与相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月8日提交的美国临时申请61/185,033号的优先权 权益，其在此通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明涉及微小RNA(miRNA或miR)抑制剂及模拟物的化学基序，且尤 其是涉及化学修饰的miRNA有义和反义多核苷酸，当施用于患者时，所述多 核苷酸在效力、稳定性和/或毒性方面具有优势。
背景技术
微小RNA(miR)涉及多种生物过程，包括心脏功能的调节和维持(参见 ChienKR，MolecularMedicine：MicroRNAsandthetell-taleheart，Nature447， 389-390(2007))。因此，miR代表了一类相对新的用于诸如心脏肥大、心肌梗 死、心力衰竭、血管损伤以及病理性心脏纤维化等病症的治疗靶标。miRNA 是长度为约18至约25个核苷酸的小的、非蛋白编码RNA，其通过以下方式 作为靶mRNA的阻遏剂发挥作用：当它们的序列精确互补时促进靶mRNA 的降解，或当它们的序列含有错配时则抑制翻译。成熟的miRNA链掺入RNA 诱导沉默复合物(RISC)中，在这里其通过碱基对互补性而与其靶RNA关联。
可通过反义多核苷酸或通过模拟miRNA功能的多核苷酸(“miRNA模拟 物”)治疗性地靶向miRNA功能。然而，当将多核苷酸引入完整细胞时，它 们受到核酸酶的攻击并降解，从而导致活性的损失。尽管已制备了多核苷酸 类似物试图避免它们的降解，例如通过2’取代的方式(B.Sproat等，Nucleic AcidsResearch17(1989)，3373-3386)，但修饰通常影响多核苷酸预期生物作用 的效力。在每种情况下，此类降低的效力可能是由于该修饰的多核苷酸不能 与靶RNA形成稳定的二聚体，和/或丧失了与细胞机制的相互作用。
需要用于改进miRNA抑制剂和miRNA模拟物的稳定性、效力和/或毒性 概况的化学模式或基序，用于有效地靶向治疗背景中的miRNA功能。
发明概述
本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相对于它们作为miRNA抑制 剂或miRNA模拟物的用途而言提供改进的稳定性、效力和/或毒性的化学模 式。本发明还提供了包含该多核苷酸的药物组合物或制剂，以及治疗患有 miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。
在一个方面，本发明提供了具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，和 至少一个末端或“帽”修饰的多核苷酸。该化学修饰基序可消除对完全硫代 磷酸酯连接的多核苷酸和/或全长反义或有义miRNA序列的需求。该多核苷 酸是miRNA抑制剂或miRNA模拟物，并且如本文所显示的那样，其提供了 与未修饰的多聚核糖核苷酸相比和/或与其他可能的多核苷酸修饰相比经改 进的效力。
例如，该多核苷酸可以是具有如本文所述2’修饰之一或组合的miRNA 抑制剂或miRNA模拟物，诸如选自O-烷基(O-alkyl)(例如，O-甲基或“OMe”)、 卤素(例如，氟)、脱氧(H)和锁核酸(lockednucleicacid)的那些，以及在一些实 施方案中，基本上所有、或所有的核苷酸2’位置均被修饰。在一些实施方案 中，末端或帽修饰可以是5’和/或3’硫代磷酸酯单磷酸酯(phosphorothioate monophosphate)和/或无碱基部分，或本文描述的其他帽结构。该多核苷酸不 需要完全是硫代磷酸酯连接的，但是在此类连接存在时，此连接可例如置于 5’末端的两个末端核苷酸和3’末端的两个末端核苷酸之间。该核苷酸序列相 对于成熟miRNA而言可以是全长的，或全长反义miRNA(成熟形式)，但在 一些实施方案中，该多核苷酸包含截短的miRNA序列或截短的miRNA反义 序列。此类修饰的截短序列可显示出高水平的效力，甚至当与更长的(未修饰 或常规修饰的)对应物相比也如此。该多核苷酸可以是具有与miR-15b、 miR-21、miR-208a或本文描述的其它(的全部或部分)互补的反义序列的 antagomir。
在第二个方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸和可药用载剂的药物 组合物或制剂。可将该药物组合物配制为各种可药用形式，包括胶体分散体 系、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子、水包油乳剂、胶束、混合胶束 或脂质体。该组合物可包括与胆固醇和其他分子(诸如靶向配体)的缀合物，用 于将该多核苷酸递送至靶标哺乳动物细胞。
在第三方面，本发明提供了用于治疗具有miRNA相关或mRNA表达相 关病症的患者的方法。例如，该病症可以是心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、 血管损伤以及病理性心脏纤维化的一种或多种。此类病症通过施用本发明的 多核苷酸或组合物而得以治疗、预防或改善。因此，本发明提供了本发明的 经修饰的多核苷酸和组合物用于治疗miRNA相关或mRNA表达相关病症的 用途。
附图说明
图1是示出了示范性miRNA修饰模式的表格。所示序列是成熟miR15b 的反义序列(全长或截短的)。简写的描述提供于表3中。每一示例性RNA的 “别名”包括：miRNA靶标(例如，15b)；2’结构(O-甲基、“OMe”；或O-甲 基和氟、“Me/F”；或O-甲基和脱氧、“Me/H”；或锁核酸“LNA”)；多核苷 酸的大小(代表全长的FL或16-聚体)；以及在末端或内部的连接的结构，包 括：PO为磷酸二酯连接的，PS为硫代磷酸酯连接的，PSEO为每隔一个为 硫代磷酸酯连接的，PSEC为硫代磷酸酯末端-帽，无碱基，以及POS为5’ 和3’硫代磷酸酯单磷酸酯。
图2显示了应用双-萤光素酶测试法在Hela细胞中两个浓度即10nM(每 一组中的左柱)和0.1nM(每一组中的右柱)的图1中修饰的多核苷酸的体外测 试结果。萤光素酶比率越大，抑制剂的效力越好。通过长度即16-聚体和全长 对结果分组。高性能的化学物显示于表4中。
图3显示了在双萤光素酶测试法中，10nM(每组的左柱)和0.1nM(每组 的右柱)的硫代磷酸酯单磷酸酯修饰的多核苷酸与磷酸二酯或硫代磷酸酯骨 架直接相比较的结果。PO是磷酸二酯连接的，PS是硫代磷酸酯连接的，以 及POPOS是在3’和5’末端均有末端硫代磷酸酯单磷酸酯的磷酸二酯连接。
图4显示了在小鼠中用来自表5的多核苷酸5-14敲低miR-15b。测定了 肝脏(每组的左柱)和心脏(每组的右柱)中的miR-15b丰度，并与用盐水注射的 小鼠相比较。
图5显示了在新生大鼠心肌细胞中用修饰的反义多核苷酸抑制 miR-208a。图5中的结果是βMHC表达的定量PCR。左柱显示了100nM抑 制剂的结果，以及右柱显示了1nM抑制剂的结果。
图6显示了在双萤光素酶测试法中通过具有各种修饰的反义多核苷酸抑 制miR-21。
图7显示了以所示剂量注射大鼠后4种不同的修饰的miR-15b反义多核 苷酸的体内组织分布。
发明详述
本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相对于它们作为miRNA抑制 剂或miRNA模拟物的用途而言提供改进的稳定性、效力和/或毒性的化学模 式。本发明还提供了包含该多核苷酸的药物组合物或制剂，以及治疗患有 miRNA相关或mRNA表达相关病症的患者的方法。
修饰的多核苷酸
该多核苷酸具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰，以及至少一个末端 修饰或“帽”，如下文所示。该多核苷酸是miRNA抑制剂或miRNA模拟物， 并且展示出与未修饰的多聚核糖核苷酸相比、和/或与其他可能的多核苷酸修 饰相比的经改进的效力。
如本文所述，“miRNA抑制剂”是具有与成熟单链miRNA或其部分反义 (互补或如本文所述部分互补)的序列的多核苷酸。“miRNA模拟物”是具有相 应于(相同或如本文所述基本相同)成熟单链miRNA或其部分的序列的多核苷 酸。
该多核苷酸具有一个或多个在2’位置的核苷酸修饰(就2’羟基而言)。掺 入2’修饰的核苷酸(例如在反义寡核苷酸中)可增加寡核苷酸对核酸酶的抗性 以及它们与互补RNA的热稳定性二者。在2’位置处的各种修饰可独立地选自 提供了升高的核酸酶敏感性、而不影响与RNA靶标或细胞机制的分子相互作 用的那些。此类修饰可基于它们在体外或体内升高的效力而进行选择。本文 描述了用于确定miRNA抑制的升高效力的示例性方法(例如，IC50)。
在一些实施方案中，2’修饰可独立地选自O-烷基(其可以是被取代的)、 卤素、脱氧(H)和锁核酸。在某些实施方案中，基本上所有、或所有的核苷酸 2’位置均是被修饰的，例如，独立地选自O-烷基(例如，O-甲基)、卤素(例如， 氟)、脱氧(H)和锁核酸。例如，2’修饰可每一个独立地选自O-甲基和氟。在 示例性实施方案中，每一个嘌呤核苷酸具有2’OMe，并且每一个嘧啶核苷酸 具有2’-F。在某些实施方案中，剩下1至约5个2’位置、或约1至约3个2’ 位置未修饰(例如，2’羟基)。
根据本发明的2’修饰可包括小烃取代基。该烃取代基包括烷基、烯基、 炔基和烷氧烷基，其中烷基(包括烷氧基的烷基部分)、烯基和炔基可以是被取 代的或未被取代的。该烷基、烯基和炔基可以是C1至C10烷基、烯基或炔 基，诸如C2或C3。该烃取代基可包括一个或两个或三个非碳原子，其可独 立地选自N、O和/或S。该2’修饰可进一步包括烷基、烯基和炔基，如O- 烷基、O-烯基和O-炔基。
根据本发明的示例性2’修饰包括2’-O-烷基(C1-3烷基，诸如2’OMe或 2’OEt)、2′-O-甲氧乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨乙 基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨乙基氧乙 基(2′-O-DMAEOE)或2′-O-N-甲基乙酰氨基(2′-O-NMA)。
2’修饰可以是在所有核苷酸残基上、或在所有嘌呤核苷酸上的OMe。
在某些实施方案中，该多核苷酸含有至少一个2’-卤素修饰(例如，替代2’ 羟基)，诸如2’-氟、2’-氯、2’-溴和2’-碘。在一些实施方案中，2’卤素修饰是 氟。该多核苷酸可含有1至约20个2’-卤素修饰(例如，氟)、或1至约10、 或1至约5个2’-卤素修饰(例如，氟)。在一些实施方案中，该多核苷酸全部 含有2’-氟核苷酸、或在所有嘧啶核苷酸上含有2’-氟。在某些实施方案中，2’- 氟基团独立地是二甲基化、三甲基化或未甲基化的。
多核苷酸可具有一个或多个2’-脱氧修饰(例如，2’羟基的H)，但可含有1 至约20个2’-脱氧修饰，或1至约10、或1至约5个2’-脱氧修饰。在一些实 施方案中，该多核苷酸全部含有2’-脱氧核苷酸。
在某些实施方案中，多核苷酸含有一个或多个“构象上被约束的”或二 环糖核苷修饰(BSN)，其赋予含有BSN的多核苷酸与他们的互补微小RNA靶 标链之间形成的复合物以增强的热稳定性。例如，在一个实施方案中，该多 核苷酸含有一个或多个锁核酸(LNA)残基。LNA例如描述于美国专利 6,268,490、美国专利6,316,198、美国专利6,403,566、美国专利6,770,748、 美国专利6,998,484、美国专利6,670,461以及美国专利7,034,133中，所有这 些专利均通过引用全文并入本文。“锁核酸”(LNA)是经修饰的核苷酸或核糖 核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之间含有额外的桥联，从而导致“锁住的” 构象。在一个实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个具有如结构A所示结 构的LNA。在另一实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个具有如结构B所 示结构的LNA。在再另一实施方案中，该多核苷酸含有一个或多个具有如结 构C所示结构的LNA。
其他可用于本发明的多核苷酸中的合适BSN修饰包括在美国专利6,403,566 和美国专利6,833,361中描述的那些，这两个专利均通过引用全文并入本文。 在某些实施方案中，该多核苷酸包括约1至约10个锁核酸，或约2至约5个 锁核酸。
在示例性实施方案中，该多核苷酸含有如2’OMe那样修饰的2’位置。备 选地，嘌呤核苷酸在2’位置如2’OMe那样修饰，而嘧啶核苷酸在2’位置如2’- 氟那样修饰。
该多核苷酸进一步包含至少一个末端修饰或“帽”。该帽可以是5’和/或3’ 帽结构。术语“帽”或“末端帽”包括在多核苷酸任一端(就末端核糖核苷酸 而言)的化学修饰，并且包括在5’末端最后两个核苷酸以及3’末端最后两个核 苷酸之间连接处的修饰。本文描述的帽结构增加了寡核苷酸对核酸外切酶的 抗性，而不影响与RNA靶或细胞机制的分子相互作用。此类修饰可基于它们 在体外或体内升高的效力而进行选择。本文描述了用于确定miRNA抑制的升 高效力的示例性方法(例如，IC50)。
帽可存在于5’-端(5’-帽)或3’-端(3’-帽)，或可存在于两端。在某些实施方 案中，5’-和/或3’帽独立地选自硫代磷酸酯单磷酸酯、无碱基残基(部分)、硫 代磷酸酯连接、4’-硫核苷酸、碳环核苷酸、二硫代磷酸酯连接、翻转核苷酸 (inverted)或翻转无碱基部分(2’-3’或3’-3’)、二硫代磷酸酯单磷酸酯以及甲基 膦酸酯部分。当作为帽结构的一部分时，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接通 常位于5’末端两个末端核苷酸以及3’末端两个末端核苷酸之间。
在某些实施方案中，除了一个或多个上述2’修饰之外，多核苷酸还具有 至少一个末端硫代磷酸酯单磷酸酯。该硫代磷酸酯单磷酸酯可通过抑制外切 核酸酶的作用从而支持miRNA抑制剂和miRNA模拟物的更高的效力，并且 在一些实施方案中，消除对完全硫代磷酸酯(phosphorotioate)连接的多核苷酸 和/或全长抑制剂的需求。硫代磷酸酯单磷酸酯可位于寡核苷酸的5’和/或3’ 末端。硫代磷酸酯单磷酸酯由以下结构定义，其中B是碱基，以及R是如本 文所述2’修饰：
在某些实施方案中，除了5’和/或3’末端的硫代磷酸酯单磷酸酯之外，多 核苷酸全部含有如2’OMe那样修饰的2’位置，或备选地，嘌呤核苷酸在2’ 位置修饰为2’OMe，而嘧啶核苷酸在2’位置修饰为2’-氟。如本文对miR-15b 抑制剂示例的那样，这些实施方案中的多核苷酸不需要是全长硫代磷酸酯连 接的和/或不需要是全长的(就相应的成熟miRNA序列而言)。硫代磷酸酯连接 可存在于一些实施方案中，诸如在5’和3’末端的最后两个核苷酸之间(例如， 作为帽结构的一部分)，或与磷酸二酯键交替存在。
在这些或其他实施方案中，多核苷酸可在5’和3’末端任一端或两端含有 至少一个末端无碱基残基。无碱基部分不含有通常认可的嘌呤或嘧啶核苷酸 碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。因此，此类无碱 基部分缺乏核苷酸碱基，或在1’位置具有其他非核苷酸碱基化学部分。例如， 无碱基核苷酸可以是反无碱基核苷酸(reverseabasicnucleotide)，例如，其中 反无碱基亚磷酰胺通过5’酰胺(amidite)(代替3’酰胺)偶联，产生5’-5’磷酸酯 键。多核苷酸的5’和3’末端的反无碱基核苷的结构如下所示。具有此类无碱 基帽结构、且具有2’OMe修饰的多核苷酸是尤其有效的，如本文针对miR-21 所显示的那样(图6)。
已将硫代磷酸酯连接用于使得多核苷酸对核酸酶切割更具抗性。尽管本 文公开的化学修饰模式可容纳硫代磷酸酯连接(包括如本文所述那样作为帽 结构)，但在某些实施方案中，所描述的2’-修饰和帽修饰使得内部硫代磷酸 酯连接不必要。不过，在某些实施方案中，多核苷酸含有一个或多个内部硫 代磷酸酯连接(除帽中的之外)。例如，多核苷酸可以是部分硫代磷酸酯连接的， 例如硫代磷酸酯连接可与磷酸二酯连接交替。
多核苷酸可包含全长或截短的miRNA序列、或全长或截短的miRNA反 义序列，或基本上由、或由全长或截短的miRNA序列、或全长或截短的miRNA 反义序列组成。如本文所使用的那样，就miRNA序列而言的术语“全长”是 指成熟miRNA序列或其反义对应物的长度。因此，本文描述的抑制剂和模拟 物可以是截短的或全长的(有义或反义)成熟miRNA序列，或可包含与其他多 核苷酸序列组合的这些序列。例如，在一些实施方案中，该抑制剂和模拟物 可相应于pre-miRNA和pri-miRNA序列或其部分，或可包含其他非miRNA 序列。在某些实施方案中，本文描述的化学修饰基序使得全长反义或有义 miRNA(成熟)序列不必要。
在某些实施方案中，该多核苷酸为5至25个核苷酸长，8至18个核苷 酸长、或12至16个核苷酸长。在某些实施方案中，该多核苷酸的长度为约 8个核苷酸或更少、约10个核苷酸或更少、约12个核苷酸或更少、或约16 个核苷酸或更少。在一些实施方案中，该多核苷酸为约16个核苷酸长。
该多核苷酸可具有被设计以模拟或靶向成熟miRNA，诸如以下表1所列 成熟miRNA的核苷酸序列。在这些或其他实施方案中，该多核苷酸还可或备 选地被设计为靶向pre-miRNA或pri-miRNA形式。在某些实施方案中，被设 计以抑制miRNA的多核苷酸可具有相对于完全互补的miRNA序列(如下表1 所示)而言含有1至5(例如，2、3或4)个错配的序列。在其他实施方案中， 被设计以模拟miRNA的多核苷酸可具有相对于成熟miRNA序列(如下表1 所示)而言含有1至5(例如，2、3或4)个核苷酸取代的序列。可将此类反义 和有义序列掺入例如shRNA或含有茎和环部分的其他RNA结构中。此类序 列其可用于模拟或靶向miRNA功能等，以供治疗或改善心脏肥大、心肌梗死、 心力衰竭(例如，充血性心力衰竭)、血管损伤和/或病理性心脏纤维化等。示 例性的miRNA治疗用途公开在以下表1所列的美国和PCT专利参考文献中， 其每一个均通过引用全文并入本文。miRNA的成熟和加工前形式公开在以下 所列参考文献中，并且此类描述也通过引用并入本文。
表1
miRNA miRNA序列 参考文献 1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU WO 2009/012468 100 AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG WO 2009/012468 10b UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG WO 2009/012468 125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA WO 2009/012468 128 UCACAGUGAACCGGUCUCUUU WO 2007/070483 133a UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG WO 2009/012468 133b UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA WO 2009/012468 139 UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG WO 2009/012468 143 UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC WO 2007/070483 145 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU WO 2007/070483 150 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG WO 2009/012468 15a UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG WO 2009/062169 15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA WO 2009/062169
miRNA miRNA序列 参考文献 378 ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG WO 2009/012468 424 CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA WO 2009/062169 483-3p UCACUCCUCUCCUCCCGUCUU WO 2009/012468 484 UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU WO 2009/012468 486-5p UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG WO 2009/012468 497 CAGCAGCACACUGUGGUUUGU WO 2009/062169 499 UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU WO 2009/018492 542-5p UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA WO 2009/012468 92a UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU WO 2009/012468 92b UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC WO 2009/012468 let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU WO 2009/012468 let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU WO 2009/012468 let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU WO 2009/012468 let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU WO 2009/012468 let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU WO 2009/012468 let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU WO 2009/012468 let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU WO 2009/012468 451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU PCT/US2010/034227
在某些实施方案中，该多核苷酸包含完全或部分地与pri、pre-或成熟 miR-15b、miR-208a或miR-21互补(如所描述的那样)的反义序列。
miR-15b，包括其结构和加工、及其用于治疗心脏肥大、心力衰竭、或心 肌梗死(等等)的潜力描述于WO2009/062169中，其在此通过引用全文并入。 可用于设计根据本发明的抑制性miRNA的人miR-15b的pre-miRNA序列是 (5’至3’)： UUGAGGCCUUAAAGUACUGUAGCAGCACAUCAUGGUUUAC AUGCUACAGUCAAGAUGCGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUAG AAAUUUAAGGAAAUUCAU。
miR-208a，包括其结构和加工、及其用于治疗心脏肥大、心力衰竭、或 心肌梗死等的潜力描述于WO2009/018492中，其在此通过引用全文并入。可 用于设计根据本发明的抑制性miRNA的人miR-208a的pre-miRNA序列是(5’ 至3’)：
ACGGGCGAGCUUUUGGCCCGGGUUAUACCUGAUGCUCACG UAUAAGACGAGCAAAAAGCUTGUUGGUCAGA。
miR-21，包括其结构和加工、及其用于治疗心脏肥大、心力衰竭、或心 肌梗死等的潜力描述于WO2009/058818中，其在此通过引用全文并入。可用 于设计根据本发明的抑制性miRNA的人miR-21的pre-miRNA序列是(5’至 3’)：
UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCU CAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA。
当靶miRNA是miR-15b、miR-208a或miR-21时，该多核苷酸可全部含 有如所述的2’OMe或2’OMe及2’-F，以及可含有5’和3’末端处的硫代磷酸 酯单磷酸酯帽，和/或5’和/或3’末端处的无碱基残基，和/或具有硫代磷酸酯 连接的末端帽。该多核苷酸可以是部分硫代磷酸酯连接的，或除了任选地具 有硫代磷酸酯末端帽外全部为磷酸二酯连接的。反义多核苷酸可与截短的成 熟miRNA序列完全互补，诸如约8、约10、约12、约14、约15、约16、约 17或约18个核苷酸长(例如，约14至约18个核苷酸长)。在一些实施方案中， 该多核苷酸包含全长反义序列(相对于成熟miRNA而言)、或由其组成(或基本 上由其组成)。在这一上下文中，术语“基本上由……组成”的意思是5’末端 和/或3’末端可添加额外的核苷酸，诸如每一末端1至3个核苷酸，只要该多 核苷酸对其靶标的效力和/或特异性不受影响。
多核苷酸可具有选自图1、或以下表2的序列/结构。简写显示于表3。
表2
通过固相合成来合成包括经修饰的多核苷酸在内的多核苷酸是公知的， 并综述在NewChemicalMethodsforSynthesizingPolynucleotides.Caruthers MH，BeaucageSL，EfcavitchJW，FisherEF，MatteucciMD，StabinskyY.Nucleic AcidsSymp.Ser.1980；(7)：215-23中。
组合物、制剂和递送
可将多核苷酸掺入各种大分子组装体(assembly)或组合物之中。用于递送 的此类复合物可包括被配制以递送给患者的各种脂质体、纳米颗粒和胶束。 该复合物可包括一种或多种融合或亲脂分子，以起始细胞膜渗透。此类分子 例如描述于美国专利7,404,969和美国专利7,202,227中，其在此通过引用全 文并入。
组合物或制剂可采用多种治疗多核苷酸，每一种独立地如本文所描述的 那样。例如，组合物或制剂可采用1至5种miRNA抑制剂和/或miRNA模拟 物，每一种独立地如上，例如参照表1、2和图1。
可将本发明的多核苷酸配制为各种药物组合物。药物组合物将以适于预 期应用的形式制备。一般地，这将需要制备基本上没有热原、也没有其它将 对人或动物有害的杂质的组合物。示例性的递送/制剂系统包括胶体分散体 系、大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子、以及包括水包油乳剂在内的脂 基系统(lipid-basedsystem)、胶束、混合胶束和脂质体。适于将本发明的核酸 递送至心脏和骨骼肌组织的可商购脂肪乳剂包括IntralipidLiposynLiposynII、LiposynIII、Nutrilipid以及其他类似的脂质乳剂。用作体内递 送载体的优选的胶体系统是脂质体(即，人造膜囊)。此类系统的制备和应用是 本领域公知的。示例性制剂还公开于US5,981,505、US6,217,900、US 6,383,5l2、US5,783,565、US7,202,227、US6,379,965、US6,127,170、US 5,837,533、US6,747,014和WO03/093449中，其在此通过引用全文并入。
药物组合物和制剂可采用合适的盐和缓冲液，以使得递送载体稳定，并 允许被靶细胞摄入。本发明的水性组合物包含有效量的包含了抑制剂多核苷 酸或miRNA多核苷酸序列的递送载体(例如，脂质体或其他复合物)，其溶解 或分散于可药用载剂或水性介质中。短语“可药用的”或“药理学可接受的” 是指当施用于动物或人时，不会产生副作用、变应反应、或其他不利反应的 分子实体和组合物。如本文所使用的那样，“可药用载剂”可包括一种或多种 可用于配制药物(诸如适于施用于人的药物)的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、 涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸附延缓剂等。此类介质和试剂用于药物活 性物质的用途是本领域公知的。还可将增补的活性成分掺入组合物中。
根据本发明的药物组合物的施用或递送可通过任何途径，只要通过该途 径可到达靶组织。例如，可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射施 用，或通过直接注射至靶组织(例如，心脏组织)施用。包含miRNA抑制剂、 或包含miRNA序列的表达载体的药物组合物还可通过用于递送治疗制剂至 心脏的导管系统、或分离冠状循环的系统施用。用于递送治疗剂至心脏和冠 状脉管系统的各种导管系统是本领域公知的。适用于本发明的基于导管的递 送方法或冠状分离方法的一些非限制性实例公开于美国专利号6,416,510、美 国专利号6,716,196、美国专利号6,953,466、WO2005/082440、WO 2006/089340、美国专利公开号2007/0203445、美国专利公开号2006/0148742 和美国专利公开号2007/0060907中，其所有均在此通过引用全文并入。
组合物或制剂还可肠胃外地或腹膜内施用。以例证的方式，可在适当地 与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)混合的水中制备作为游离碱或药理学可接 受盐的缀合物的溶液。还可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中、以及在油 中制备分散剂。在储存和使用的普通条件下，这些制备物通常含有防腐剂， 以防止微生物的生长。
适于注射应用或导管递送的药物形式例如包括无菌水性溶液或分散剂， 以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。一般地，这些制备 物是无菌的，并以存在易于注射性的程度流动。制备物应当在生产和储存条 件下是稳定的，并且应当针对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用是防腐的。 合适的溶剂或分散介质例如可含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和 液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。合适的流动性可例如通过使用 包衣、诸如卵磷脂，通过在分散剂的情况下维持所需的粒径，以及通过使用 表面活性剂而得以保持。微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂而获 得，例如，对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情 况下，包括等渗剂是优选的，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可 通过使用延缓吸附试剂的组合物而获得，例如，单硬脂酸铝和明胶。
无菌可注射溶液可通过将合适量的缀合物与所期望的任何其他成分(例 如如上所列举的)掺入溶剂中而制备。一般地，分散剂通过将各种灭菌的活性 成分掺入含有基础分散介质和期望的其他成分(例如如上所列举的)的无菌载 体中而制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备 方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其从事先无菌过滤的活性成分加上任何 附加的期望成分的溶液中产生它们的粉末。
制备后，优选以与剂量制剂相容的方式、并且以治疗有效量施用溶液。 制剂可以各种剂型很容易地施用，诸如可注射溶液、药物释放胶囊等。例如， 对于水性溶液的肠胃外施用，通常适当地缓冲该溶液，并且首先使液体稀释 剂等渗，例如使用足够的盐水或葡萄糖。此类水性溶液例如可用于静脉内、 肌内、皮下和腹膜内施用。优选地，如本领域技术人员公知的那样使用无菌 水性介质，尤其是根据本发明的公开使用。以例证的方式，可将单剂量溶解 于1ml等渗NaCl溶液中，并添加至1000ml皮下输液液体、或在推荐的输 注部位注射(例如参见″Remington′sPharmaceuticalSciences″，第15版，第 1035-1038和第1570-1580页)。取决于待治疗受试者的情况，有必要发生一 些剂量的变化。在任何情况下，负责施用的人将确定单个受试者的合适剂量。 此外，对于人类施用，制备物需满足无菌、热原性、生物标准FDA办公室要 求的一般的安全和纯度标准。
治疗方法
本发明提供了递送多核苷酸至哺乳动物细胞的方法，以及用于治疗、改 善或预防哺乳动物患者的病症进展的方法。该方法一般包含施用多核苷酸或 包含该多核苷酸的组合物给哺乳动物患者。如已描述的那样，该多核苷酸可 以是miRNA抑制剂或miRNA模拟物(例如，具有被设计以抑制miRNA表达 或活性的核苷酸序列)。因此，该患者可能具有与RNA表达，诸如miRNA表 达相关的病症。此类病症例如包括心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭(例如，充 血性心力衰竭)、血管损伤、再狭窄或病理性心脏纤维化。因此，本发明提供 了本发明的经修饰的多核苷酸和组合物用于治疗此类病症、以及制备用于这 些治疗的药物的用途。
与诸如心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭(例如，充血性心力衰竭)、血管损 伤、再狭窄和/或病理性心脏纤维化相关的miRNA、以及靶向miRNA功能的 序列描述于WO2008/016924、WO2009/058818、WO2009/018492、WO 2009/018493、WO2009/012468、WO2009/062169和WO2007/070483，其每 一个在此通过引用全文并入。此类miRNA和序列进一步在表1中列出，基于 这些序列的修饰的多核苷酸显示于表2和图1中，并在本文中得以描述。
在某些实施方案中，患者具有一种或多种风险因子，例如包括：长期不 受控制的高血压、未校正的心瓣膜病、慢性心绞痛、近期发生的心肌梗死、 对心脏疾病的先天易感以及病理性肥大。备选地或此外，患者可能已被诊断 为具有例如对心脏肥大的遗传易感，或可能具有例如心脏肥大的家族史。
在这一方面，本发明可能给罹患心力衰竭或心脏肥大的患者提供改进的 运动耐力、减少的住院、更好的生活质量、降低的发病率和/或降低的死亡率。
本发明通过以下附加实施例进一步阐述，所述实施例不能理解为限制性 的。本领域技术人员鉴于本发明公开的内容，应认识到可对公开的具体实施 方案进行许多改变，并且仍然能获得类似或相同的结果，而不会背离本发明 的精神和范围。
实施例
合成了靶向miRNAmiR-15b的一组miRNA抑制剂(单链寡核苷酸)。该 序列和修饰模式显示于使用了简写的下表3中。
表3.合成用于化学优化筛选的分子列表
合成了针对成熟miR15-b的三种不同长度的反向补体RNA抑制剂，即 8nt、16nt和全长(22nt)。这一实施例中的化学修饰包括2’-OMe、2’-F、2’-脱 氧、硫代磷酸酯连接的、以及LNA，其与特定基序组合。基序包括任一侧两 个碱基之间的硫代磷酸酯连接(硫代磷酸酯末端-加帽)。其他修饰包括具有3’ 和5’两端的无碱基(如本文所描述的在5’末端具有5’-5’磷酸酯键和/或在3’末 端具有3’-3’磷酸酯键的反无碱基基序)或硫代磷酸酯单磷酸酯的末端帽。
合成的多核苷酸的结构显示于图1中。
实施例1：miR15-b的体外抑制
以两种浓度在Hela细胞中测试该组，即10nM和0.1nM。读出的是双萤 光素酶测试。这一测试未直接测试miRNA的抑制，而是测试受抑制的miRNA 的效果，其显示为花虫萤光素酶的升高。第二个萤光素酶(萤火虫)不受miRNA 抑制的影响，用作内部对照。萤光素酶比率的值越大，抑制剂的效力越好。 参见VermeulenA，等，Double-strandedregionsareessentialdesigncomponentsofrotentinhibitorsofRISCfunctionRNA13：723-730(2007)。筛选结果显示于图 2。
图2提供了通过长度分组的结果——16聚体和全长。一种值得注意的化 学基序是具有硫代磷酸酯单磷酸酯的2’OMe。
图3突出显示了与磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架直接比较的硫代磷酸酯单 磷酸酯。对于“全长”抑制剂，在10nm浓度其与对比物是等价的，但在0.1nM 浓度其明显更有效得多。对于16聚体长度，不具有硫代磷酸酯单磷酸酯的抑 制剂完全没有显示大量的活性。还显著的是完全硫代磷酸酯分子没有效力； 因此这一末端加帽方法似乎是效力的显著贡献因素。
选择在筛选中表现最好的前14种抑制剂用于IC50测定，并且将这些列 于表4中。
表4
以100nM至1pM范围内的6个浓度将分子转染至Hela细胞中。48小时 后，纯化总RNA，并进行定量PCR以测量miR-15b和对照RNA的水平。计 算IC50，并显示于下表中。含有末端硫代磷酸酯单磷酸酯的分子在表5中以 黑体列出。
表5
实施例2：miR15-b的体内抑制
合成了10种靶向miR-15b的抑制剂(表5中的多核苷酸5-14)，并在正常 小鼠中测试对miR-15b水平的影响。通过低压尾静脉注射给予小鼠(n＝4) 80mg/kg的剂量，并在4天后分析组织的miR-15b水平。分析了肝脏和心脏， 并将该数据与注射盐水的小鼠相比较。
在肝脏和心脏中，具有硫代磷酸酯单磷酸酯帽(POS)的抑制剂均显示出 miR-15b的强抑制(参见图4)。非常令人惊讶的是，这些没有任何内部硫代磷 酸酯链接或胆固醇缀合物的分子能够在心脏中显示出此种效果。
这些实验证实了存在增强miRNA抑制剂效力的独特修饰基序。核酸酶稳 定性可能是重要的指示，因为具有2’OMe修饰的完全磷酸二酯连接的分子不 如具有硫代磷酸酯连接的分子有效。一个例外似乎是当末端具有无碱基核苷 或末端硫代磷酸酯单磷酸酯的帽时。甚至在16聚体时，这一具末端帽的分子 具有80pM的IC50，而全长多核苷酸具有180pM的IC50。这一修饰模式： 具有末端硫代磷酸酯单磷酸酯的2’OMe多核苷酸是独特基序。
实施例3：miR-208a的抑制
制备了全长和16-聚体miR-208a抑制剂，并通过bMHC的表达(通过定量 PCR确定)在转染48小时后在新生大鼠心肌细胞中进行测试。在100nM和1 nM测试抑制剂。
测试的抑制剂包括如下任一种修饰的2’位置：全部2’OMe；2’OMe修饰 的A和G、2’F修饰的C和U；以及脱氧A和G、2’OMeC和U。帽结构包 括无碱基和硫代磷酸酯单磷酸酯的帽。
miR-208是响应心脏应激而上调bMHC表达、以及在心脏中阻抑快速骨 骼肌基因所需的。参见WO2009/018492和2008/016924，其每一个均通过引 用在此并入。
结果显示于图5。如所示，具有末端帽的2’修饰的多核苷酸对抑制 miR-208a是有效的，甚至在1nM浓度也如此。
实施例4：miR-21的抑制
在Hela细胞中应用双萤光素酶测试法以100nM体外测试miR-21抑制剂 (末端加帽)。结果显示于图6。如所示，具有全部2’OMe以及无碱基部分末 端帽或具硫代磷酸酯单磷酸酯的末端帽的抑制剂尤其有效。
合成了与miR-15b、miR208和miR-21抑制剂有关的以下表6中所示的 多核苷酸。
表6
实施例5：miR-15b抑制剂在体内的组织分布
合成了4种miR-15b抑制剂(表7)，并注射至小鼠中以评估它们的组织生 物分布。用通过渗透泵施用的人血管紧张肽II(AngII)处理小鼠，其中所述渗 透泵在背面皮下植入。AngII处理7天后，给予小鼠1x0.33mg/kg、1x1 mg/kg、1x3.3mg/kg、1x33mg/kg或3x0.33mg/kg的剂量。最后的一个剂 量表示在随后3天以0.33mg/kg给药。4天后处死动物，并处理组织用于生 物分布测试。在给药期间持续进行AngII处理。
表7列出了这一实验中使用的每一寡聚物的序列和特定修饰。化合物 10134包含(comprisedof)LNA和2’脱氧核苷酸以及全部硫代磷酸酯骨架。化 合物10115包含2’OMe修饰和全部硫代磷酸酯骨架。化合物10623包含2’OMe 修饰、全部硫代磷酸酯骨架、以及3’和5’硫代磷酸酯单磷酸酯。化合物10624 包含2’OMe修饰、交替的硫代磷酸酯和磷酸二酯连接、以及3’和5’硫代磷酸 酯单磷酸酯。
表7
化合物# 别名 序列(5′-3′) 长度 10134 15b_DNA_LNA_16_PS 1As；dCs；dCs；1As；1Ts；dGs；1As；1Ts；dGs；1Ts；1Gs；dCs；dTs；1Gs；dCs；1T 16 10623 15b_OMe_16_PS_POS ps；mAs；mCs；mCs；mAs；mUs；mGs；mAs；mUs；mGs；mUs；mGs；mCs；mUs；mGs；mCs；mUs；p 16 10624 15b_OMe_16_PSEO_POS ps；mAs；mC；mCs；mA；mUs；mG；mAs；mU；mGs；mU；mGs；mC；mUs；mG；mCs；mUs；p 16 10116 15b_0Me_16_PS mAs；mCs；mCs；mAs；mUs；mGs；mAs；mUs；mGs；mUs；mGs；mCs；mUs；mGs；mCs；mU 16
图7显示了抑制剂在心脏、肝脏、肾和肺中的聚集。当比较加帽的和不 加帽的2’OMe寡聚物时，当具有POS修饰的帽时递送至所有器官的抑制剂 的量通常更高。这一效果在1x0.33mg/kg的最低剂量时最高。对肾的递送在 所有4种修饰模式中保持相当地等价。与每隔一个的修饰相比，完全修饰的 硫代磷酸酯骨架也显示出在心脏、肝脏和肺中更高的递送。
本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入。 应当理解，公开的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些都 是可变的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的， 并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。
本领域技术人员将认识到、或应用不超过常规实验即能确定本文所述发 明的具体实施方案的许多等价体。此类等价体也包含在以下权利要求中。
参考文献
以下参考文献在此通过引用全文并入，用于所有目的。
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美国专利5,998,203