技术领域:
本发明属生物检测技术领域,涉及八角和红毒茴成分的检测方法,具体涉及检测八角和红毒茴成分的引物、探针以及检测方法。
背景技术
八角,又名八角茴香,为木兰科植物八角茴香(Illicium verum)的干燥成熟果实。秋、冬二季果实由绿变黄时采摘,置沸水中略烫后干燥或直接干燥。八角是著名的调味香料,味香甜,多为八瓣,顶端呈较钝的鸟喙状;果皮较厚,有较浓郁的香气;果柄较长,弯曲。也供药用,有祛风理气、和胃调中的功能,用于中寒呕逆、腹部冷痛、胃部胀闷等,但多食会损目发疮。果皮、种子、叶都含芳香油,称八角茴香油(简称茴油)是制造化妆品、甜香酒、啤酒和食品工业的重要原料。八角和茴油除国内需用外,又是重要的出口物资,我国八角占世界市场的80%以上。
红毒茴,又名莽草,外形与八角相似,果实多为8-13瓣,顶端呈较尖的鸟喙状,向后弯曲;果皮较薄,味略苦;果柄较短,平直或微弯。果和叶有强烈香气,可提芳香油,为高级香料的原料。红毒茴果含莽草亭,有剧毒,不能作食用香料,过去有的地区曾将果作八角茵香用,发生严重中毒。本种根、根皮也有毒,民间用作祛风除湿,散疲止痛,治跌打,风湿等,根用量一般不超过一钱,根皮只用二分。
因八角和红毒茴外形相似,而八角每公斤的价格是红毒茴的3倍 左右,于是一些生产厂家和商贩经常将红毒茴掺在八角中进行出售。一般来说,八角和红毒茴可以通过外观进行区分,但是一些商贩为防顾客鉴别,通常将其多出的角掰掉或弄碎,或者磨成粉末代替八角加工为五香粉等复合调味料中,使之无法分辨。因红毒茴有剧毒,作为调料使用会引起中毒,轻者恶心呕吐,严重者烦躁不安,瞳孔散大,血压下降,甚至危及生命安全。
周晶等(八角茴香与其伪品莽草的红外光谱三级鉴定研究,光谱学与光谱分析,2008,第28卷,第12期,2864-2867)使用红外光谱三级鉴定的办法对八角和红毒茴进行了区分,因为八角和红毒茴的几个特征峰比较接近,而且方法需要依次采用一维红外光谱、二阶导数谱和二维相关红外光谱,通过逐渐提高分辨率使谱图的差别增大方才可对八角和红毒茴进行区分,分析方法较为复杂。
实时荧光PCR-TaqMAN探针法可从基因水平进行物种鉴定,具体是在PCR扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,即检测靶核苷酸序列扩增状态,以进行结果判定。它的主要优点是:
(1)在闭管状态下进行扩增产物检测,无需PCR产物的后处理,避免了扩增产物污染而致的假阳性,保证了结果的可靠性;
(2)探针杂交特异性更强,灵敏性更高,在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探针,提高了特异性,荧光信号由仪器自动收集,进一步提高了灵敏度;
(3)无需酶切位点存在,无需进行酶切,电泳,节省了时间, PCR后无需后续处理;
(4)整个实验耗时短,操作简单快速,数据分析较建安。。
目前,对于八角和易掺假且有毒性的红毒茴还没有实时荧光PCR检测方法,本领域迫切需要开发这种快速简便的检测八角和红毒茴成分的技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供了一种使用实时荧光PCR法检测八角和红毒茴成分的引物和探针及检测方法。
根据八角的微卫星序列(microsatellite sequence)和红毒茴的ITS2基因(Internal Transcribed Spacer 2)设计特异检测引物和探针。
实时荧光PCR检测八角成分的引物为:
上游引物P1:GGGTTGGTAGGTTCATAA
下游引物P2:GCACTCACACTTATATGTATA
检测八角成分的荧光探针序列为:CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA
上述荧光探针,5‘端为FAM标记,3’端为TAMRA标记
实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为:
上游引物P1:CTCCCCCCTCCCTTGATC
下游引物P2:CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG
检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA
上述荧光染料,5‘端为VIC标记,3’端为MGB标记。
实时荧光PCR检测八角和红毒茴成分的方法,其步骤如下:
1、提取待检样品基因组DNA
2、将检测八角和红毒茴成分的上游引物、下游引物和探针分别稀释至10μmol/L,然后等体积合并为混合引物(探针),以所提取的DNA作为模板,加入上述引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应,记录样品反应的Ct值;
所述的实时荧光PCR反应体系为:
3、所述的实时荧光PCR反应条件为95℃ 10min,1个循环;95℃ 15s,58℃ 30s,40个循环,在每次循环的58℃ 30s时收集荧光,设立FAM和VIC通道。
所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照,判定标准为:
空白对照:以ddH2O为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以非八角和红毒茴基因组DNA为模板,按照2和3 所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36;
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分;
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分;
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间,重做实时荧光PCR扩增,再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
本发明提供了一种使用实时荧光PCR法检测八角和红毒茴成分的引物和探针及具体检测方法,具有良好的灵敏性和特异性,可用于八角和红毒茴成分的快速检测。
附图说明
图1是本发明实施例1检测八角和红毒茴成分阳性样品的荧光PCR扩增图;其中,1为八角;2为红毒茴;
图2是本发明实施例2检测八角、红毒茴、地枫皮、大八角样品的荧光PCR扩增图;其中,1为八角;2为红毒茴;3为地枫皮;4为大八角。
具体实施方式:
下面对本发明做进一步详细说明。
实施例1
1.所用引物和探针:
利用GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找八角(Iphigenia indica)和红毒茴(Fritillaria maximowiczii)的特异序列,分别确定使用微卫星序列和ITS2基因,其GenBank Accession登录号分别为KC176699.1和KF022354.1,设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。
实时荧光PCR检测八角成分的引物为:
上游引物P1:GGGTTGGTAGGTTCATAA
下游引物P2:GCACTCACACTTATATGTATA
检测八角成分的荧光探针序列为:CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA
上述荧光探针,5‘端为FAM标记,3’端为TAMRA标记
实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为:
上游引物P1:CTCCCCCCTCCCTTGATC
下游引物P2:CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG
检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA
上述荧光染料,5‘端为VIC标记,3’端为MGB标记。
2.样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行:
(1)分别称取0.5g八角和红毒茴粉碎后材料放入同一个50mL离心管中;
(2)加入预热的10mLCTAB抽提裂解缓冲液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μL RNA、200μLβ-巯基乙醇),振荡悬浮后65℃温浴1h,期间不断晃动,冷却至室温后,5000g离心10min;
(3)取上清950μL加入2mL离心管中,加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5min,12000rpm离心15min;
(4)取上清750μL加入2mL离心管中,加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5min,12000rpm离心15min;
(5)取上清500μL加入1.5mL离心管中,加入300μL异丙醇,50μL乙酸钾溶液,轻轻颠倒混匀,室温静置30min,12000rpm离心15min,弃上清;
(6)加入1.0mL70%乙醇溶液,将沉淀悬浮浸泡,并将离心管倾斜,轻轻转动数圈后室温静置2min,12000rpm离心10min,弃上清,如沉淀多重复此步骤一次;
(7)小心弃去上清液,干燥DNA沉淀,加入50-100μL ddH2O,65℃溶解DNA。
也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
3.建立实时荧光PCR扩增反应体系
将检测八角和红毒茴的上游引物、下游引物和探针分别稀释至 10μmol/L,然后等体积合并为混合引物(探针),所述的实时荧光PCR反应体系为:
在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液,盖紧管,瞬离5s-10s。
将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内,记录样本摆放顺序。
循环条件设置:95℃ 10min,1个循环;95℃ 15s,58℃ 30s,40个循环,设立FAM和VIC双通道,在每次循环的58℃ 30s时收集荧光,检测完毕后,根据扩增曲线和Ct值判定结果。
4.所述确定质量控制指标
空白对照:以ddH2O为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以八角和红毒茴基因组DNA为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板,按照2和 3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36;
1.结果判定:
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分;
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分;
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间,重做实时荧光PCR扩增,再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
2.检测结果:
本发明实施例1将待检八角和红毒茴样品混合提取DNA后,进行实时荧光PCR检测,含有八角和红毒茴的样品显示如图1所示的阳性扩增曲线,表明该引物探针能对八角和红毒茴成分进行良好扩增。
实施例2
1.所用引物和探针:
选择八角微卫星序列和红毒茴ITS2基因作为对象,设计并合成实 时荧光PCR特异性扩增引物和探针。
实时荧光PCR检测八角成分的引物为:
上游引物P1:GGGTTGGTAGGTTCATAA
下游引物P2:GCACTCACACTTATATGTATA
检测八角成分的荧光探针序列为:CATGTACACACAATTGGTATTTGCTCA
上述荧光探针,5‘端为FAM标记,3’端为TAMRA标记
实时荧光PCR检测红毒茴成分的引物为:
上游引物P1:CTCCCCCCTCCCTTGATC
下游引物P2:CATGTTTCTCTACTCCTCAAGG
检测红毒茴成分的荧光探针序列为:TCCTTGCTTCTTTTATCGA
上述荧光染料,5‘端为VIC标记,3’端为MGB标记。
样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行:
(1)分别称取0.5g八角、红毒茴、地枫皮和大八角等样品粉碎后材料放入不同50mL离心管中;
(2)加入预热的10mLCTAB抽提裂解缓冲液(使用前加入20μL蛋白酶K、20μL RNA、200μLβ-巯基乙醇),振荡悬浮后65℃温浴1h,期间不断晃动,冷却至室温后,5000g离心10min;
(3)取上清950μL加入2mL离心管中,加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5rnin,12000rpm离心15min;
(4)取上清750μL加入2mL离心管中,加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)轻柔混匀静置5rnin,12000rpm离心15min;
(5)取上清500μL加入1.5mL离心管中,加入300μL异丙醇,50μL乙酸钾溶液,轻轻颠倒混匀,室温静置30min,12000rpm离心15min,弃上清;
(6)加入1.0mL70%乙醇溶液,将沉淀悬浮浸泡,并将离心管倾斜,轻轻转动数圈后室温静置2min,12000rpm离心10min,弃上清,如沉淀多重复此步骤一次;
(7)小心弃去上清液,干燥DNA沉淀,加入50-100μL ddH2O,65℃溶解DNA。
也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。
2.建立实时荧光PCR扩增反应体系
将检测八角和红毒茴的上游引物、下游引物和探针分别稀释至10μmol/L,然后等体积合并为混合引物(探针),所述的实时荧光PCR反应体系为:
在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液,盖紧管,瞬离5s-10s。
将加好样后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内,记录样本摆 放顺序。
循环条件设置:95℃ 10min,1个循环;95℃ 15s,58℃ 30s,40个循环,设立FAM和VIC双通道,在每次循环的58℃ 30s时收集荧光,检测完毕后,根据扩增曲线和Ct值判定结果。
3.所述确定质量控制指标
空白对照:以ddH2O为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
阴性对照:以八角和红毒茴基因组DNA为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40;
阳性对照:以含有八角和红毒茴基因组DNA为模板,按照2和3所述条件,进行实时荧光PCR反应,FAM和VIC通道检测Ct值大于或等于40检测Ct值小于或等于36;
1.结果判定:
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值大于或等于40,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分;
待测样品基因FAM和(或)VIC通道检测Ct值小于或等于36,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分;
待测样品FAM和(或)VIC通道检测Ct值在36-40之间,重做实时荧光PCR扩增,再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照,阳 性对照和空白对照结果正常,判定该样品未检出八角和(或)红毒茴成分;再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常,判定该样品检出八角和(或)红毒茴成分。
2.检测结果:
本发明实施例2将八角和红毒茴成分检测引物和探针分别对八角、红毒茴、地枫皮和大八角等DNA进行实时荧光PCR检测,结果显示样品地枫皮和大八角无扩增信号,只有八角和红毒茴有扩增信号,实施例2表明本发明的引物和探针具有良好的特异性。
上述实施例仅供说明本发明之用,而并非是对本发明专利的限制;应当指出的是,对于本领域的普通技术人员,在不脱离本发明构思范围的情况下,还可以作出各种变化和变型,这些都属于本发明的保护范围;因此,凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰,均应属于本发明权利要求的覆盖范围。