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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110113507.4 (22)申请日 2011.05.04 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 上海人类基因组研究中心 地址 201203 上海市浦东新区碧波路 250 号 1 幢 专利权人 复旦大学附属肿瘤医院 (72)发明人 黄薇 蔡三军 王志敏 彭俊杰 王海丰 徐烨 牛振民 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 刘昌荣 CN 1934274 A,2007.03.21, 全文 . CN 100393886 C,2008.06.11,。
2、 全文 . (54) 发明名称 通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发 生存的检测方法、 探针组和诊断试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种通过二基因表达情况预测 大肠癌术后无复发生存的检测方法， 包括步骤 ： 采集大肠癌患者的手术切除癌组织标本 ； 抽提 RNA 样本 ； 纯化 RNA 样本 ； 检测两个特异性探针的 表达 ； 计算高表达探针数目， 评价该患者的预后。 本发明还公开了由上述两个探针组成的探针组， 及包含该探针组的诊断试剂盒。本发明的检测方 法有助于提高大肠癌患者术后的生存率。在大肠 癌患者接受根治性手术后， 即可通过对两个特异 性探针的检测和联合分析， 快速判断出该患者术 。
3、后发生复发和转移的危险度， 从而能够对复发危 险度较高的患者及早地进行辅助治疗， 帮助延长 患者的生存时间。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 朱宁 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102766679 B (45)授权公告日 2015.02.25 CN 102766679 B 1/1 页 2 1. 一种用于通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发生存的探针组， 其特征在于 ： 包含有两个探针， 一个探针的序列为SEQ ID No ： 1所示的序列或其完全互补链， 另一个探针 的序列。
4、为 SEQ ID No ： 2 所示的序列或其完全互补链。 2. 一种用于通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发生存的诊断试剂盒， 其特征在 于 ： 包含有如权利要求 1 所述的探针组。 权 利 要 求 书 CN 102766679 B 2 1/3 页 3 通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发生存的检测方 法、 探针组和诊断试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及大肠癌的预后领域， 尤其涉及一种通过二基因表达情况预测大肠癌术 后无复发生存的检测方法。本发明还涉及用于该方法的探针组及诊断试剂盒。 背景技术 0002 大肠癌泛指发生在直肠和全部结肠 ( 升结肠、 横结肠、 降结肠、 乙状结肠 ) 。
5、的恶性 肿瘤， 是临床上常见的恶性肿瘤之一。目前， 国内大肠癌每年的新发病例约为 80 万例， 每年 有 50 万人死于大肠癌。由于生活条件和生活习惯的改变， 大肠癌的发病率还在呈逐年上升 趋势， 与上世纪 90 年代和 70 年代相比， 大肠癌的发病率， 在城市上升了 31.95， 在农村上 升了8.51， 在全国五大城市(北京、 天津、 上海、 武汉、 哈尔滨)中， 北京的大肠癌发病率最 高， 其次为上海 ； 上海的大肠癌发病率正以每年 4.2左右的速度上升。同时， 大肠癌的发 病平均年龄越来越低， 可以预见， 随着人口的进一步老龄化， 老年人口的大肠癌发病率还将 大幅上升。 0003 根。
6、据美国癌症协会 2005 年的统计数据， 早期大肠癌的五年生存率为 90； 一旦肿 瘤侵犯周围的淋巴结或者脏器， 其五年生存率就降为 67； 假如肿瘤发生远处转移， 则其五 年生存率就只有 9。但是， 由于大肠癌的早期症状不明显， 缺乏特异性临床表现， 加上患 者的自我保健意识较差或讳疾忌医， 因此， 大肠癌的早期发现和诊断比较困难， 临床上， 有 60 70以上的患者确诊时已是大肠癌的中晚期， 而在能够进行结直肠癌根治手术的 II 期和 III 期患者中， 约 20和 50的患者会在术后发生复发和转移， 需要根据病情再接受 化疗或放疗等辅助治疗。但是， 肿瘤的复发和转移， 涉及到众多基因的变。
7、化， 其过程相当复 杂， 因此， 对患者术后发生复发转移危险度的预测比较困难。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复 发生存的检测方法， 它有助于提高大肠癌患者术后的生存率。 0005 为解决上述技术问题， 本发明的通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发生存 的检测方法， 包括以下步骤 ： 0006 (1) 采集大肠癌患者的手术切除癌组织标本 ； 0007 (2) 抽提 RNA 样本 ； 0008 (3) 纯化该 RNA 样本 ； 0009 (4) 检测两个探针在该 RNA 样本中的表达， 所述探针分别具有如 SEQ ID No ： 1 和 。
8、SEQ IDNo ： 2 所示的序列或其互补链 ； 0010 (5) 计算上述两个探针中， 呈高表达状态的探针数目， 并对该患者手术后的预后进 行评价。 0011 本发明要解决的另一技术问题是提供一种用于上述方法的探针组。 说 明 书 CN 102766679 B 3 2/3 页 4 0012 为解决上述技术问题， 本发明的用于通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发 生存的探针组， 包含有两个探针， 这两个探针分别具有如SEQ ID No ： 1和SEQ ID No ： 2所示 的序列或其互补链。 0013 本发明要解决的另一技术问题是提供一种用于上述方法的诊断试剂盒。 0014 为解决上述技。
9、术问题， 本发明的用于通过二基因表达情况预测大肠癌术后无复发 生存的诊断试剂盒， 包含有上述探针组。 0015 本发明通过对两种保护基因的检测和联合分析， 来预测大肠癌患者术后发生复发 和转移的危险度， 从而可以在术后及早筛查出复发转移危险度较高的大肠癌患者， 对其进 行相应的辅助治疗， 以提高患者术后的生存率， 延长患者的生存时间。 附图说明 0016 附图为本发明实施例的对数生存函数曲线图。 具体实施方式 0017 以下实施例仅用于说明本发明， 而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具 体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (N。
10、ew York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建 议的条件。 0018 1. 实验对象 0019 本实施例的研究对象选自 2004 年 6 月至 12 月间， 在复旦大学附属肿瘤医院大肠 外科接受根治性手术治疗， 且术前检查无远处转移的 172 例 II-III 期结直肠癌患者。在上 述所有患者均完成术后辅助治疗并进入单纯随访期后， 再进行二次筛选， 排除未接受辅助 化疗的 II 期患者 29 例， 术后未接受或接受少于 3 个疗程化疗的患者 12 例， 接受术后辅助 放疗的低位直肠癌患者 15 例， 未。
11、获得组织标本的患者 8 例， 术后采用 CPT-11 作为辅助化疗 药物的患者 6 例， 研究开始时即失访的患者 7 例， 最后有 95 例患者通过筛选， 成为本实施例 的研究对象。这 95 例患者术后病理证实均为 AJCC/UICC 分期 II-III 期， 所接受的术后辅 助化疗方案包括不含奥沙利铂的单药化疗方案 (5-Fu/CF 或卡培他滨单药 ) 和含奥沙利铂 的联合化疗方案(5-Fu+CF+奥沙利铂或卡培他滨+奥沙利铂)， 且所有直肠癌患者均未接受 辅助或新辅助放射治疗。对这 95 例患者的随访时间为 4 48 个月， 中位随访时间为 37 个 月， 除在随访开始后 36 个月内死亡。
12、的患者， 所有患者的随访时间至少为 36 个月。 0020 2. 实验方法 0021 采集上述 95 例患者的手术切除癌组织标本， 用德国 Qiagen 公司的 RNeasy Mini ColumnKit， 按照试剂盒的说明， 抽提RNA样本。 抽提后的RNA样本保存在-70的深低温冰 箱中。 0022 用 Roche Molecular Biochemicals 公司的 High Pure RNA Paraffi n Kit( 货号 ： 3270289)， 按照试剂盒的说明， 对抽提的 RNA 进行纯化。 0023 采 用 DASL(cDNA 介 导 退 火、 选 择、 延 伸、 连 接 反。
13、 应 ) 技 术， 按 照 illumina beadstationDASL 系统手册 (Illumina Doc.#11175105) 规定的标准操作步骤， 对纯化后的 95 个 RNA 样本同时进行 502 个基因的表达检测。 说 明 书 CN 102766679 B 4 3/3 页 5 0024 对 DASL 分析所得的实验数据， 用 quantile( 分位数 ) 标化法， 剔除 2 个信号较差 样本， 剩余 93 例样本， 进入下一步分析。 0025 选择表达差异分数大于 13 或小于 -13， 同时表达差异倍数大于 1.3 倍的探针 ( 共 5个)， 进一步进行独立样本t检验， 筛。
14、选出具有统计学意义的两个探针， 这两个特异性探针 的序列分别如 SEQ ID No ： 1 和 SEQ ID No ： 2 所示。通过 ROC( 受试者工作特征 ) 曲线选择 切点， 定义这两个探针的高低表达， 并计算各样本中高表达的探针数。 0026 3. 结果分析 0027 结合 93 例患者的随访结果， 利用 EpiCalc 统计软件进行趋势卡方检验， 检验结果 ( 检验值为 14.02， P 0.000181) 如表 1 所示 ： 0028 表 1 趋势卡方检验结果 0029 高表达探针数 复发人数 无复发人数 复发率 OR( 优势比 ) RR( 相对危险度 ) 0 17 15 53.。
15、13 1.00 1.00 1 13 32 28.89 0.36 0.54 2 0 16 0.00 0.00 0.00 0030 从表 1 中可以看出， 高表达探针数目越多的个体， 术后复发率越低， 无病生存时间 也显著延长。 0031 同时， 再对这 93 例样本进行 Kaplan-Meier 生存分析。根据高表达探针数目， 将样 本分为三组， 第一组样本的高表达探针数为 0， 第二组样本的高表达探针数为 1， 第三组样 本的高表达探针数为 2。分析结果如附图所示 (P 0.0017， 图中带符号 “+” 的数据为截尾 数据 )， 高表达探针数目越多的个体， 其术后无病生存时间显著延长。 0032 4. 在预后诊断中的应用 0033 采集待检大肠癌患者的手术切除癌组织标本， 按照前述方法， 抽提、 纯化 RNA 样 本， 并利用 DASL 技术， 检测上述两个特异性探针在该 RNA 样本中的表达， 然后， 计算其中呈 高表达的探针数目， 再根据表 1 的趋势检验结果和附图的对数生存函数曲线， 评价该待检 患者在手术后发生复发转移的危险度和无病生存的时间。 说 明 书 CN 102766679 B 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 102766679 B 6 1/1 页 7 说 明 书 附 图 CN 102766679 B 7 。