次通过醇提、柱层析制备得到。

上述柱层析依次包括大孔树脂柱、正相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱和制备HPLC。

本发明4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷具体制备步骤如下：

（1）醇提：将核桃青皮（来源为核桃楸Juglans mandshurica Maxim的青果皮）鲜品低温40℃烘干，得到的5kg干燥品为原料，采用乙醇回流提取3次，分别为，第1次用30L 60%乙醇提取2.5h，第2次25L 60%乙醇提取2h，第3次用20L 60%乙醇提取2h，过滤，合并3次滤液，减压回收溶剂，减压干燥，得干膏状提取物；

（2）富集纯化：将上述步骤（1）中醇提所得干膏状提取物用水分散至相对密度为1.30±0.05的溶液，经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化，分别以水、20%乙醇、30%乙醇依次洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分；

（3）正相硅胶柱分离：将上述步骤（2）中所得30%乙醇洗脱部分进行正相硅胶柱色谱分离，分别以体积配比为8:1、3:1、1:1、和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度淋洗，每一个比例淋洗3.5个柱体积，将其中二氯甲烷-甲醇体积配比为3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂得到分离产物；

（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经上述步骤（3）分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱，以甲醇:水=2:3（V/V）洗脱3个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液。收集后面两个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品；

（5）制备HPLC分离：将上述步骤（4）中所得粗品采用甲醇溶解进入制备型HPLC，流动相为体积比为32:68的甲醇和水混合溶液，洗脱流速为3mL/min，保留时间tR=22.6min～22.8min阶段内收集馏分后，回收干燥即得。

本发明还提供了4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。优选为在制备预防和治疗人胃癌、肝癌和乳腺癌药物方面的应用。

迄今为止以上研究成果尚未有专利或文献报道。

本发明的有益效果和意义在于：采用的原料为核桃外壳的青衣，通常被当做废物抛弃，以此为原料进行化合物提取，能充分利用该植物资源；此外，本研究对核桃青皮进行深入成分研究开发，寻找到具有独特化学结构且活性较强的化合物，为临床研究提供了新型抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明化合物的化学结构式；

图2为本发明化合物的正性HR-ESI-MS谱图；

图3为本发明化合物的1H-NMR谱图；

图4为本发明化合物的13C-NMR谱图；

图5为本发明化合物的DEPT谱图；

图6为本发明化合物的HSQC谱图；

图7为本发明化合物的HMBC谱图。

具体实施方式

根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员很清楚本发明的其他实施方案，下述实施方案仅作示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种调整和改进。这些变化应在本发明的保护范围内。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施案例一本发明化合物的制备方法：

（2）富集纯化：将上述步骤（1）中醇提所得干膏状提取物用水分散至相对密度为1.30±0.05的溶液，经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化（色谱柱内径6cm长1.30m，其中树脂有效高度0.95m），分别以水、20%乙醇、30%乙醇依次洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分22.5g；

（3）正相硅胶柱分离：将上述步骤（2）中所得30%乙醇洗脱部分采用正相硅胶柱（色谱柱内径3cm长1.5m，其中硅胶有效高度1.0m），依次采用二氯甲烷-甲醇（8:1，V/V，3.5柱体积）→二氯甲烷-甲醇（3:1，V/V，3.5柱体积）→二氯甲烷-甲醇（1:1，V/V，3.5柱体积）→甲醇溶液（3.5个柱体积）进行系统梯度洗脱，将其中二氯甲烷-甲醇体积配比为3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂至干，称重0.98 g；

（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经上述步骤（3）正相硅胶分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱（内径1.5cm，柱长1.5m），以甲醇:水=2:3（V/V）洗脱3个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液。收集后面两个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品0.22g；

（5）制备HPLC分离：将上述步骤（4）中所得粗品进一步以制备型HPLC制备（Waters 515-2414，SunFireTM Prep C18，250 mm×10 mm i.d.，5μm），以流动相为体积比为32:68的甲醇和水混合溶液，洗脱流速为3mL/min，保留时间tR=22.6min～22.8min阶段内收集馏分后，回收干燥即得纯品11.5mg。

实施案例二本发明化合物的表征：

本发明化合物为白色无定形粉末，易溶于甲醇。在UV光谱（MeOH）中256nm处呈现最大吸收。正性HR-ESI-MS谱中，在m/z 475.1865处可见[M+H]+离子峰，表明本发明化合物的分子量为474。结合1H-NMR、13C-NMR及DEPT谱等波谱数据推测本发明化合物分子式为C21H30O12，计算其不饱和度为7。其具体波谱数据见表1。

效果实施例

MTT（四唑盐）法测定4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对人肿瘤细胞的杀伤作用。

（1）肿瘤细胞：人胃癌BGC-823细胞、人肝癌HepG-2细胞和人乳腺癌MCF-7细胞。

（2）实验具体操作方法：肿瘤细胞在培养于DMEM基质中（含有10% L-谷氨酰胺的胎牛血清，100 μg·mL−1 盘尼西林，100 μg·mL−1链霉素）。取处于对数生长期的肿瘤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以浓度为10×104个mL-1，取180 μL的细胞悬液置于96孔板中，每组均设3个平行孔，另设空白孔和对照孔，空白孔未接种细胞，对照孔为不含药物的培养液。于37℃、5%CO2条件下培养24h后，在培养液中加入待测样品（样品溶解于DMSO中，用培养基逐步稀释，加入细胞中药液的DMSO终浓度≤1%），使药物终浓度为0、10、30、50、70、90 μM。溶液继续在37℃ 5% CO2 培养箱中共同培养48h。每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，溶解于PBS中，继续培养4 h后，终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，摇床上震荡10min，使结晶物完全充分溶解。用酶标仪在570nm 处测每孔的吸光值（A），计算出细胞存活抑制率：细胞存活抑制率%=[1-(实验组A-空白组A)/（对照组A-空白组A）]×100%。数据使用SPSS软件分析系统进行处理。

（3）实验结果：不同浓度该新化合物对肿瘤细胞的存活抑制率实验数据见表2。结果表明，新化合物对上述肿瘤细胞均有较好的生长抑制作用，对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌HepG-2细胞和人乳腺癌MCF-7的IC50分别为28.15 μM和22.64 μM及35.62 μM。

综上所述，本发明所述的从青龙衣中分离得到的酚苷化合物4-羟基苯丙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷具有制备临床肿瘤治疗药物的前景。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610296216.6 (22)申请日 2016.05.08 (71)申请人黑龙江中医药大学地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和平路24号 (72)发明人周媛媛武斌付起凤 (51)Int.Cl. C07H 15/203(2006.01) C07H 1/08(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称核桃青皮中一种新的酚苷化合物的制备方法和用途 (57)摘要本发明属于医药技术领域，涉及从核桃楸（Juglansmands。

2、huricaMaxim）的青果皮中提取分离得到具有体外抗肿瘤活性的一种新的酚苷化合物及其制备方法。本发明方法以核桃青皮为原料，经过醇提，大孔树脂富集纯化，硅胶柱层析和凝胶柱层析，再结合制备HPLC纯化得到了一种新的酚苷化合物4-羟基苯丙酮-4-O-D-吡喃葡萄糖基( 1 6 )- D - 吡喃葡萄糖苷 4 - h y d r o x y p r o p i o p h e n o n e - 4 - O - D - g l u c o p y r a n o s y l ( 1 6 ) - D - glucopyranoside。本发明所涉及的原料容易大。

3、量获取，且该新化合物经实验证实对胃癌、肝癌和乳腺癌等细胞均具有较好的抑制作用。权利要求书1页说明书5页附图3页 CN 105859805 A 2016.08.17 CN 105859805 A 1.一种酚苷化合物，其特征在于，其结构式如式（I）所示：。 2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）醇提：将核桃青皮（来源为核桃楸JuglansmandshuricaMaxim的青果皮）鲜品低温 40烘干，得到的5kg干燥品为原料，采用乙醇回流提取3次，分别为，第1次用30L60%乙醇提取2.5h，第2次25L60%乙醇提取2。

4、h，第3次用20L60%乙醇提取2h，过滤，合并3次滤液，减压回收溶剂，减压干燥，得干膏状提取物；（2）富集纯化：将上述步骤（1）中醇提所得干膏状提取物用水分散至相对密度为1.30 0.05的溶液，经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化，分别以水、 20%乙醇、 30%乙醇依次洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分；（3）正相硅胶柱分离：将上述步骤（2）中所得30%乙醇洗脱部分进行正相硅胶柱色谱分离，分别以体积配比为8:1、 3:1、 1:1、和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度淋洗，每一个比例淋洗3.5个柱体积，将其中。

5、二氯甲烷-甲醇体积配比为3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂得到分离产物；（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经上述步骤（3）分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱，以甲醇: 水=2:3 （V/V）洗脱3个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液；收集后面两个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品；（5）制备HPLC分离：将上述步骤（4）中所得粗品采用甲醇溶解进入制备型HPLC，流动相为体积比为32:68的甲醇和水混合溶液，洗脱流速为3mL/min，保留时间tR=22.6min 22.8min阶段内收集馏分后，回收干燥即得。 3.权利要求1所述酚苷化合物， 4-羟基苯。

6、丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物方面的应用。 4.根据权利要求3所述的4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为人胃癌肿瘤、人肝癌肿瘤或人乳腺癌肿瘤。权利要求书 1/1 页 2 CN 105859805 A 2 核桃青皮中一种新的酚苷化合物的制备方法和用途技术领域 0001 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有癌细胞抑制作用的新化合物的制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用。背景技术 0002 恶性肿瘤是严重威胁人类生命的一类疾病，世界卫生。

7、组织(WHO)专家预测，至2020 年全球人口将达80亿癌症新发病例将达到2000万，将有1200万人死于癌症。癌症已成为危及人类健康的主要杀手。目前为止，肿瘤的常用化疗的治疗方法就是使用抗肿瘤的化学药品对肿瘤患者进行治疗，该法对原发灶，转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用，但缺点也是十分明显的，如对细胞无特异性，有强大的毒副作用，产生抗药性等。所以从理论上讲，化疗不能杀灭体内所有的肿瘤细胞，患者体内总会有残存肿瘤细胞，是其复发，转移的根源。因此开发新的优效药物来满足临床治疗的需要是摆在医药工作者面前一项十分迫切的任务。 0003 经大量的临床报道证实，。

8、青龙衣对食道癌胃癌、肝癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤有非常明显的抑制作用，能缓解肿瘤病人的临床症状，减轻其痛苦。但目前对其产生抗肿瘤作用药效物质基础的确定意见尚不一致，亟待构建青龙衣活性成分分子库。发明内容 0004 本发明的目的是为了解决上述问题，扩大治疗肿瘤药物的资源、来源，提供一种新的具有肿瘤细胞抑制作用的化合物。 0005 为了达到上述目的，本发明提供了4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷，其结构式如下： 0006 本发明还提供了4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷的制备方法：以核桃。

9、青皮为原料，依次通过醇提、柱层析制备得到。 0007 上述柱层析依次包括大孔树脂柱、正相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱和制备HPLC。 0008 本发明4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷具体制备步骤如下：（1）醇提：将核桃青皮（来源为核桃楸JuglansmandshuricaMaxim的青果皮）鲜品低温 40烘干，得到的5kg干燥品为原料，采用乙醇回流提取3次，分别为，第1次用30L60%乙醇提取2.5h，第2次25L60%乙醇提取2h，第3次用20L60%乙醇提取2h，过滤，合并3次滤液，减说明书 1/5 页 3 CN 。

10、105859805 A 3 压回收溶剂，减压干燥，得干膏状提取物；（2）富集纯化：将上述步骤（1）中醇提所得干膏状提取物用水分散至相对密度为1.30 0.05的溶液，经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化，分别以水、 20%乙醇、 30%乙醇依次洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分；（3）正相硅胶柱分离：将上述步骤（2）中所得30%乙醇洗脱部分进行正相硅胶柱色谱分离，分别以体积配比为8:1、 3:1、 1:1、和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度淋洗，每一个比例淋洗3.5个柱体积，将其中二氯甲烷-甲醇体积配比为3:1的二氯甲烷-。

11、甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂得到分离产物；（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经上述步骤（3）分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱，以甲醇: 水=2:3 （V/V）洗脱3个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液。收集后面两个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品；（5）制备HPLC分离：将上述步骤（4）中所得粗品采用甲醇溶解进入制备型HPLC，流动相为体积比为32:68的甲醇和水混合溶液，洗脱流速为3mL/min，保留时间tR=22.6min 22.8min阶段内收集馏分后，回收干燥即得。 0009 本发明还提供了4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D。

12、-吡喃葡萄糖苷在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。优选为在制备预防和治疗人胃癌、肝癌和乳腺癌药物方面的应用。 0010 迄今为止以上研究成果尚未有专利或文献报道。 0011 本发明的有益效果和意义在于：采用的原料为核桃外壳的青衣，通常被当做废物抛弃，以此为原料进行化合物提取，能充分利用该植物资源；此外，本研究对核桃青皮进行深入成分研究开发，寻找到具有独特化学结构且活性较强的化合物，为临床研究提供了新型抗肿瘤药物。附图说明 0012 图1为本发明化合物的化学结构式；图2为本发明化合物的正性HR-ESI-MS谱图；图3为本发明化合物的1H-NMR谱图；图4为本。

13、发明化合物的13C-NMR谱图；图5为本发明化合物的DEPT谱图；图6为本发明化合物的HSQC谱图；图7为本发明化合物的HMBC谱图。具体实施方式 0013 根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员很清楚本发明的其他实施方案，下述实施方案仅作示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种调整和改进。这些变化应在本发明的保护范围内。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。 0014 实施案例一本发明化合物的制备方法：（1）醇提：将核桃青皮（来源为核桃楸JuglansmandshuricaMaxim的青果皮）鲜品低温 40烘干，得到的5kg干燥品为原。

14、料，采用乙醇回流提取3次，分别为，第1次用30L60%乙醇说明书 2/5 页 4 CN 105859805 A 4 提取2.5h，第2次25L60%乙醇提取2h，第3次用20L60%乙醇提取2h，过滤，合并3次滤液，减压回收溶剂，减压干燥，得干膏状提取物311g；（2）富集纯化：将上述步骤（1）中醇提所得干膏状提取物用水分散至相对密度为1.30 0.05的溶液，经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化（色谱柱内径6cm长1.30m，其中树脂有效高度0.95m），分别以水、 20%乙醇、 30%乙醇依次洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂得30% 。

15、乙醇洗脱部分22.5g；（3）正相硅胶柱分离：将上述步骤（2）中所得30%乙醇洗脱部分采用正相硅胶柱（色谱柱内径3cm长1.5m，其中硅胶有效高度1.0m），依次采用二氯甲烷-甲醇（8:1， V/V， 3.5柱体积）二氯甲烷-甲醇（3:1， V/V， 3.5柱体积）二氯甲烷-甲醇（1:1， V/V， 3.5柱体积）甲醇溶液（3.5个柱体积）进行系统梯度洗脱，将其中二氯甲烷-甲醇体积配比为3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收溶剂至干，称重0.98g；（4）葡聚糖凝胶柱分离：取经上述步骤（3）正相硅胶分离后的产物，通过葡聚糖凝胶柱。

16、（内径1.5cm，柱长1.5m），以甲醇:水=2:3 （V/V）洗脱3个柱体积，弃去第一个柱体积洗脱液。收集后面两个柱体积洗脱液，回收溶剂，得粗品0.22g；（5）制备HPLC分离：将上述步骤（4）中所得粗品进一步以制备型HPLC制备（Waters515- 2414， SunFireTMPrepC18， 250mm10mmi.d.， 5 m），以流动相为体积比为32:68的甲醇和水混合溶液，洗脱流速为3mL/min，保留时间tR=22.6min22.8min阶段内收集馏分后，回收干燥即得纯品11.5mg。 0015 实施案例二本发明化合物的表征：本发。

17、明化合物为白色无定形粉末，易溶于甲醇。在UV光谱（MeOH）中256nm处呈现最大吸收。正性HR-ESI-MS谱中，在m/z475.1865处可见M+H+离子峰，表明本发明化合物的分子量为474。结合1H-NMR、 13C-NMR及DEPT谱等波谱数据推测本发明化合物分子式为C21H30O12，计算其不饱和度为7。其具体波谱数据见表1。说明书 3/5 页 5 CN 105859805 A 5 0016 效果实施例 MTT （四唑盐）法测定4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷对人肿瘤细胞的杀伤作用。 0017 （1）肿瘤细胞。

18、：人胃癌BGC-823细胞、人肝癌HepG-2细胞和人乳腺癌MCF-7细胞。 0018 （2）实验具体操作方法：肿瘤细胞在培养于DMEM基质中（含有10%L-谷氨酰胺的胎牛血清， 100 gmL1盘尼西林， 100 gmL1链霉素）。取处于对数生长期的肿瘤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以浓度为10104个mL-1，取180 L的细胞悬液置于96孔板中，每组均设3个平行孔，另设空白孔和对照孔，空白孔未接种细胞，对照孔为不含药物的培养液。于 37、 5%CO2条件下培养24h后，在培养液中加入待测样品（样品溶解于DMSO中，用培养基逐步稀释，加入细。

19、胞中药液的DMSO终浓度 1%），使药物终浓度为0、 10、 30、 50、 70、 90 M。溶液继续在375%CO2培养箱中共同培养48h。每孔加入20 LMTT溶液（5mg/mL，溶解于说明书 4/5 页 6 CN 105859805 A 6 PBS中，继续培养4h后，终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150 LDMSO，摇床上震荡 10min，使结晶物完全充分溶解。用酶标仪在570nm处测每孔的吸光值（A），计算出细胞存活抑制率：细胞存活抑制率%=1-(实验组A-空白组A)/ （对照组A-空白组A） 100%。数据使用 SPSS软件分析系统进行。

20、处理。 0019 （3）实验结果：不同浓度该新化合物对肿瘤细胞的存活抑制率实验数据见表2。结果表明，新化合物对上述肿瘤细胞均有较好的生长抑制作用，对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌HepG-2细胞和人乳腺癌MCF-7的IC50分别为28.15 M和22.64 M及35.62 M。 0020 综上所述，本发明所述的从青龙衣中分离得到的酚苷化合物4-羟基苯丙酮-4-O- -D-吡喃葡萄糖基(16)- -D-吡喃葡萄糖苷具有制备临床肿瘤治疗药物的前景。说明书 5/5 页 7 CN 105859805 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 8 CN 105859805 A 8 图4 图5 说明书附图 2/3 页 9 CN 105859805 A 9 图6 图7 说明书附图 3/3 页 10 CN 105859805 A 10 。

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