技术领域
本发明涉及荧光染料，具体地讲，本发明涉及适合用于生物样品 染色的不对称菁类荧光染料，包含所述荧光染料的组合物及其在生物 样品染色中的用途。
背景技术
荧光分析技术由于激光、微处理机和电子学等一些新的科学技术 的引入和飞速发展，极大地推动了荧光分析的广泛应用。尤其近年来 以荧光染料为标识剂的生物芯片的出现，使该技术在细胞免疫学、微 生物学、分子生物学、分子遗传学、病理学、临床检验学、植物学等 方面具有广阔的应用前景。荧光染料的开发是发展荧光分析技术的具 有决定性作用的因素。
早期应用的染料包括新亚甲蓝(NMB)、亮甲苯蓝(BCB)、派 诺宁Y、溴乙锭等。它们通过嵌入或静电吸引与核酸分子形成复合物， 从而可以在显微镜下观察增强后的荧光。但是这些染料自身也可以形 成染料复合物，不能明显区别于染料与核酸形成的复合物，造成高的 荧光背景干扰。同时，这些染料的荧光量子效率较低，降低了荧光增 强的程度，影响检测结果的准确性。
吖啶橙也应用在荧光分析中，可以和核酸形成复合物，使荧光增 强。这类染料分子相互之间在能量传递的过程中可能会导致光淬灭， 使得染料核酸复合物没有荧光发出，影响检测结果真实性。同时在流 式细胞分析仪中，吖啶橙和塑料管路有较强的作用，会增加背景荧光 强度。为了清除测试后残留的染料和保证测试结果的准确性，需要仪 器进行长时间的管路清洗，这就降低了仪器的分析效率。
美国专利4957870提出了一类噻唑蓝染料用于检测核酸和血液中 的网织红细胞。该类染料使用的激发波长在488nm，需要使用价格高 昂的激光器做光源，增加了仪器的使用成本。同时，这类染料需要较 长的孵育时间，才能和核酸较好的结合。
美国专利5994138公开了一种用于血液中网织红细胞染色的染 料，它需要在35℃以上的反应条件下才能得到良好的检测结果，对仪 器的使用条件提出了较高的要求。
目前使用的菁类荧光染料，如TOTAB、TOTIN、TO-PRO-3、 PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M.Sovenyhazy,J.A.Bordelon,J.T.Petty. NucleicAcidsRes,2003,31,2561]，它们的吸收和发射都在近红外区 (670-1000nm)，但这类染料的分子结构比较复杂，合成路线较长，收 率较低，因而价格高，限制了其使用范围。
因此，需要开发新的荧光染料，该荧光染料优选具有以下性质： 无核酸时染料自身不发荧光，与核酸形成复合物后时具有良好的荧光 量子产率，光谱在近红外区，避免背景荧光的干扰；可以在633nm附 近被激发，从而可以使用价格低廉的激光器作为激发光源；具有一定 水平的水溶性，同时具有一定的穿过细胞膜的能力。
发明内容
本发明的上述种种目的通过提供本发明化合物而得以实现。因 此，本发明一方面提供了一种具有以下通式I结构的化合物：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
R3、R4各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6、苄基， 其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、 硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、 酰氨基、羧基，条件是R3和R4不同时为苄基；且R3为苄基时R4不 为C1-18烷基OR6；
R5为C1-18烷基或者H；
R6为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任 选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂 环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
Y-为负离子。
本发明还一方面提供一种缀合物，所述缀合物包含上述式I化合 物。
本发明另一个方面还提供用于生物样品染色的组合物，所述组合 物包含上述式I化合物或其缀合物。
本发明再一方面还提供了本发明式I化合物或其缀合物或组合物 在对生物样品进行染色中的用途。
本发明的化合物、缀合物或组合物对生物样品如核酸、白细胞、 有核红细胞、网织红细胞等具有良好的染色作用，其形成的复合物发 射波长在近红外区，避免了生物自身的荧光背景干扰，有助于提高检 测结果的精确度，同时可在流式细胞分析仪上用作各种生物样品的染 色剂。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图 和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1是Dye-1与含不同浓度鲑鱼精DNA结合后在磷酸盐缓冲液 (PBS)中的荧光发射光谱。
图2是Dye-1在PBS中与鲑鱼精DNA结合前后的荧光发射光谱。
图3是Dye-1与含不同浓度甲鱼肝RNA结合后在磷酸盐缓冲液 (PBS)中的荧光发射光谱。
图4是Dye-1在PBS中与甲鱼肝RNA结合前后的荧光发射光谱。
图5是Dye-2与含不同浓度鲑鱼精DNA结合后在磷酸盐缓冲液 (PBS)中的荧光发射光谱。
图6是Dye－2与含不同浓度甲鱼肝RNA结合后在磷酸盐缓冲液 (PBS)中的荧光发射光谱。
图7是Dye-2在PBS中与鲑鱼精DNA结合前后的荧光发射光谱。
图8是Dye-2在PBS中与甲鱼肝RNA结合前后的荧光发射光谱。
图9是Dye-3在PBS中与鲑鱼精DNA结合前后的荧光发射光谱。
图10是Dye-3在PBS中与甲鱼肝RNA结合前后的荧光发射光 谱。
图11是Dye-0，Dye-1和Dye-2在PBS中与甲鱼肝RNA结合后 的荧光发射光谱对比。
具体实施方式
定义
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结 合使用，指包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子 的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”，则只特指直 链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例 如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异 丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“烷氧基”是指与基团-O-结合的上述定义的 “烷基”，其中所述“烷基”包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最 优选1-6个碳原子，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“苄基”是指-CH2-Ph基团。当用“任选取代” 修饰苄基时，指该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代 基在任何合适的位置取代。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、 巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、 烷基氨基、酰氨基、羧基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望 的性质。优选苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
本文中使用的术语“杂环基”是指包含3-14、优选3-10、更优选 3-6个环成员并包含一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子的单环或稠 环体系。
本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于核酸、血液中的白 细胞、有核红细胞、网织红细胞等。
本发明的化合物
本发明提供了一种具有以下通式I结构的化合物：
其中
n为1、2或3；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
R1和R2各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
R3、R4各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6、苄基， 其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、 硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、 酰氨基、羧基，条件是R3和R4不同时为苄基，且R3为苄基时R4不 为C1-18烷基OR6；；
R5为C1-18烷基或者H；
R6为C1-18烷基、H或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任 选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂 环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；
Y-为负离子。
优选n为1或2，更优选n为1。
优选X为C(CH3)2、O或S；更优选X为C(CH3)2或S；最优选X 为S。
优选R1和R2各自独立选自H或C1-18烷基；更优选R1和R2各自 独立选自H或C1-6烷基；最优选R1和R2均为H。
优选R3和R4各自独立选自C1-8烷基COOR6、C1-8烷基OR6、苄 基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代；更 优选R3和R4各自独立选自C1-6烷基COOR6、C1-6烷基OR6、苄基， 所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基或氨基任选取代。
优选R5为H或C1-12烷基，更优选R5为H或C1-6烷基。
优选R6为C1-6烷基或者苯基，所述苯基由卤素、羟基、巯基、 氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基 氨基、酰氨基、羧基任选取代。
Y-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负 离子或有机负离子，例如卤素离子、ClO4-、PF6-、CF3SO3-、BF4-、乙 酸根或对甲苯磺酸根负离子。
本发明化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的 染色。或者，在一个实施方案中，本发明化合物可作为式I化合物的 衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使 用的“缀合物”是指本发明荧光染料通过共价键与其它分子连接而形 成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分 特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底 物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物温育一段时间，使得该荧 光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀 合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进 行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧 光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明 荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。
或者，在另一个实施方案中，该荧光缀合物还可用于固相免疫测 试，例如夹心型免疫测试。固相免疫测试的技术是本领域公知的，可 由标准教科书获得。本发明的荧光缀合物可用作固相免疫测试中的各 种合适成分。
本发明的化合物的制备方法
本发明化合物可通过本领域熟知的通用方法合成得到，参见例如 同属于本申请人的同时待审的中国专利申请CN200710137258.6。所述 专利申请通过引用结合到本文中来。具体地讲，本发明的不对称菁类 荧光染料的一般通过以下流程合成：首先由未取代或取代的2-甲基苯 并噻唑、2-甲基苯并唑或2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉等原料开始，使其 与式R3X(X为F、Cl、Br或I)的卤化物反应，两者的摩尔比为1：1-2， 在甲苯中回流12-36小时，可制得季铵盐中间体II：
其中X、R1、R3和Y-如式I化合物中所述定义；
然后，将制得的季铵盐中间体II与连接分子缩合，可得到式III 化合物：
其中X、n、R1、R3和Y-如式I化合物中所述定义，连接分子可 为N,N’-二苯基甲脒或其高级同系物；
通过与制备式II化合物类似的方法得到取代或未取代的4-甲基 喹啉季铵盐中间体，最后将其与式III化合物在吡啶或醋酐的作用下 回流，即可得到本发明的不对称菁类荧光染料。所得荧光染料可通过 本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术 人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单 地制备得到。
应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有一些可在上述步骤 进行之前或刚完成后，通过标准的芳族取代反应来引入或通过常规的 官能团修饰来产生，这包括在本发明的方法步骤方面。这种反应和修 饰包括例如取代基通过芳族取代反应的引入、取代基的还原、取代基 的烷基化和取代基的氧化。用于这些过程的试剂和反应条件是化学领 域公知的。芳族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，用例如 酰卤和路易斯酸(如三氯化铝)在FriedelCrafts条件下引入酰基，用烷 基卤和路易斯酸(如三氯化铝)在FriedelCrafts条件下引入烷基，和引 入卤素基团。修饰的具体实例包括通过例如用镍催化剂进行催化氢化 或者用铁在盐酸存在下进行加热处理，将硝基还原成氨基；将烷硫基 氧化成烷基亚磺酰基或烷基磺酰基。
包含式I化合物的本发明荧光缀合物可通过任何本领域已知的常 规方法合成。
本发明的组合物
本发明还提供包含上述式I化合物或其缀合物的组合物，所述组 合物用于生物样品的染色。
本发明的组合物除包含式I化合物或其缀合物外，还可包含生物 样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、 表面活性剂等。本发明的组合物可作为水溶液形式存在，或者可作为 临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明化合物或组合物的应用
本发明还提供使用上述式I化合物或包含式I化合物的组合物以 染色生物样品的方法，该方法包括使上述式I化合物或其缀合物或包 含式I化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接 触”可包括在溶液或固相中接触。
特点
由以上描述以及本领域技术人员公知的常识，可了解本发明荧光 染料的各种优点，包括但不限于以下：
(1)本发明提供的化合物对DNA有良好的染色作用，形成染料 /DNA复合物后荧光发射强度较染料自身荧光有40～100倍提高。
(2)本发明提供的化合物对RNA亦有良好的染色作用，形成染 料/RNA复合物后荧光发射强度较染料自身荧光有20～40倍左右的提 高。
(3)染料/核酸复合物发射波长在640nm-900nm的近红外区， 避免了生物自身的荧光背景干扰，有助于提高检测结果的精确度。
(4)本发明提供的化合物可在流式细胞分析仪上用做血液中网 织红细胞、白细胞、有核红细胞的染色剂。
(5)本发明提供的化合物和核酸结合后可以用红色半导体激光 器发射的633nm波长光激发，从而有助于降低仪器价格。
实施例
以下通过具体实施例对本发明作出详细说明，但本领域技术人员 会理解，本发明不限于此。
实施例1
Dye-1的合成
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-己酸乙 酯基-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃油 浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量的 乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－己 烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率42％。取4.0mmol该反应产物， 向其中加入1-苄基-4-甲基喹啉季铵盐4.2mmol及吡啶10ml，90℃油 浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中，析出暗 紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲 烷:甲醇＝100:10梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条件下真空干燥箱 中干燥24小时，得到标题化合物，收率53％。
MS(EI)C34H35BrN2O2Sm/z:535.2[M-Br]+。
实施例2
Dye-2的合成
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-(2-羟基 乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃ 油浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量 的乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－ 己烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率41％。取4.0mmol该反应产 物，向其中加入1-(丁酸乙酯基)-4-甲基喹啉季铵盐4.5mmol及吡啶 10ml，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙 醚中，析出紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗 脱液二氯甲烷:甲醇＝100:18梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条件下 真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率49％。
MS(EI)C27H29BrN2O3S:m/z:461.2[M-Br]+。
实施例3
Dye－3的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-(2-苯氧 乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃ 油浴上加热搅拌5小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量 的乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－ 己烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率47％。取4.0mmol该反应产 物，向其中加入1-(2-羟基)-乙基-4-甲基喹啉季铵盐4.2mmol及吡 啶10ml，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入 乙醚中，析出紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用 洗脱液二氯甲烷:甲醇＝100:15，收集蓝色组分，在45℃条件下真空干 燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率40％。
MS(EI)C29H27BrN2O2Sm/z:467.2[M-Br]+。
实施例4
Dye－4的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-丁酸乙 酯基-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃油 浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量的 乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－己 烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率40％。取4.0mmol该反应产物， 向其中加入1-(4-甲氧基苯基)-4-甲基喹啉季铵盐4.2mmol及吡啶 10ml，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙 醚中，析出紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗 脱液二氯甲烷:甲醇＝100:8梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条件下 真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率61％。
MS(EI)C33H33BrN2O3Sm/z:537.2[M-Br]+。
实施例5
Dye-5的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-丁酸乙 酯基-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃油 浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量的 乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－己 烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率40％。取4.0mmol该反应产物， 向其中加入1-(4-氟苯基)-4-甲基喹啉季铵盐4.2mmol及吡啶10ml， 90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中， 析出紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二 氯甲烷:甲醇＝100:8梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条件下真空干 燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率49％。
MS(EI)C32H30BrFN2O2Sm/z:525.2[M-Br]+。
实施例6
Dye-6的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-丁酸乙 酯基-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃油 浴上加热搅拌6小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量的 乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－己 烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率40％。取4.0mmol该反应产物， 向其中加入1-(2-羟基)-乙基-4-甲基喹啉季铵盐4.2mmol及吡啶10ml， 90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中， 析出紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二 氯甲烷:甲醇＝100:14梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条件下真空干 燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率43％。
MS(EI)C27H29N2O3Sm/z:461.2[M-Br]+。
实施例7
Dye－7的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-(2-苯氧 乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃ 油浴上加热搅拌5小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量 的乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－ 己烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率47％。取4.0mmol该反应产 物，向其中加入1-苄基-4-甲基喹啉季铵盐4.2mmol及吡啶10ml，90℃ 油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液倒入乙醚中，析出 暗紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯 甲烷:甲醇＝100:10梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条件下真空干燥 箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率46％。
MS(EI)C34H29BrN2OSm/z:513.2[M-Br]+。
实施例8
Dye－8的制备
在40mL甲醇与20mL乙醇的混合溶液中，将10mmol1-(2-苯氧 乙基)-2-甲基苯并噻唑溴季铵盐与30mmolN,N’-二苯基甲脒于65℃ 油浴上加热搅拌5小时。反应结束后减压蒸除溶剂，然后加入一定量 的乙醚搅拌析出橙色固体粉末，过滤，干燥。将粗产物用乙酸乙酯－ 己烷重结晶，得到橘红色固体产物，收率47％。取4.0mmol该反应产 物，向其中加入1-(4-甲氧基苯基)-乙基-4-甲基喹啉季铵盐4.5mmol 及吡啶10ml，90℃油浴上加热搅拌1.5小时。冷却至室温后将反应液 倒入乙醚中，析出紫红色固体物，过滤，干燥。染料通过硅胶柱分离， 用洗脱液二氯甲烷:甲醇＝100:7梯度洗脱，收集蓝色组分，在45℃条 件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率51％。
MS(EI)C35H31BrN2O2Sm/z:543.2[M-Br]+。
实施例9
Dye－9的制备
在20ml溶剂(醋酸:醋酸酐＝1:1)中，将8mmol1-(2苯氧乙基) -2-甲基苯并噻唑季铵盐与10mmol丙二醛双苯基亚胺盐酸盐加热到 120℃，反应1小时后，冷却，加入乙醚析出固体。过滤，用30mL乙 酸乙酯冲洗3次，除去未反应的过量的缩合剂。干燥，得棕黄色粉末， 粗收率68％。取4.0mmol该反应产物，向其中加入1-(2-羟基)-乙基-4- 甲基喹啉季铵盐6mmol及吡啶10ml，110℃油浴上加热搅拌1小时。 将反应液冷却后倒入乙醚中，析出暗紫色小颗粒，过滤，干燥。染料 通过硅胶柱分离，用洗脱液二氯甲烷:甲醇＝100:15梯度洗脱，收集蓝 色组分，在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物， 收率43％。
MS(EI)C31H29BrN2O2S:m/z:493.2[M-Br]+。
实施例10
Dye-1在含不同浓度DNA的磷酸盐缓冲液(PBS)中荧光强度的测定：
精确称取一定量的Dye-1充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(体积比 例50：50)中，配制成浓度为5mM的染料溶液，过滤后使用。分别称 取一定量的鲑鱼精DNA，溶解在PBS缓冲液中，得到10mg/mL、 3mg/mL、1mg/mL、0.3mg/mL、0.1mg/mL的DNAPBS缓冲液。准 确量取2μL已经配制好的5mM染料,称取不同浓度的DNAPBS缓冲 液1μL分别加入到1mLPBS缓冲液中进行结合，反应一定时间后， 选定激发波长633nm,测定该复合物的发射光谱。测试温度为室温；所 用仪器为荧光分光光度计，型号：FL-4500。结果如附图1所示。从 图中可以看出，随着DNA浓度的增加，染料/DNA复合物的荧光发 射强度迅速增加。
图2为Dye-1在PBS中与DNA结合前后的相对荧光对比。从图 中可以看出，Dye-1的PBS溶液几乎没有荧光产生，和DNA形成复 合物后荧光强度迅速增强，最大激发峰在654nm左右，处于近红外 区，可以避免生物自身的荧光背景干扰。
实施例11
Dye-1在含不同浓度RNA的PBS中荧光强度的测定：
精确称取一定量的Dye-1充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(体积比 例50：50)中，配制成浓度为5mM的染料溶液，过滤后使用。分别称 取一定量的新鲜提取的甲鱼肝RNA，溶解在PBS缓冲液中，得到得 到100μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL的RNAPBS 缓冲液。准确量取2μL已经配制好的5mM染料,称取不同浓度的RNA PBS缓冲液1μL分别加入到1mLPBS缓冲液中进行结合，反应一定 时间后，选定激发波长633nm,测定该复合物的发射光谱。测试温度为 室温；所用仪器为荧光分光光度计，型号：FL-4500。结果如附图3 所示。从图中可以看出，随着RNA浓度的增加，染料/RNA复合物 的荧光发射强度同样迅速增加。
图4为Dye-1在PBS中与RNA结合前后的相对荧光对比。从图 中也可以看出，Dye-1和RNA形成复合物后荧光强度迅速增强，并且 产生了一定程度的红移，最大激发峰在655nm左右，处于近红外区， 在仪器检测中可避免生物自身的荧光背景干扰，因此可以提高检测的 精确度。
实施例12
Dye-2在含不同浓度DNA/RNA的PBS中荧光强度的测定：
测定方法与实施例10和11同。Dye-2与不同浓度DNA/RNA形 成复合物的荧光光谱为附图5和6。Dye-2与DNA/RNA在PBS中结 合前后的荧光对比分别如附图7和8所示。从图中可以看出，染料自 身几乎不产生荧光，而随着核酸的加入，与染料结合后荧光强度同样 迅速增加，最大激发峰都超过了650nm。
实施例13
Dye-3在含不同浓度DNA/RNA的PBS中荧光强度的测定：
测定方法与实施例10和11同。Dye-3与DNA/RNA在PBS中结 合前后的荧光对比分别如附图9和10所示。从图中可以看出，染料 自身在PBS溶液中产生的荧光很弱，与DNA/RNA结合后荧光强度增 加明显，最大激发峰都超过了650nm。
表1比较了Dye-1、Dye-2和Dye-3与鲑鱼精DNA在PBS中结 合前后的荧光增强比例。
表1
表2比较了Dye-1、Dye-2和Dye-3甲鱼肝RNA在PBS中结合 前后的荧光增强比例。
表2
实施例14
Dye-0在RNA的PBS中荧光强度的测定：
为了说明本发明的化合物对荧光染料性能的优化改进，选择具有 如下结构的已知化合物Dye-0作为参照(JournaloftheAmerican ChemicalSocitey(1945)67,18889-93)：
测定方法与实施例10相同。Dye-1和Dye-2与Dye-0以相同的 浓度和甲鱼肝RNA结合后的荧光光谱如图11所示。从图中可以清晰 地看出，Dye-1和RNA结合后荧光强度增加幅度最大，Dye-2与RNA 结合后的荧光强度也有明显增加，并且大于Dye-0与RNA结合后的 增加幅度，说明在和核酸的结合能力上，Dye-1和Dye-2要优于Dye-0。
实施例15
Dye-1、Dye-2、Dye-3和Dye-0在乙醇中的荧光量子产率的测定：
配置一定浓度的化合物Dye-1、Dye-2、Dye-3和Dye-0的乙醇溶 液，满足经紫外可见分光光度计测定最大吸收值＜0.1。分别选定激发 波长测定荧光强度。每种染料均平行测定三次，算出荧光量子产率， 取平均值,在室温下进行测定。以罗丹明B作为标准物(ΦF＝0.97,乙 醇)计算，在乙醇溶液中已知化合物M的荧光量子产率ΦF＝1.099× 10-2；Dye-1的荧光量子产率ΦF＝1.590×10-2；Dye-2的荧光量子产率 ΦF＝1.248×10-2；Dye-3的荧光量子产率ΦF＝1.181×10-2；。所用仪 器为紫外可见分光光度计，型号：Lambda35；荧光分光光度计，型 号：FL-4500。
数据显示，本发明化合物相对已知化合物，显示出较高的荧光量 子产率。
已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领 域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发 明作出各种修改、变更和替换。