一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102757963 B (45)授权公告日 2013.12.25 CN 102757963 B *CN102757963B* (21)申请号 201110334969.9 (22)申请日 2011.10.23 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 相建海 赵翠 郇聘 张晓军 李富花 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子 。

2、(57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体的说是一种 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子。采用 BAC 克隆 筛选及测序分析、 启动子预测、 DNA 扩增及测序、 载体构建等技术得到栉孔扇贝热休克蛋白基因启 动子， 具有序列表中 SEQ ID NO.1 碱基序列 ； 在此 基础上用所克隆的启动子与携带加强型绿色荧光 蛋白 (EGFP) 的质粒结合， 构建了栉孔扇贝自源启 动子的 EGFP 基因表达载体。本发明获得栉孔扇 贝热休克蛋白基因启动子， 其采用含目的基因的 BAC 克隆全测序及启动子预测方法， 比传统的染 色体步移方法更简单快捷。 (51)Int.Cl. 审查员 王超 权利要求书 1 页。

3、 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102757963 B CN 102757963 B *CN102757963B* 1/1 页 2 1. 一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子 , 其特征在于 ： 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动 子为序列表中 SEQ ID NO.1 碱基序列。 2. 一种权利要求 1 所述的栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的应用 , 其特征在于 ： 所述 启动子作为启动 EGFP 基因在昆虫 sf9 细胞中表达的用途。 3. 按权利要求 2 所。

4、述的栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的应用 , 其特征在于 ： 所述启 动子与与之进行可操作的 EGFP 基因连接， 而后插入载体中构成表达载体。 4. 按权利要求 3 所述的栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的应用 , 其特征在于 ： 以可表 达的方式将 EGFP 基因与所述的启动子连接， 得重组片段 ； 将上述重组片段插入载体中 ； 用 该载体转化昆虫 sf9 细胞， 培养该细胞表达 EGFP 蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102757963 B 2 1/6 页 3 一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地说是一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子。 背景。

5、技术 0002 栉孔扇贝是我国重要的海水养殖种类， 在我国北方有广大的养殖面积， 具有重要 的经济意义。当前， 栉孔扇贝的养殖业存在着种质退化、 病害频发的难题， 严重制约了我国 栉孔扇贝养殖业的健康发展 ( 张福绥， 杨红生 . 栉孔扇贝大规模死亡问题的对策及应急措 施 . 海洋科学， 1999， 2 ： 1-5.)。 0003 转基因是物种种质改良的重要手段， 其一般指将人工构建的基因功能元件导入到 生物体基因组中， 达到改变生物体的性状的目的。 当前， 转基因技术在经济动植物的性状改 良中表现出了巨大的潜在应用价值， 如转抗病害基因农作物， 转生长因子鲑鱼以及可以在 乳腺中分泌药物的转基。

6、因动物 ( 生物反应器 ) 等。转基因技术在栉孔扇贝中也有着广阔的 应用前景， 如将抗病基因导入扇贝中， 产生抗病品系， 将有可能从根本上解决当前扇贝养殖 业中夏季病害频发的顽疾 ； 将生长因子类的基因导入扇贝中， 有希望培育出高产、 低生长周 期的品系， 缩小养殖成本， 增加养殖效益。 0004 当前， 在栉孔扇贝中尚无转基因的应用。 除导入及整合方法的限制外， 可用基因元 件 ( 包括扇贝源启动子和功能基因 ) 的缺乏也是重要的限制因素之一。启动子是人工构建 转基因载体的不可或缺的重要组成成份， 它决定了所转入的基因的表达情况， 如表达时间、 部位、 强度等等。热休克蛋白 HSP70 是一。

7、种重要的生物活性蛋白， 参与了生物体内众多的生 理过程。 Hsp70基因表达的一个重要特征是呈诱导型表达， 在高温或病原刺激下有明显的上 调表达 ； 而这种表达特征主要取决于 hsp70 基因的启动子组成。将 hsp70 基因的启动子元 件应用于转基因研究中， 可以通过控制温度的高低方便地改变导入基因的表达时机和表达 量， 使生物体的性状按照人类的意志进行改变， 有重要的应用价值。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子。 0006 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0007 一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子 ： 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子为下述任。

8、 一项 ： 0008 (1) 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子为序列表中 SEQ ID NO.1 碱基序列 ； 0009 (2) 与序列表中 SEQ ID NO.1 限定的 DNA 序列具有 80以上同源性的 DNA 序列 ； 0010 (3) 是序列表中 SEQ ID NO.1 的片段、 遗传变体或缺失体， 且能控制下游基因转录 的 DNA 分子。 0011 所述启动子作为启动海洋生物组织特异性地表达目标基因的启动子的用途。 0012 所述启动子与与之进行可操作的有效基因连接， 而后插入载体中构成表达载体。 所述有效基因如免疫相关基因 LGBP、 hsp70、 lectin、 toll 等， 生。

9、长相关基因如 myostatin、 说 明 书 CN 102757963 B 3 2/6 页 4 actin、 tubulin、 EGF 等， 其它重要生理基因如 vasa、 SOX、 BMP、 NOTCH 等 ； 载体为表达载体如 pCMVp-NEO-BAN、 pEGFP、 pEGFT-Actin、 pSV2、 CMV4 等。 。 0013 而后以可表达的方式将有效基因与所述的启动子连接， 得重组片段 ； 将上述重组 片段插入载体中 ； 用该载体转化宿主细胞， 培养该细胞表达有效基因。 0014 本发明具有如下优点 ： 0015 1. 本发明获得栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子， 其采用 BAC。

10、 克隆全测序及启动子 预测方法， 比传统的染色体步移方法更简单快捷。 0016 2. 本发明将栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子用于转基因载体构建的优势在于 ： 0017 (1) 热休克蛋白 hsp70 是一种诱导表达的基因， 其基因启动子在热刺激后表现出 高表达现象。相比于一些持续性表达的载体， 其在表达某些对扇贝有害的基因时就体现出 较强的优势， 如 caspase 基因， 可以诱导其在特殊时期表达， 避免持续表达导致机体伤亡。 另外， 热休克蛋白参与了扇贝体内多种生理过程， 必定为一个高效表达的调控元件 ； 用热休 克蛋白基因启动子构建转基因载体， 所携带的外源基因表达效率很可能会大大提高。 。

11、0018 (2) 在扇贝转基因实验中使用扇贝自身启动子， 不会带入病毒等其他生物的核酸 序列， 具有更高的生物安全性， 有利于将来转基因扇贝进入市场。 0019 3.本发明使用EGFP基因为报告基因构建转基因载体的优点在于EGFP是加强型绿 色荧光蛋白， 容易观察和检测， 能极大地提高转基因动物的筛选效率， 有利于扇贝转基因技 术的建立。 附图说明 0020 图1为栉孔扇贝转基因表达载体pCfHs pP1-EGFP构建示意图。 图2为栉孔扇贝热 休克蛋白基因启动子表达载体 pCfHs pP1-EGFP 转染昆虫细胞 sf9 的荧光观察结果图 ( 其 中， 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子载体转染昆。

12、虫细胞sf9的荧光观察。 a为未热激组荧光 表达情况 ； b 为热激后 6h 荧光表达情况 ； c 为热激后 48h 荧光表达情况 )。 具体实施方式 0021 本发明利用 BAC 克隆筛选技术、 启动子预测技术、 DNA 扩增及测序技术克隆了栉孔 扇贝热休克蛋白基因启动子 ； 在此基础上利用载体构建技术将所克隆的启动子与携带加强 型绿色荧光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein， EGFP) 的质粒结合， 构建了携带 栉孔扇贝自源启动子和 EGFP 报告基因的表达载体。 0022 实施例 1 含栉孔扇贝热休克蛋白基因 hs p70 的 BAC 克隆的筛选。

13、 0023 根 据 栉 孔 扇 贝 hsp70 基 因 序 列 (GenBank No. ： AY206871) 设 计 Overgo 探 针 ( 正 向 引 物 5 - TAGGAGATGCCGCCAAGAACCAA-3 ，反 向 引 物 5 -GGGATTCATTGCCACTTGGTTCT-3 )， 对 BAC 文库高密度 DNA 薄膜进行 Overgo 探针杂交， 筛选以确定含有 hsp70 基因的阳性克隆在文库中的位置， 并进行 PCR 验证。步骤如下 ： 0024 1. 预杂交 ： 将高密度 DNA 薄膜正面向上放入杂交盒， 杂交盒内倒入预热至 50的 杂交液， 将杂交盒放到杂交炉中。

14、， 50缓慢转动， 预杂交至少 2h。 0025 2. 探针制备 ： 将 Overgo 的两条单链等摩尔数混合， 95 10min， 然后室温放置 10min。 说 明 书 CN 102757963 B 4 3/6 页 5 0026 稀释 Overgo 探针至 25ng/l， 按照以下体系进行探针标记， 37延伸 1h ： LSO 12l ； 0.5U/ul Klenow 2l ； 32P-dCTP 2l ； Overgo probe DNA 6l ； ddH2O 3l ； 总 体积 25l。 0027 3. 标记反应体系中加入等体积 (25l)0.4M NaOH， 室温放置 10min ； 。

15、0028 4. 将放射性同位素探针小心加入杂交液， 50杂交炉内缓慢转动杂交 48h。 0029 5.洗脱 ： 将含有放射性32P探针的杂交液小心倒入放射性废液存储罐中， 加入预 热到 50的杂交洗脱液， 放回杂交炉缓慢洗脱 30min ； 0030 6. 将高密度 DNA 薄膜正面向上放到吸水纸上， 待上表面多余洗脱液被吸水纸吸收 后用塑料保鲜薄膜将高密度 DNA 薄膜密封包裹起来， 在暗室中用 X 光底片曝光。 0031 7. 对照 X 底片上的阳性信号位置， 找到相应的阳性克隆编号。 0032 8. 挑取阳性克隆进行活化、 PCR 验证并保种。根据公布的 hsp70 基因序列 (GenB。

16、ank No.DQ466080) 设计正向引物 ： 5 - TCTCGACACTAGGCACTTC-3 ； 反向引物 ： 5 -AGCACTCAGGTAGGCGTTT-3。以阳性克隆菌液为模板， 进行 PCR 扩增。将 PCR 产物测 序， 证实确为扇贝热休克蛋白基因 hsp70 序列。对确定含有栉孔扇贝热休克蛋白基因序列 的 BAC 克隆进行全测序。 0033 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子， 如 SEQ ID NO 1. 所示序列 ： 0034 1 GCTCACTCTACAGTTGGTCGCCCCGATGTCCACACCAAATACTCGTGGACGGGCTGGTTT 60 0035 61 。

17、CAGTTTAGGAGCTATGTTGTTCATTCTCGTTATCTGTATTGATTACAAATCGCTGCAACA 120 0036 12 AACAGTTTTTTTTTGTTGACAAAAAGTGTCGATTTGACGAAAGTGGGGAAAAAAGATGGG 180 0037 181 AAATTGTTTGGTGGACACAAGAAAACACTCTCAACAACTTTGAAAATGATTAATATACTT 240 0038 241 GGATTCAAAACTTTAGCATTCGCATTCACAAGTAGTCCGAATAAACGTTATTCGACGACA 300 0039 301 GGCCG。

18、ATATTAAAAACAGTCGATATAACGTCAGAATAATTCGGACTAACTTACGTTGTAC 360 0040 361 ATGTGTTGTACAAATCGAAACACTGGACTGTGATATCTCGACACATATCCATAGTACTTC 420 0041 421 ATCCACGAACTATTCTAGATTAGTACTCTATGTCAAATAAACGTTTTATTTAACTATTTT 480 0042 481 CAAGTCACAGACATACACAAGAATCAACCCAACCGCCAAATTTGTATCTAACCTGAAAGG 540 0043 541 TGTACAAAA。

19、AATGCTCGTCTAAATGGAAGTATAACGCATGGTAAGACGTTTTGAAATTTA 600 0044 601 ATTCTAATTCATCTTAAGGTAAATTCTTTTTACCTCAGGTTAAGTTTTTTTTTAAATTAA 660 0045 661 AAAATAGTTTTTACTTAAGTGAAACAAAAAAAATTATAATTTTACTCTGATACATTAGTT 720 0046 721 TAAATGGTCGAAAGTAAAACACACATGGACCCCGGTTTCATCAACGTTCCTTAACTTAAA 780 0047 781 ATTTTCCATATGA。

20、AAGCATTACAGAATTTTAAGAAAAAGCCTTAGTTGAGGAACCTTCCT 840 0048 841 TAAATTATTTAATTATTTTTCTCTTAAATTTTAAGTTAAGGAGTTTCCTTAAGTTAATGA 900 0049 901 ACGTTGATGAAACCGGCTGATGATCAGTTAATAACTGGACTAGACCATTTTGTCTTATAA 960 0050 961 GAAAGAACAAAGATATTATTTGCATATTCACTTAAGCGAAAAAGAATTCCTAATAAGGTT 1020 0051 1021 ATAAAACATATTTAA。

21、CTTAAATGAAATTCATTTGACTTAAGCAGAATTTAACATAATGCA 1080 0052 1081 AATTATAATGATTATTTACATTCGTTTAAAATGGAAAAAAAATATGCGAATAATTTAACC 1140 0053 1141 TAATGGTGAAAACGGTTTGCCATAATTACGCAACATTAAAAGAAAAGAATACAACACATC 1200 0054 1201 AGCACAAGCTATTACAATGTAGATATCTTAGGTGGATTCCCTGAAAACCAACTTACATCT 1260 0055 1261 TACAACGATGT。

22、GTTTTGATAATGTAGTTAGTCAGTGCAACCTGCCAAGTCTAAACTTTTG 1320 0056 1321 GTTATCTATAAATGTAAAAGTGGAGAGTATAAAGTCATCTTACTAGCTCAGTCTAGCGGG 1380 说 明 书 CN 102757963 B 5 4/6 页 6 0057 1381 AATTTCCCTTTAGCCTAGTTTGTCATTAGTGAGATGTCGTAGTAGTTTGAACCACGGCAC 1440 0058 1441 GAACAGGCCGGGTTTTTTCATTACTCCTTTAATTACTAATCCTATTACATAA。

23、GAAATACA 1500 0059 1501 TTTGTACACTGTGCTAGTCAACCTCCGATTCGAAAATTAAATTCCTTATTGCCAAAACAC 1560 0060 1561 CATTCAAGTAGCTATAGGTTACATCCACACACACACATCCACACATTTACACACATATCA 1620 0061 1621 CATACACAGGTATGAGCTTTATTGCATACATGTAGATCTATGTGTGTTCATTTCAAATAC 1680 0062 1681 ATACTAGGCCTAATACACTTTGGACTGTCACAAAATGACAAACAGAAA。

24、CGTACATATATA 1740 0063 1741 TACTAACATGTCATCTTGTTAGTCTCGTCTTATATTATGACTTTCCGCGTCCTAATCTTG 1800 0064 1801 CCTTTTTTTAACATAGTACCTGTACGTTTCTTATTTACCTGTATCGGTCCTTGTTTGTTG 1860 0065 1861 ACATGTTGCCAAGTCACATAATTCTGTTAGAGTTGTTTCCCTTCAAATCGTTATTTGGGG 1920 0066 1921 TGCACGGGTTCATGCATCATCGAACAAATTAAGAAAACCATACT。

25、GATAACTGAGTTTGAG 1980 0067 1981 TAACGGCTTTATTTTGTTATTTTACTTTCATAAAAAACACGATTAATCTACTACAGAAAA 2040 0068 2041 AATGATGCATGGATACTATGTTTTCTTATATTAAATCATTGATTTGCTCGGTGACAATTT 2100 0069 2101 TTTTATTGATCTAAGCCTACGTTATTACCTGTTAAATTTATCCAATTTGGATACTAATCC 2160 0070 2161 AATTTGATTACTGCTTCCTTGTTAAGTTGTACAATGCGAT。

26、ATTATGAAAGAAATTTTATT 2220 0071 2221 ATGATGATAGGGAATCAAGTATTTTTCTTCTAATAGGCTTAGTTATGGTCACGAATATTC 2280 0072 2281 GCCAAGTTTCACGAAGTAGGCCGATTATTTAACATAATTGAGCACGTGACTTACTTCTCT 2340 0073 2341 TCTCTGATTGGTACATTGATTGTGTTCTGGAATCTTCCAGAAGTGATGTCATATCCTCCG 2400 0074 2401 GTGCGCATAAAAACGAGTCGCATAACGCCGGGAACC。

27、AAGAACAGACCGGAGCGAGGGGTT 2460 0075 2461 TAAGCTGTGATAAGAACATATAATATTTGGCTCTACTATTCAAGTAAACTCATCAAAACA 2520 0076 2521 CAGGTAAGATACGTAAATCATCCCAAGGAACATTTGATTATATTTGAAGAATCGGGAATA 2580 0077 2581 ATATTGAGAAATCAAATTAAAATTGAATTATTTTCTGGGGAGTAGTGCTCTCATGCATTG 2640 0078 2641 ATGGGGTGTTACCACAATGGCCGCACCAACGC。

28、GAAACCGTGTAATTATTAGAAGAAAGTT 2700 0079 2701 CAATGAAAGGCAAACTAATTCA 2722 0080 (a) 序列特征 ： 0081 * 长度 ： 2722 碱基对 0082 * 类型 ： 核苷酸 0083 * 链型 ： 单链 0084 * 拓扑结构 ： 线性 0085 (b) 分子类型 ： DNA 0086 (c) 假设 ： 否 0087 (d) 反义 ： 否 0088 (e) 最初来源 ： 栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 0089 (f) 特异性名称 ： Promoter 0090 实施例 2 栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子片。

29、段的克隆 0091 分析测得的 BAC 克隆全长， 将编码热休克蛋白基因 hsp70 的第一个碱基记为 +1。 取 -4000 至 0 位置的碱基序列进行启动子预测。在 -1700 和 -2400 碱基处分别预测到两个 分值很高 ( 分别是 1.008 和 1.116) 的启动子区域。因该基因在 -1400 碱基处还有转录， 故 将 -3900 至 -1200 间的碱基序列定为热休克蛋白基因的启动子区。 0092 在该启动子区两侧设计引物， 并加上不同的酶切位点 (Xho I 和 BamH I)， 用聚合 说 明 书 CN 102757963 B 6 5/6 页 7 酶链式反应 (PCR) 扩。

30、增启动子区。设计正向引物 F1 ： 5 -CTCGAGGCTCACTCTACAGTTGGTCGCC -3 ； 及反向引物 R1 ： 5 -GGATCCTGAATTAGTTTGCCTTTCATTGAAC-3， 并在以下的反应体系 中进行聚合酶链式反应 (PCR) 扩增 SEQ ID NO 1. 所示序列表中启动子区， PCR 产物电泳并 进行胶回收。 0093 反应体系 ： 模板 (BAC 质粒 )1l ； 正向引物 (10pmo l/l)0.5l ； 反向引物 (10pmol/l)0.5l ； 10 xTaq DNA 聚合酶缓冲液 2.5l ； MgCl 2(2.5mol/L)1.5l ； 脱。

31、 氧核苷酸混合物 dNTP(10mmol/L)0.5l ； Taq DNA 聚合酶 0.25l ； 灭菌水 18.25l ； 总体 积 25l。 0094 将胶回收纯化所得 PCR 产物连接 pMD19-T simple 载体过夜 ； 将连接产物转 化 DH5 大肠杆菌菌株， 涂布含氨苄青霉素的平板， 37培养过夜 ； 挑选含重组子的 阳性克隆， 利用载体引物 M13( 正向引物 ： 5 -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ； 反向引物 ： 5-CAGGAAACAGCTATGAC-3)及启动子序列特异引物PCR扩增并测序验证， 具体为步骤如 下 ： 0095 挑取 10 个单克隆， 并以。

32、挑取的单克隆细菌为模板， 分别用上述两组引物对其进行 PCR 扩增。反应体系为 ： 模板 ( 单克隆菌液 )1l ； 正向引物 (10pmol/l)0.5l ； 反向引 物(10pmol/l)0.5l ； 10 xTaq DNA聚合酶缓冲液2.5l ； MgCl2(2.5mol/L)1.5l ； 脱 氧核苷酸混合物 dNTP(10mmol/L)0.5l ； Taq DNA 聚合酶 0.25l ； 灭菌水 18.25l ； 总体 积 25l。 0096 两组引物都有扩增、 且电泳条带大小与序列长度一致的的单克隆视为阳性克隆。 提取阳性克隆的质粒(用TIANGEN普通质粒小提试剂盒， 目录号DP1。

33、03)， 对提取的质粒进行 测序， 证实质粒中所含的序列为目标启动子序列。 0097 实施例 3 启动子表达载体与转基因载体 pCfHspP1-EGFP 的构建 0098 用限制性内切酶 Xho I 和 BamH I 对提取的质粒进行双酶切， 并回收 SEQ ID NO 1. 所示序列表中启动子片段 ； 0099 再用限制性内切酶 Xho I 和 BamH I 对载体 pEGFP-1 进行双酶切， 并回收被线性化 的 pEGFP-1 载体 ； 0100 用T4连接酶过夜连接回收的启动子片段和pEGFP-1载体。 连接体系如下， pEGFP-1 与启动子片段的摩尔比控制在 1 2-6 之间。将连。

34、接产物转化 DH5 大肠杆菌菌株， 涂布 含卡那霉素的平板， 37培养过夜。挑选含重组子的阳性克隆。利用 pEGFP-1 载体引物和 启动子特异引物同时检测。 0101 连接体系 ： T4 连接酶 1l ； 10 x Buffer 1l ； pEGFP-11l ； 启动子片段 7l ； 总 计， 10l。 0102 其中 pEGFP-1 载体引物如下 ： 0103 正向引物 F1 ： 5 -CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGG-3 0104 反向引物 R 1 ： 5 -CCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC-3。 0105 实施例 4 转基因载体 pCfHspP1-EG。

35、FP 的活性验证 0106 (1) 昆虫细胞 sf9 的培养及传代， 将对数生长期的 sf9 细胞经计数， 以 6x105/ml 的 细胞密度传代至 6 孔板中， 27过夜培养。 0107 (2) 转染， 在细胞密度达到铺板面积 80-90时开始转染。 说 明 书 CN 102757963 B 7 6/6 页 8 0108 转染 mix 的配制 ： 用超纯水配制 100ul 浓度为 20ng/ul 转染载体。混合均匀后加 Fugene HD转染试剂7ul， 混合均匀。 室温放置15分钟。 加入到6孔板中， 培养基液面以下， 混合均匀。 0109 (3) 转染 18 小时后对一组进行热激 42 30 分钟， 另一组不做处理。热激后 6 小 时观察两组荧光表达情况， 未热激组没有发现荧光， 热激组有荧光表达。热激后 48 小时观 察荧光表达情况， 未热激组还是未发现荧光， 热激组有荧光表达 ( 参见图 2)。 说 明 书 CN 102757963 B 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102757963 B 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 102757963 B 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102757963 B 11 2/2 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757963 B 12 。