人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110108478.2 (22)申请日 2011.04.28 C12N 9/06(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 38/44(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 19/06(2006.01) (73)专利权人 杭州俊丰生物工程有限公司 地址 310018 浙江省杭州市西湖区留和路留 下工业区 11 号 (72)发明。

2、人 徐辉 张明劼 (74)专利代理机构 宁波市鄞州金源通汇专利事 务所 ( 普通合伙 ) 33236 代理人 唐迅 CN 1322243 A,2001.11.14, CN 1322141 A,2001.11.14, Masako Oda et al.Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications.Mol. Biol.Evol. .2002, 第 19 卷 ( 第 5 期 ),640-653. (54) 发明名称 人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二 醇结合物 (57) 摘要 本发明公开。

3、的人尿酸氧化酶蛋白， 由 SEQ ID NO.3 的氨基酸序列组成。本发明所得到的人尿酸 氧化酶蛋白， 回复人尿酸氧化酶基因中的突变密 码， 将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程 菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达， 产生具有酶 活性的尿酸氧化酶蛋白。本发明公开的聚乙二醇 人尿酸氧化酶蛋白结合物及药物组合物， 具有氧 化分解尿酸的活性， 可用于治疗高尿酸血症及由 于高尿酸引起的疾病 ( 如痛风 )。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 欧阳石文 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102。

4、757945 B (45)授权公告日 2015.03.18 CN 102757945 B 1/1 页 2 1. 一种人尿酸氧化酶蛋白， 其特征在于由 SEQ ID NO.3 的氨基酸序列组成。 2. 一种核酸序列， 其特征在于编码权利要求 1 的人尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。 3. 一种核酸载体， 其特征在于包含权利要求 2 所述的核酸序列。 4.如权利要求3所述的核酸载体， 其特征在于所述的核酸载体的出发载体采用pET 系 列载体、 PEPTIDE、 pMAL-c2x、 pGEX4T、 pGEX5X、 pGEX6P、 pQE30、 pTrcHisB、 pTWIN、 pBV220、 pPICZ、。

5、 pPIC9K、 PGAPZ、 pYES2/CT、 Bacmid DNA、 pcDNA3.1、 pcDNA4.0 或 EGFP。 5. 一种宿主细胞， 其特征在于包含权利要求 4 所述的核酸载体。 6. 一种制备如权利要求 1 所述的人尿酸氧化酶蛋白的方法， 其特征在于包括宿主细胞 表达所述核酸序列的培养条件下培养权利要求 5 的宿主细胞步骤， 以及分离纯化所表达的 人尿酸氧化酶蛋白的步骤。 7. 一种聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物， 其特征在于它包含权利要求 1 所述的人尿 酸氧化酶蛋白， 所述人尿酸氧化酶蛋白与聚乙二醇分子共价连接。 8. 如权利要求 7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合。

6、物， 其特征在于所述的人尿 酸氧化酶蛋白的每个亚基包含 2 12 个聚乙二醇分子。 9. 如权利要求 7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物， 其特征在于所述的聚乙 二醇分子的分子量为 5kd 100kd。 10. 如权利要求 7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物， 其特征在于所述的聚乙 二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上氨基共价连接。 11. 如权利要求 7 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物， 其特征在于所述的聚乙 二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上巯基共价连接。 12. 如权利要求 7 至 11 任一项权利要求所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物， 其 特征在于聚乙二醇分子为。

7、分枝型或直线型。 13. 一种药物组合物， 其特征在于该药物组合物包含权利要求 1 所述的人尿酸氧化酶 蛋白。 14. 一种药物组合物， 其特征在于该药物组合物包含权利要求 7 至 12 任一项权利要求 所述的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物。 权 利 要 求 书 CN 102757945 B 2 1/8 页 3 人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术制备的具有尿酸分解活性的蛋白酶， 更具体地说， 本发 明涉及一种新的尿酸氧化酶蛋白及其制备方法。 背景技术 0002 尿酸氧化酶 (urate oxidase、 尿酸酶、 uricase， E.C。

8、.1.7.3.3) 是生物体内嗦吟降 解代谢途径中的一种酶， 催化尿酸氧化为溶解度更高的尿囊素， 尿囊素的溶解度比尿酸高 约 10 倍， 是更容易排泄的嘌呤代谢物。许多物种体内均发现有尿酸氧化酶， 但在高等哺乳 动物灵长类体内和人体缺乏此酶， 因此尿酸是嘌呤代谢的终产物。尿酸及其盐类在水中溶 解度很低， 血液中积累过多会导致高尿酸血症， 如果尿酸在软组织、 关节、 器官等处形成结 晶而沉积， 会导致疼痛性关节炎 ( 痛风 )、 毁形性尿酸沉积 ( 结节瘤 ) 和肾衰竭。 0003 现有的人尿酸氧化酶蛋白， 由于在进化中编码人尿酸氧化酶氨基酸序列第 33 位 和第 187 位的氨基酸基因序列发生。

9、了突变， 产生了终止密码， 使人尿酸氧化酶基因无法产 生具有功能的尿酸氧化酶蛋白。 0004 随着经济的发展和人们生活水平的提高， 高尿酸血症和痛风的发病率一直在上 升。据美国国立卫生研究院 NIH 的报道， 痛风约占所有关节炎病例的 5， 是一种最疼痛的 风湿疾病， 预计约 500 万美国人患有痛风， 其中 50,000 70,000 名患者禁忌常规疗法 或常规治疗无效。痛风是由结缔组织和关节中的针状尿酸结晶沉淀引起的， 这些沉淀导致 炎症性关节炎， 从而引发关节肿胀、 发红、 发热、 疼痛和僵硬， 并对受疾病侵袭的关节造成损 伤。另外肿瘤疾病及其治疗过程会引发高尿酸血症。高尿酸血症已经成为。

10、人类面临的又一 代谢性疾病， 寻找有效的治疗方法显得非常迫切。 0005 用于高尿酸血症和痛风治疗的药物首先是降尿酸药， 适用于难治性痛风石性痛风 治疗的药物一类主要是通过抑制黄嘌呤氧化酶而使尿酸生成减少的别嘌醇， 另一类促进尿 酸排泄的药物， 如丙磺舒、 苯磺唑酮和苯溴马龙多， 但因患者存在大量痛风石或较严重的肾 功能不全而不适于使用。 不少患者对别嘌醇过敏、 无效或不能耐受。 近年来又有新型降尿酸 药上市， 非布索坦 (febuxostat) ： 是一种特异性黄嘌呤氧化酶抑制剂。非布索坦能在 2 周 内明显降低尿酸水平， 近 60的患者能在 3 个月内达到治疗目标， 即血尿酸水平降到 6m。

11、g/ dl。该药不适合于肝功能损害患者， 而对轻中度肾功能不全者安全有效。最常见的不良反 应是肝功能异常、 腹泻、 头痛、 恶心、 呕吐、 腹痛、 头晕、 关节痛和肌肉骨骼症状。 0006 有研究表明， 尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其他药物， 因 此体内补充尿酸氧化酶是治疗高尿酸血症的最佳策略。目前临床上用的尿酸氧化酶来自 黄曲霉菌， 因有免疫原性， 应用大受限制。某些来自于植物或者微生物的尿酸氧化酶更易 溶解于医学上可接受的溶剂中。然而， 注射微生物酶会很快引起免疫反应， 这种免疫反应 可能会导致致命的变态反应、 使酶失活或者被迅速从血液循环中清除 Donadio， et 。

12、al.， (1981) ； Leaustic， et al.， (1983)。 来源于哺乳动物( 包括猪和狒狒)、 昆虫 如黑腹果 蝇 (Drosophila melanogaster) 和拟暗果蝇 (Drosophila pseudoobscura) 氨基酸序列 说 明 书 CN 102757945 B 3 2/8 页 4 的酶由于免疫原性和在生理pH 条件下不溶性问题， 没有成为可用于临床的候选药物。 中国 专利申请 99811738.2 公布了猪和狒狒的尿酸氧化酶序列嵌合的尿酸氧化酶， 中国专利申 请 03109150.4 是一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法， 拉布立酶 (rasbu。

13、ricase) 是 基因重组的黄曲霉尿酸氧化酶， 仍然具有免疫原性和发生过敏的可能性， 不适合长期使用。 0007 不少人都考虑用修饰尿酸氧化酶以降低其免疫原性， 但经修饰后催化活性大大下 降， 而且免疫原性却未能全消。美国风湿病学会 (ACR)2005 年度会议发布的 II 期观察 研究结果显示， 高血尿酸和难治性痛风患者经 Savient 制药公司的试验药物聚乙二醇一 尿酸酶治疗后， 血尿酸浓度可持续显著降低， 在已公布的 II 期开放性标记试验的两个病 例中， 观察聚乙二醇 - 尿酸酶治疗可溶解痛风石。虽然取得了疗效， 但该公司开发的产品 pegloticase 仍然有产生过敏反应的危险。

14、性。 0008 因此治疗高尿酸血症及长期用药治疗痛风需要免疫原性更低， 安全性更高的尿酸 氧化酶以降低过敏反应性和提高治疗的效果。 发明内容 0009 本分明的目的是提供一种人尿酸氧化酶蛋白， 这种人尿酸氧化酶蛋白回复人尿酸 氧化酶基因中的突变密码， 将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧 化酶基因的表达， 产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。 0010 本发明所设计的人尿酸氧化酶蛋白， 由 SEQ ID NO.3 的氨基酸序列组成。 0011 作为优选， 本发明所设计的人尿酸氧化酶蛋白包含在氨基末端或者羧基末端或者 氨基和羧基末端两者截短 1-20 个氨基酸的 SEQ ID NO。

15、.3 的氨基酸序列。 0012 作为优选， 本发明所设计的人尿酸氧化酶蛋白包含 33 位、 46 位、 110 位、 140 位、 200 位、 220 位、 240 位氨基酸置换的 SEQ ID NO.3 的氨基酸序列。 0013 本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白， 是人体自身应该进化产生的蛋白质氨基酸序 列， 最接近人体蛋白质序列， 因此对人体的免疫原性是最低的。 本发明所得到的人尿酸氧化 酶蛋白， 回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码， 将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工 程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达， 产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。 0014 本发明所设计的一种核酸序列， 编码上述的。

16、人尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。 0015 本发明所设计的一种核酸序列， 包含所述的核酸序列。 0016 作为优选， 所述的核酸载体， 所述的核酸载体的出发载体采用 pET 系列载体、 pPEPTIDE、 pMAL-c2x、 pGEX4T、 pGEX5X、 pGEX6P、 pQE30、 pTrcHisB、 pTWIN、 pBV220、 pPICZ、 pPIC9K、 PGAPZ、 pYES2/CT、 Bacmid DNA、 pcDNA3.1、 pcDNA4.0 或 EGFP。 0017 本发明所设计的一种宿主细胞， 包含上述的核酸载体。 本发明提供宿主细胞， 该宿 主细胞具有包含人尿酸氧化酶编码核酸。

17、的核酸载体， 宿主细胞为大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 酵母、 昆虫细胞或者动物细胞。 本发明的人尿酸氧化酶蛋白可以直接在宿主细胞中表达， 也 可以通过翻译后加工修饰分泌到宿主细胞外， 还可以以融合蛋白形式表达， 再通过酶切加 工获得人尿酸氧化酶蛋白。 0018 本发明所设计的一种制备上述人尿酸氧化酶蛋白的方法， 包括宿主细胞表达所述 核酸序列的培养条件下培养上述的宿主细胞步骤， 以及分离纯化所表达的人尿酸氧化酶蛋 白的步骤。 说 明 书 CN 102757945 B 4 3/8 页 5 0019 本发明所设计的一种聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物， 它包含上述的人尿酸氧 化酶蛋白， 所述人尿酸氧化。

18、酶蛋白与聚乙二醇分子共价连接。 0020 作为优选， 所述的人尿酸氧化酶蛋白的每个亚基包含 2 12 个聚乙二醇分子。 0021 作为优选， 所述的聚乙二醇分子的分子量为 5kd 100kd。 0022 作为优选， 所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上氨基共价连接。 活化聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯 (mPEG-SS)、 单甲氧基聚乙二醇琥 珀酰亚胺碳酸酯 (mPEG-SC)、 单甲氧基聚乙二醇 N- 羟基琥珀酰亚胺酯 (mPEG-2-NHS)、 单甲 氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酸酯 (mPEG-SPA)、 单甲氧基聚乙二醇丙醛 (mPEG-ALD)、 Y 型 聚乙二。

19、醇 NHS 酯、 Y 型聚乙二醇乙醛、 葡萄糖聚乙二醇 NHS 酯、 半乳糖聚乙二醇 NHS 酯、 甲 氧基聚乙二醇乙酸酯 (mPEG-SCM)、 甲氧基聚乙二醇碳酸酯 (mPEG-SC)、 单甲氧基聚乙二醇 对甲苯磺酸酯 (mPEG-Ots)、 单甲氧基聚乙二醇对硝基苯酚碳酸酯 (mPEG-OCOOPhNO2)、 单甲 氧基聚乙二醇五氟苯酚酯衍生物、 - 甲氧基 - 聚乙二醇 - 氨甲基 (mPEG-CH2NH2)、 - 甲氧基 - 聚乙二醇 - 丙酸 (mPEG-PA)、 - 甲氧基 - 聚乙二醇 - 丁酸 (mPEG-BA)、 - 甲氧基 - 聚乙二醇 - 琥珀酰酯酸 (mPEG-S)、。

20、 - 甲氧基 - 聚乙二 醇 - 琥珀酰酯酸琥珀酰亚胺酯 mPEG-SS)、 - 甲氧基 - 聚乙二醇 -3-(3- 马来酰 亚胺基 -1- 氧丙基 ) 氨基 丙基醚 (mPEG-PPMAL)。 0023 作为优选， 所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上巯基共价连接。 活化聚乙二醇包括 ： 甲氧基聚乙二醇巯醇 (mPEG-SH)、 甲氧基聚乙二醇巯酯 (mPEG-VS)、 Y 型聚乙二醇马来酰亚胺、 单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 (mPEG-MAL)。 0024 作为优选， 聚乙二醇分子为分枝型或直线型。 0025 本发明所设计的一种药物组合物， 该药物组合物包含上述的人尿酸氧化酶蛋白。

21、。 0026 本发明所设计的一种药物组合物， 该药物组合物包含上述的聚乙二醇人尿酸氧化 酶蛋白结合物。 0027 本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白及其聚乙二醇结合物， 具有氧化分解尿酸的活 性， 可用于治疗高尿酸血症及由于高尿酸引起的疾病 ( 如痛风 )。 附图说明 0028 图 1、 SDS-PAGE 分析重组人尿酸氧化酶蛋白的表达量。 0029 1、 蛋白分子量 Marker， 从下往上分别为 14.4、 20、 26、 33、 45、 66.2、 94kDa ； 2、 未诱 导菌体全蛋白 ； 3-10、 诱导菌体全蛋白。 0030 图 2、 SDS-PAGE 分析人尿酸氧化酶蛋白的纯度。 。

22、0031 1-5、 纯化重组人尿酸氧化酶蛋白 ； 6、 蛋白分子量 Marker， 从下往上分别为 14.4、 20、 33、 45、 67、 97kDa。 0032 图 3、 SDS-PAGE 分析人尿酸氧化酶蛋白的分子量。 0033 1、 蛋白分子量Marker， 从下往上分别为14.4、 20.1、 31、 43、 66.2、 97.4kDa ； 2、 纯化 重组人尿酸氧化酶蛋白。 0034 图 4、 SDS-PAGE 分析融合表达重组人尿酸氧化酶蛋白的表达量。 0035 1、 蛋白分子量Marker， 从下往上分别为14.4、 20.1、 31、 43、 66.2、 97.4kDa ；。

23、 2、 未诱 导菌体全蛋白 ； 3-10、 诱导菌体全蛋白。 说 明 书 CN 102757945 B 5 4/8 页 6 0036 图 5、 重组人尿酸氧化酶蛋白大鼠体内药代动力学曲线。 0037 图 6、 聚乙二醇重组人尿酸氧化酶蛋白大鼠体内药代动力学曲线。 具体实施例 0038 实施例一， 人尿酸氧化酶基因和表达载体的构建 0039 人尿酸氧化酶基因的获得 0040 根据Genbank(NCBI Reference Sequence ： NR 003927.1)、 GenBank ： S94095.1 和 GenBank ： AH003594.1 公布的人尿酸氧化酶假基因序列拼接的人尿酸。

24、氧化酶假基因序列 见 SEQ IDNO.1。将 SEQ ID NO.1 人尿酸氧化酶假基因第 99 位的 “A” 和第 561 位的 “A” 改为 “G” 得到人回复突变的人尿酸氧化酶基因， 见 SEQ ID NO.2。采用化学合成法合成人尿 酸氧化酶基因， 其编码的氨基酸序列见 SEQ ID NO.3。先合成 25 段互补的寡核苷酸片段， 基因 5 端片段加上 Nde I 酶切位点， 3 端引入 BamH I 酶切位点， 用 T4 噬菌体多核苷酸 激酶37处理30min， 磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合， 94变性5min， 立即65退 火 10min， 然后加入 T4 连接酶， 16连。

25、接过夜 ( 精编分子生物学实验指南， 第五版， 奥斯伯 等主编， 金由辛等译校， 2008 年， 科学出版社 )。 0041 用于人尿酸氧化酶基因 PCR 扩增的合成寡核苷酸引物如下 ： 0042 5-TATACATATG GCCCACT ACCATAA(SEQ ID NO.4) 0043 5-TCTGGATCC TCACAGTCTTGAAGACA(SEQ ID NO.5) 0044 合成寡核苷酸片断连接过夜的产物加入100ul PCR反应体系中， 再加入扩增引物， 2mmol/L 的 dNTP， 10ul， 10X 反应缓冲液 10ul， Taq DNA 聚合酶 5U。PCR 条件为 94变。

26、性 1 分钟， 55退火 1 分钟， 72延伸 3 分钟， 35 个循环后， 再 72延伸 10 分钟。电池检测 扩增产物， 大小约 1000bp， 与设计基因序列大小符合。产物经序列分析， 与设计序列一致。 人尿酸氧化酶基因向 pET 表达载体的克隆。 0045 pET-22b 质粒用Nde I、 BamH I 双酶切回收5500bp 大片段， PCR 扩增回收的人尿 酸氧化酶基因片段用Nde I、 BamH I 双酶切回收910bp 片段， 将两个片断连接， 20L 反应 体系基因片段与载体大片段的比例为 10 1， 加 T4DNA 连接酶 300 单位， 16连接过夜 得到重组质粒 pE。

27、T-22b-rhUOX。 0046 实施例二， 高表达宿主菌的获得 0047 将重组表达质粒 pET-22b-rhUOX 转化进大肠杆菌宿主菌。制备转化用细菌细 胞， 包括挑取一个 BL21(DE3) 菌落接种入 3ml LB 培养基， 37 250rpm 振荡培养过夜 ； 吸 取 .2ml 入 20ml LB 扩大培养， 37 250rpm 振荡培养至 OD600 为 0.4-0.6 ； 无菌条件下 将细菌转移至冰预冷的无菌 50ml 试管中， 冰上放置 10 分钟以使培养物冷却至 0 ； 4 下 4000rpm 离心 10 分钟， 回收细菌 ； 倒出培养液， 将试管倒置 1 分钟以使残留的。

28、培养基 流尽 ； 10ml 0.1mol/LCaCl2 重悬菌体沉淀， 冰上静置 10 分钟 ； 4下 4000rpm 离心 10 分 钟， 回收细菌 ； 倒出培养液， 将试管倒置 1 分钟以使残留的培养基流尽 ； 加入 1ml 0.1mol/L CaCl2， 重悬菌体， 分装后保存于 -70备用。 0048 取 200l 感受态细胞溶液于预冷试管中， 加入 5l 连接 DNA 溶液， 轻轻旋转 混匀后冰浴 30 分钟 ； 42热休克 90 秒， 立即移入冰浴中 2 分钟， 加入 800l LB， 37 200rpm 振荡培养 45 分钟 ； 4下 2500rpm 离心收集细菌， 加入含氨苄青。

29、霉素 (100g/ml) 说 明 书 CN 102757945 B 6 5/8 页 7 的 LB200l 重悬菌体 ； 将 20l 和 180l 菌液分别涂布于 LB/Amp 琼脂平板上， 选择培 养过夜 ； 次日观察平板 ； 挑取白色菌落， 同时将相应的克隆培养于 3ml LB/Amp 中， 用于小 量制备质粒和鉴定分析。 0049 氨苄青霉素做抗性筛选， 得到阳性克隆 pET-22b-rhUOX。提取质粒， 用限制性内切 酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析， 结果克隆序列与设计序列一致。 0050 实施例三， 重组人尿酸氧化酶 0051 宿主菌的培养和诱导表达 0052 配制培养。

30、基 ： Trypton 10g/L、 Yeast extract 5g/L、 NaCl 5g/L， pH7.0。培养基配 好后于121温度下湿热灭菌20min。 灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp 使其终浓度为 50g/mL， 冷却后置 4冰箱中备用。 0053 种子培养 ： 在超净台中无菌操作下挑取单菌落接种于 20ml LB 培养基 ( 含 Amp) 中， 然后置于 37下， 180rpm 摇床培养过夜。 0054 放大培养 ： 从培养过夜的种子培养物取 1ml 接种量转接于 20ml LB 培养基中， 剩 余的种子培养物置于 4冰箱中保存。放大培养转接物置于 37下， 18。

31、0rpm 培养 3 小时， 培养液的 OD600 约为 0.8。然后往放大培养转接物中加入 IPTG 至终浓度 1.0mmol/L。将 放大培养转接物都继续培养诱导 5 小时， 然后离心收集 l 菌液 (10,000rpm1min)。 0055 取对照菌体和诱导菌体， 先分别加入150微升蒸馏水， 用移液枪吹吸， 使菌体悬浮， 然后分别加入 150 微升平时常用的样品缓冲液 (2)， 漩涡 1min， 离心 6000rpm0.5min， 然后置于沸水中煮 5min， 室温下放置 25min， 然后离心 6000rpm1min， SDS-PAGE 分析表达 量， 结果见图 1。 0056 人尿酸。

32、氧化酶的分离纯化 0057 收集菌体， 进行超声破碎， 然后收集上清和沉淀， 用 12 SDS-PAGE 电泳分析， 结 果目标蛋白主要存在于破菌后的上清液中， 根据电泳结果的条带分析， 诱导全菌的目标蛋 白的表达量应该在 30以上。将收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化， 其过程 为用 pH 值为 8.5 的 20mmol/L Tris.CL 缓冲液稀释， 使其电导率小于 5mS/cm。用同样的 缓冲液平衡 DEAE 柱， 上样后用平衡缓冲液洗至基线， 用 0.01 0.5mol/LD NaCL 梯度洗 脱， 收集目标蛋白峰， 层析图谱见图 3。 0058 将离子交换目标蛋白峰稀释后使。

33、目标蛋白的电导率小于 5mS/cm， 调样品 pH 到 4.5， 用 pH4.5 的 Hac-NaAc 缓冲液平衡 SP 柱， 上样后用平衡缓冲液洗至基线， 用 0.01 0.5mol/LDNaCL 梯度洗脱， 收集目标蛋白峰。 0059 得到的 SP 峰经 Sephadex G-25 脱盐交换缓冲液， 平衡液为 20mmol/L PB， pH7.4。 样品脱盐后即为高纯度的人尿酸氧化酶蛋白， SDS-PAGE 电泳分析结果见图 2。 0060 实施例四， 重组人尿酸氧化酶的分析 0061 分子量 0062 高度纯化的人尿酸氧化酶蛋白15 SDS-PAGE 电泳分析， 结果见图3， 以标准蛋白。

34、 分子量的对数对蛋白质迁移率制作标准曲线， 根据标准曲线计算人尿酸氧化酶蛋白的分子 量为 34kd。 0063 等电点 0064 采用聚丙烯凝胶水平电泳进行测定， 等电点标准的 pH 范围为 3-10， 铺制胶板， 凝 说 明 书 CN 102757945 B 7 6/8 页 8 胶聚合后直接点样 40g， 以 120V 15min， 220V 10min， 450V 60min 进行电泳。电泳完毕取 出凝胶， 置于固定液中浸泡固定， 凝胶用双蒸水漂洗， 然后染色液中染色 40 分钟， 再脱色直 至蛋白条带显色完全。 以阴极为原点， 测定各标准蛋白带的迁移距离， 等电点对迁移距离作 出 pH 。

35、梯度曲线图。测量蛋白质样品的迁移距离， 从 pH 梯度曲线图中求出蛋白质样品的等 电点。人尿酸氧化酶蛋白的等电点为 8.5。 0065 N 末端序列分析 0066 用 Edman 降解法进行人尿酸氧化酶蛋白的 N 末端氨基酸序列分析， 进行 15 个循 环， 结果为 ： MAHYHNNYKKNDEVE 0067 酶活性分析 0068 用紫外分光光度法分析纯化后人尿酸氧化酶蛋白的酶活性， 酶活性通过测定由尿 酸氧化成尿囊素引起的292nm 吸光值的减少来确定。 酶活性单位定义为 ： 每分钟将1mol 尿酸氧化为尿囊酸所需的酶量为一个酶活性单位。酶比活性 (U/mg) 以每毫克蛋白的酶活 性单位数。

36、表示。 0069 在 3ml 缓冲液体系中含尿酸 0.18mol， pH 8.9， 30保温， 检测波长 292nm， 加入 1mg/mL 的酶 1L， 反应结束后测吸收值， 根据标准曲线计算酶分解的尿酸， 蛋白质含量测 定采用 Lowry 法， 计算酶比活性为 13.1U/mg。 0070 实施例五， 截断型人尿酸氧化酶的表达 0071 将含 pET-22b-rhUOX 重组质粒的工程菌株进行平板纯化， 挑取单菌落过夜培养后 进行质粒的小量抽提。以提取质粒为模板， 用以下引物 (SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.7)PCR 扩增获得截断型人尿酸氧化酶基因 (SEQ ID NO.。

37、8)。 0072 5 CTTCGAATTCATGAACTATAAAA AGAATG(SEQ ID NO.6) 0073 5 AATT GCGGCCGCTCACAGTCTT GAA(SEQ ID NO.7) 0074 用 EcoR I 和 Not I 双酶切 PCR 产物， 连接至同样用 E coR I 和 No t I 双酶切 的 pPIC9K 载体中， 转化大肠杆菌 TGi 感受态细胞。提取质粒 DNA， 用 EcoR I 和 Not I 双 酶切进行鉴定， 筛选出含人尿酸氧化酶截短型基因的阳性重组克隆， 命名为 pPIC9K-rhUOX。 用 DraI 对重组表达质粒 pPIC9K-rhU。

38、OX 和空载体 pPIC9K 进行酶切线性化。依照 Inv itrogen 公司说明书介绍的方法， 用山梨醇制备酵母电击转化感受态细胞， 将线性化的 pPIC9K-rhUOX 和 pPIC9K 电击转化酵母菌 GS115 菌株， 涂 MD 平板， 倒置， 30 培养 48h。设 置含不同浓度G418的YPD 培养基对在MD 平板中生长良好的酵母菌进行抗性筛选、 再进行 酵母重组子 PCR 鉴定。鉴定好的阳性转化子单菌落分别点种至 MM 平板和 MD 平板以鉴定 转化子的甲醇利用表型， 即Mu t+ 表型( 甲醇利用正常型) 或Muts 表型( 甲醇利用缓慢 型 )。阳性整合子的诱导表达采用 M。

39、uts 表型酵母诱导表达的方法， 表达培养基为 BMGY 和 BMMY， 分别挑取 1 株阳性酵母整合子进行诱导表达， 在诱导培养后的 0， 24， 48， 72， 96， 120 小时分别取样1mL， 12000r/min 离心30s， 收集上清液-20保存， 备用。 取各时间段上清液 20L 与2X SDS-PAGE 上样缓冲液20L 混匀， 沸水煮5min 后进行SDS-PAGE 电泳， 检测 不同诱导时间目的蛋白的表达情况， 结果表达产物分子量为约为 32KD， 酶比活性 12.9IU/ mg。 0075 实施例六， 人尿酸氧化酶的融合表达 0076 合成以下引物 ： 说 明 书 CN。

40、 102757945 B 8 7/8 页 9 0077 5 TATA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAG GCCCACT ACCATAA(SEQ ID NO.9) 0078 5” TCT GAATTC TCA CAGTCTTGAAGACA(SEQ ID NO.10) 0079 碱裂解法小量提取质粒 pET-22b-rhUOX， BamH、 EcoR 双酶切， 琼脂糖电泳回收目的 基因。BamH I、 EcoR I 双酶切质粒 pGEX-2T， 回收载体， T4DNA 连接酶于 16连接， 过夜， 将 连接产物转化到 E.coli DH5， 挑取单菌落， 接种于含氨苄西林 (。

41、Amp)100g/mL 的 LB 培养 基， 小量提取质粒双酶切进一步鉴定。 将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)， 得到基因工程 表达菌BL21(DE3)/pGEX2rhUOX， 从平板上挑取单菌落， 接种于2YT 液体培养基100mL中， Amp 浓度为 100g/mL， ， 200r/min， 37培养至 A600 约为 0.6。然后将带有重组质粒的宿 主菌 BL21、 阴性对照 BL21 和空质粒按 1的浓度接种到 2YT 培养基 3mL 中， Amp 浓度 为 100g/mL。37， 200r/min 振荡培养至菌液的 A600 为 1.0 左右， 加 IPTG 至终浓度。

42、为 1mmol/L， 25诱导表达 15h。将诱导表达后的培养物离心， 收集菌体， 用 12 SDS2PAGE 电 泳检测， 结果见图 4。 0080 实施例七， 聚乙二醇修饰重组人尿酸氧化酶 0081 将活化聚乙二醇 NHS 酯 (mPEG 10000)250mg 与 50mg(2.5mg/ml) 纯化的人重组 尿酸氧化酶蛋白溶于硼酸缓冲液 (0.1mol/L， pH 9.2) 中， 在常温下磁力搅拌反应 4h， 加入 甘氨酸终止反应。4下磷酸缓冲液 (0.05mol/L， pH 8.0) 中透析 24h( 透析袋截留分子质 量 10000Da)， 得到修饰的 mPEG- 人重组尿酸氧化酶。。

43、 0082 TNBS 法测定酶的平均氨基修饰率， Lowry 法测定蛋白浓度。 修饰率( ) (1- 修饰后的 A258 值 / 修饰前的 A258 值 )100。 0083 实施例八， 不同分子量聚乙二醇修饰人尿酸氧化酶 0084 分别将分子量为 5000、 10000、 20000 和 40000Da 的活化聚乙二醇 NHS 酯 250mg 与 50mg(2.5mg/ml) 纯化的人重组尿酸氧化酶蛋白溶于硼酸缓冲液 (0.1mol/L， pH 9.2) 中， 在常温下磁力搅拌反应 4h， 加入甘氨酸终止反应。4下磷酸缓冲液 (0.05mol/L， pH 8.0) 中透析 24h 得到修饰的。

44、 mPEG- 人重组尿酸氧化酶。 0085 对修饰产物进行酶活性分析， 结果分子量为 5000、 10000、 20000 和 40000Da 的活 化聚乙二醇 NHS 酯修饰的人尿酸氧化酶的酶比活性分别为 8.2IU/mg、 7.0IU/mg、 5.4IU/ mg、 3.7IU/mg。 0086 实施例九， 不同的活化聚乙二醇修饰人尿酸氧化酶 0087 用分子量为 10000 的活化单甲氧基聚乙二醇 NHS 酯修饰重组人尿酸氧化酶， 将 聚乙二醇 NHS 酯 250mg 与 50mg(2.5mg/ml) 纯化的重组人尿酸氧化酶蛋白溶于硼酸缓冲 液 (0.1mol/L， pH 9.2) 中， 。

45、在常温下磁力搅拌反应 4h， 加入甘氨酸终止反应。4下磷酸缓 冲液 (0.05mol/L， pH 8.0) 中透析 24h 得到单甲氧基聚乙二醇 NHS 酯修饰的 mPEG- 重组 人尿酸氧化酶。测定酶比活性为 6.7IU/mg， Lowry 法进行蛋白质含量的测定。 0088 用分子量为 10000 的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰重组人尿酸氧化酶， 将单 甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 250mg 与 30mg(2.0mg/ml) 纯化的重组人尿酸氧化酶蛋白溶 于 Bicine 缓冲液 (0.1mol/L， pH 7.5) 中， 在室温下磁力搅拌反应 24h。4下磷酸缓冲液 (0.05mol/L。

46、， pH 8.0) 中透析 24h 得到单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰的 mPEG- 重组 人尿酸氧化酶。测定酶比活性为 5.3IU/mg， Lowry 法进行蛋白质含量的测定。 0089 实施例十， 人尿酸氧化酶的动物体内药代动力学 说 明 书 CN 102757945 B 9 8/8 页 10 0090 以大鼠为试验动物进行重组人尿酸氧化酶和聚乙二醇修饰的重组人尿酸氧化酶 动物体内药代动力学研究， 大鼠股静脉注射以生理盐水溶解人尿酸氧化酶样品， 按 1.0mg/ kg 剂量给药， 注射体积为 10ml/kg 体重， 每组 6 只大鼠， 重组人尿酸氧化酶组每只动物在 注射前及注射后 1、 1。

47、0、 30、 45、 60min 从颈动脉取血， 每次 0.6ml， 共 6 次。聚乙二醇修饰的 重组人尿酸氧化酶组在注射前及注射后 1、 10、 30、 60min 及 1.0、 4.0、 8.0、 16、 24、 48 及 72h 从颈动脉取血， 每次 0.6ml， 共 6 次离心取血清。血清样品于 4保存至该动物样品全部收 集完毕后立即检测或 -20保存 1 周内检测。每份血清样品均进行尿酸氧化酶酶活性的测 定， 根据酶比活性换算成酶蛋白质含量， 结果见图 5 四和图 6。 说 明 书 CN 102757945 B 10 1/6 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 10275。

48、7945 B 11 2/6 页 12 0003 序 列 表 CN 102757945 B 12 3/6 页 13 0004 序 列 表 CN 102757945 B 13 4/6 页 14 0005 序 列 表 CN 102757945 B 14 5/6 页 15 0006 序 列 表 CN 102757945 B 15 6/6 页 16 序 列 表 CN 102757945 B 16 1/3 页 17 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757945 B 17 2/3 页 18 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102757945 B 18 3/3 页 19 图 6 说 明 书 附 图 CN 102757945 B 19 。