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1、(10)申请公布号 CN 102757997 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757997 A *CN102757997A* (21)申请号 201210167911.4 (22)申请日 2012.05.28 CGMCC No.6051 2012.04.24 C12P 33/06(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 许正宏 付珍珍 朱晓宏 (54) 发明名称 底物预诱导制备 7, 15- 二羟基雄甾烯酮 的方法 (57) 摘要 本 发 明 公 。
2、开 一 种 以 亚 麻 刺 盘 胞 菌 (Colletotrichumlini) ST-1 为菌种, 生物合成 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的发酵工艺方法, 其 特征在于发酵过程前期先加一定量的底物去氢表 雄酮, 培养一段时间后再投入底物, 这样既能对 转化过程的关键酶进行预诱导, 又能减少一次性 投底物对菌体细胞产生的毒害性, 以此能提高产 物产量。采用本发明的发酵工艺合成产物 7, 15- 二羟基雄甾烯酮时, 底物投料浓度可以达 到 8g/L( 底物重量 / 发酵液体积 ), 转化率可以达 到 90% 左右。此方法提供的底物投料方式与一次 性投料相比, 减小底物对细胞毒害性, 能在一定程 。
3、度上提高产物得率, 并且提高底物投料量。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 底物预诱导制备 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的方法, 采用以亚麻刺盘胞菌 (Colletotrichum lini) ST-1 为菌种发酵生产 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的生产工艺, 其 特征是 : 以液体种子培养基培养种子, 再转接到发酵培养基进行培养, 发酵过程初期加入一 定量的底物去氢表雄酮进行预诱导, 培养一段时间再投。
4、加底物继续转化以完成发酵。 2. 根据权利要求 1 所述的方法, 以液体种子培养基培养种子, 再转接到发酵培养基进 行培养, 其特征为 : 种子培养基组分为葡萄糖 1015 g/L, 豆饼粉 815g/L, 酵母粉 1015g/ L, 玉米浆 23g/L, 其余为水, pH 自然 ; 发酵培养基其组分为葡萄糖 1015 g/L, 酵母粉 1015g/L, 玉米浆 23g/L, 其余为水, pH 自然。 3. 根据权利要求书 1 所述的方法, 其特征为 : 转化条件为 2830, 转速 200220rpm。 4. 根据权利要求书 1 所述的方法, 其特征为 : 发酵过程初期 1014h 先加入 。
5、1.03.0g/ L 的底物进行预诱导, 继续培养至 24h 再投加底物进行转化, 48h 后放瓶完成发酵过程。 权 利 要 求 书 CN 102757997 A 2 1/3 页 3 底物预诱导制备 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域, 具体涉及一种以亚麻刺盘胞菌 (Colletotrichum lini) ST-1 为菌种发酵过程底物预诱导高效制备 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的方法。 背景技术 0002 屈螺酮 (DRSP) 为醛固酮拮抗剂, 具有抗矿物皮质酮活性的作用。它与乙炔雌二醇 结合使用构成新型高效单相口服避孕药 Yasmin。而 7。
6、, 15- 二羟基雄甾烯酮则是生产 屈螺酮的重要医药中间体, 其生产方式主要有传统的化学合成法、 半合成法、 生物转化法三 类。 0003 7, 15- 二羟基雄甾烯酮是由去氢表雄酮经过 7 位和 15 位的羟化作用生成, 如 果该反应通过纯化学方法实现, 则需要将近十步的繁琐反应, 且反应过程需要大量的有毒 试剂等等。生物转化的方法通过微生物将其直接羟化, 生产工艺简单, 减少了合成步骤、 降 低了能耗, 并大幅削减了污染物的排放, 属于先进的清洁生产工艺路线。通过此方法生产, 较之化学合成法与半合成法, 可大量节省生产成本, 并做到绿色环保, 在甾体的药物的合成 中发挥着重要的作用。 据相。
7、关文献报道, 目前已有赤霉菌、 亚麻刺盘胞菌等菌株具有去氢表 雄酮 7, 15 双羟化能力, 但其转化能力有限, 所以转化工艺的进一步改进是甾体生物转 化研究的一大问题。 0004 亚麻刺盘胞菌是已经报道的能将去氢表雄酮转化为 7, 15- 二羟基雄甾烯酮 的菌株, 底物投料浓度为8g/L, 转化效率一般为85%左右。 本发明则是在原有的发酵工艺上 作一定的改进, 转化率提高了 4.5% 左右。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种用亚麻刺盘胞菌 (Colletotrichum lini) ST-1 转化 去氢表雄酮生成 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的工艺, 在发酵初期投加一定浓度的底。
8、物去氢 表雄酮, 再补加底物继续转化, 这样既能对转化过程的关键酶进行预诱导, 又能减小一次性 投料甾体底物对细胞造成的毒害性, 以此提高 7, 15- 二羟基雄甾烯酮产率的方法。该 菌于 2012 年 4 月 24 日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号的中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心, 保藏编号为 CGMCC No.6051, 分类命名为亚麻刺盘胞菌 (Colletotrichum lini) 。 0006 一种在亚麻刺盘胞菌生物转化去氢表雄酮发酵过程中流加过氧化氢高效制备 7, 15- 二羟基雄甾烯酮的方法, 具体工序如下 : (1) 亚麻刺盘胞菌 (Colle。
9、totrichum lini) ST-1 按常规方法进行活化培养, 将该培养 液涂布到 PDA 培养基上, 将接种菌种的斜面置于 30的恒温培养箱中, 培养 45 天, 得到成 熟的孢子。 0007 (2)种子培养 : 将步骤 (1)的 PDA 固体培养基上成熟孢子接种于已灭菌的装有 100mL种子培养基的500mL摇瓶中, 在2830, 200220rpm摇床上培养34天, 得到适于接 说 明 书 CN 102757997 A 3 2/3 页 4 种的种子培养液。 0008 (3) 发酵培养 : 将步骤 (2) 中培养好的种子培养液以 8%10% (v/v) 的接种量接入发 酵培养基, 装液。
10、量为 250 mL 锥形瓶中装 30mL 发酵培养基, 培养温度为 2830, 在 200220 rpm 的转速下培养 1014h, 精确称取 1.03.0g/L 的底物去氢表雄酮投入菌体培养液, 继续 发酵培养至24小时, 再取适量底物, 投入发酵液, 使其终浓度为8g/L, 在转化温度2830, 200220rpm 的转速下转化 4860h 放瓶, 即得转化液。 0009 (4)产物检测 : 将步骤 (3)的转化液取 1mL, 加入 1mL 乙酸乙酯, 用振荡器震荡 1min, 离心取上清, 抽提 3 次, 合并抽提液后于真空离心浓缩仪中离心至有白色晶体出现, 乙腈复溶晶体并通过0.22 。
11、m的有机膜过滤除杂, 滤液用HPLC分析, 外标法对样品进行定 量并计算产物的率。HPLC 条件为色谱仪 : 戴安 Ultimate 3000 ; 色谱柱 : C18 柱 ; 检测器 : Ultimate 3000 variable wavelength detector ; 流动相 : 乙腈 : 水=70:30 ; 流速 : 0.5mL/ min ; 进样量 : 10L ; 柱温 : 30。 0010 其中步骤 (1) 中所述的 PDA 培养基的成分及配比为 : 土豆 200500 g/L ; 葡萄糖 2050 g/L ; 酵母粉210 g/L ; 琼脂粉1020 g/L ; pH自然, 在。
12、121高压蒸汽下灭菌20min ; 步骤 (2)所述种子培养基的成分及配比为 : 葡萄糖 1015 g/L ; 豆饼粉 815g/L ; 酵母粉 1015g/L ; 玉米浆 23g/L ; 其余为水, pH 自然, 在 121高压蒸汽下灭菌 20min ; 步骤 (3) 所 述发酵培养基的成分及配比为 : 葡萄糖 1015 g/L ; 酵母粉 1015g/L ; 玉米浆 23g/L ; 其余 为水, pH 自然, 在 121高压蒸汽下灭菌 20min。 0011 本发明与原始工艺不同之处在于在发酵过程前期先加一定浓度底物再补加底物 进行发酵, 采用本发明生物转化制备 7, 15- 二羟基雄甾烯。
13、酮时, 底物投料浓度可以达 到 8g/L(底物重量 / 发酵液体积) , 转化率可以达到 90% 左右。与原有的发酵工艺相比, 底 物得率有所提高, 转化周期相对缩短。 0012 附图说明 : 图 1 为本发明在菌体培养液中转化的高效液相色谱图。 0013 图 2 为不同的底物预诱导时间对产物得率的影响。 0014 具体实施方式 0015 下面通过具体实施实例进一步描述本发明。 0016 实施例 1 : (1) 将接种菌种的斜面置于 30的恒温培养箱中, 培养 3 天, 得到成熟的孢子, 将孢子 接种于装有 100mL 种子培养基的 500mL 摇瓶中, 在 28, 220rpm 摇床上培养 。
14、4 天, 得到适于 接种的种子培养液。 0017 (2) 将种子培养液以 10% 的接种量接入装有 30mL 发酵培养基的 250mL 的摇瓶中, 以相同条件继续培养 24h, 得到菌体培养液。 0018 (3) 准确称取 8g/L 的底物投入到步骤 (2) 得到的菌体发酵液中, 相同条件下转化 60 小时放瓶。提取产物进行 HPLC 分析, 得到转化率为 83.79%。 0019 实施例 2 : 说 明 书 CN 102757997 A 4 3/3 页 5 (1) 斜面培养、 种子培养以及发酵培养同实施例 1。 0020 (2) 将种子培养液以 10% 的接种量接入装有 30mL 发酵培养基。
15、的 250mL 的摇瓶中, 培养 12h, 培养条件 28, 220rpm, 然后准确称取 2g/L(底物重量 / 发酵液体积) 底物投入 菌体液中继续培养 12h。 0021 (3) 准确称取 8g/L 的底物去氢表雄酮加入到步骤 (2) 得到的菌体培养液, 使底物 的投料终浓度为 8g/L, 继续转化 48h 放瓶。取发酵液 1mL 检测, 得转化率为 89.95%。 0022 实施例 3 : (1) 斜面培养、 种子培养以及发酵培养同实施例 1。 0023 (2) 将种子培养液以 10% 的接种量接入装有 30mL 发酵培养基的 250mL 的摇瓶中, 培养 8h, 培养条件 28, 2。
16、20rpm, 然后准确称取 2g/L(底物重量 / 发酵液体积) 底物投入菌 体液中继续培养 16h。 0024 (3) 准确称取 8g/L 的底物去氢表雄酮加入到步骤 (2) 得到的菌体培养液, 使底物 的投料终浓度为 8g/L, 继续转化 48h 放瓶。取发酵液 1mL 检测, 得转化率为 86.95%。 0025 实施例 4 : (1) 斜面培养、 种子培养以及发酵培养同实施例 1。 0026 (2) 将种子培养液以 10% 的接种量接入装有 30mL 发酵培养基的 250mL 的摇瓶中, 培养 15h, 培养条件 28, 220rpm, 然后准确称取 2g/L(底物重量 / 发酵液体积。
17、) 底物投入 菌体液中继续培养 9h。 0027 (3) 准确称取 8g/L 的底物去氢表雄酮加入到步骤 (2) 得到的菌体培养液, 使底物 的投料终浓度为 8g/L, 继续转化 48h 放瓶。取发酵液 1mL 检测, 得转化率为 84.35%。 0028 实施例 5 : (1) 斜面培养、 种子培养以及发酵培养同实施例 1。 0029 (2) 将种子培养液以 10% 的接种量接入装有 30mL 发酵培养基的 250mL 的摇瓶中, 培养 12h, 培养条件 28, 220rpm, 然后准确称取 4g/L(底物重量 / 发酵液体积) 底物投入 菌体液中继续培养 12h。 0030 (3) 准确。
18、称取 4g/L 的底物去氢表雄酮加入到步骤 (2) 得到的菌体培养液, 使底物 的投料终浓度为 8g/L, 继续转化 48h 放瓶。取发酵液 1mL 检测, 得转化率为 82.35%。 0031 实施例 6 : (1) 斜面培养、 种子培养以及发酵培养同实施例 1。 0032 (2) 将种子培养液以 10% 的接种量接入装有 30mL 发酵培养基的 250mL 的摇瓶中, 培养 12h, 培养条件 28, 220rpm, 然后准确称取 0.5g/L(底物重量 / 发酵液体积) 底物投 入菌体液中继续培养 12h。 0033 (3) 准确称取 7.5g/L 的底物去氢表雄酮加入到步骤 (2) 得到的菌体培养液, 使底 物的投料终浓度为 8g/L, 继续转化 48h 放瓶。取发酵液 1mL 检测, 得转化率为 84.05%。 说 明 书 CN 102757997 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757997 A 6 。