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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610494431.7 (22)申请日 2016.06.30 (71)申请人 温文伟 地址 277300 山东省枣庄市峄城区经济开 发区跃进西路 (72)发明人 温文伟温明 (74)专利代理机构 济南方宇专利代理事务所 (普通合伙) 37251 代理人 俞波 (51)Int.Cl. C12N 9/26(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法 (57)摘要 本发明公开了一种酸性耐高温 -淀粉酶的 生产方法， 。
2、选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过 平皿培养、 摇瓶培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶的提取制得， 该生产方法采用的经过基因工程 改良的枯草芽孢杆菌不会产生芽孢、 适应能力 强、 不容易染菌、 活力高、 周期短。 生产过程中通 过调整风量控制， 培养基的配比以及有效控制 pH， 最终制得的酸性耐高温 -淀粉酶最佳反应条 件在90-110、 pH在4 .0-5 .5， 酶活力达到 40000U/mL， 发酵周期仅为120小时， 是目前国内 在最短的发酵周期内酶活力最高的耐酸性淀粉 酶。 权利要求书1页 说明书6页 CN 105861467 A 2016.08.17 CN 105861467 。
3、A 1.超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过平皿培养、 摇瓶培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶的提取制得， 其特征在于： 其步骤如下： （1） 平皿培养： 培养基配方： 蛋白胨： 0.5-1.5%， 酵母粉： 0.1-0.3%， 牛肉粉： 0.1-0.5%， 氯 化钠： 0.1-0.3%， 葡萄糖： 3-7%， 玉米淀粉： 0.5-1.5%， 琼脂粉： 1.5-2%， 余量为水， 各组分以重 量百分计， 控制pH为6.5-7.0,然后在温度121、 压力0.1Mpa条件下灭菌30min， 接种后36 恒温培养36-48h； （2） 摇瓶培养： 培养基配方：。
4、 酵母粉1-2%， 葡萄糖0.3-0.7%， 磷酸二氢钾0.1-0.5%， 硫酸 镁0.05-0.15%， 余量为水， 各组分以重量百分计； 调pH至7.5后灭菌， 接种， 37摇瓶培养8- 12h， 当pH下降至6.5-6.7时进入种子罐； （3） 种子罐发酵： 配料A： 硫酸铵： 3.5kg， 脱脂大豆粉： 17kg， 磷酸二氢钠： 13kg， 磷酸二氢 钾： 4.2kg， 玉米浆： 60kg， 硫酸镁： 1.39kg， 硫酸亚铁： 3.06g， 硫酸锰： 18.2g， 硫酸锌： 4.8g， 消 泡剂： 1.5kg， 在种子罐中121-123条件下灭菌50min； 配料B： 结晶葡萄糖35。
5、kg在另外一罐 中121-123灭菌35min， 冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中， 然后将种子罐调整到温度32- 34， pH为6.6-6.8， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h， 溶氧100%， 定容1m3， 然后接种后在温度 32-34， pH为6.6-6.8， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h的条件下发酵20-30h， 当溶氧68-72%， 镜检菌体正常时转入发酵罐； （4） 发酵罐发酵： 配料A： 脱脂大豆粉： 180kg， 玉米浆： 500kg， 磷酸氢二钾： 175kg， 磷酸二 氢钾： 57kg， 硫酸铵： 33kg， 硫酸镁： 0.77kg， 硫酸亚铁17g， 。
6、硫酸锰6.67g， 硫酸锌5g， 消泡剂： 12kg， 在发酵罐中121-123灭菌50min； 配料B： 氯化钙33kg在另一罐中121-123灭菌 40min， 冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中； 配料C： 结晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123灭 菌35min， 冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中； 将发酵罐调整到pH为6.6-6.8， 罐压0.4Mpa， 空 气流量650m3/h， 溶氧100%， 定容10m3， 接种后在温度38， pH为6.6-6.8， 风量650m3/h， 罐 压0.4Mpa条件下发酵100-120h； （5） 酶的提取： 取发酵醪液， 调pH至9.0， 然后依次加入醪。
7、液体积量2.5-4%的CaCl2， 2.5- 4%的Na2HPO4， 稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理， 加热至65-70后， 经板框 压滤、 超滤泵超滤后获得滤液， 然后向滤液中依次加入干糊精2%、 醋酸钠8-10%、 氯化钠18- 22%进行调配， 之后用醋酸调节pH至6.0-6.5， 迅速加热至65-70， 保持5-10min， 立即冷却， 取样测酶活， 最终发酵酶可达20000-40000U/mL， 之后用硅藻土进行成品精过滤， 装入成品 储罐。 2.根据权利要求1所述的超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 其特征在于： 摇瓶培养中 每150mL种母液接1-2个培养好的单菌。
8、落， 每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。 3.根据权利要求1所述的超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 其特征在于： 发酵罐发酵 过程中控制溶氧20%， 在溶氧低于20%时可通过提高风量、 提高罐压、 降低补糖速度来提高 溶氧。 4.根据权利要求1所述的超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 其特征在于： 超滤泵超滤 时维持系统压力在正常范围之内， 初始压力0.3MPa， 后期0.5MPa。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861467 A 2 酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法 技术领域 0001 本发明涉及生物酶制剂的生产方法， 特别是涉及一种酸性耐高温 -淀粉酶的生产 方法。 背景技术。
9、 0002 -淀粉酶 （ -1， 4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶） 普遍分布在动物、 植物和微生物中， 是一种重要的淀粉水解酶。 其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开 -1， 4糖苷键， 生成 糊精和还原糖。 由于产物的末端残基碳原子构型为 构型， 故称 -淀粉酶。 -淀粉酶是一种 十分重要的酶制剂， 大量应用于粮食加工、 食品工业、 酿造、 发酵、 纺织品工业和医药行业 等， 是应用最为广泛的酶制剂之一。 0003 酸性高温 -淀粉酶一般最佳反应条件在80-100、 pH在3.0-6.0之间， 能在适应工 业生产中的高温偏酸性环境， 提高工业生产效率。 目前我国自主研究生产的耐酸性高温 -。
10、 淀粉酶还不是很多， 常见的OGO耐高温酸性 -淀粉酶是采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)经液体深层发酵、 超滤等工序精制而成， 然而其酶活一般只能达到20000 U/mL， 并且发酵周期较长。 发明内容 0004 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种在更短的发酵周期内酶活更高的 酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法。 0005 为实现本发明的目的， 本发明所采用的技术方案是： 酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过平皿培养、 摇瓶 培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶提取制得， 其特征在于： 其步骤如下： （1） 平皿培养： 培。
11、养基配方： 蛋白胨： 0.5-1.5%， 酵母粉： 0.1-0.3%， 牛肉粉： 0.1-0.5%， 氯 化钠： 0.1-0.3%， 葡萄糖： 3-7%， 玉米淀粉： 0.5-1.5%， 琼脂粉： 1.5-2%， 余量为水， 各组分以重 量百分计， 控制pH为6.5-7.0， 然后在温度121、 压力0.1Mpa条件下灭菌30min， 接种后36 恒温培养36-48h； （2） 摇瓶培养： 培养基配方： 酵母粉1-2%， 葡萄糖0.3-0.7%， 磷酸二氢钾0.1-0.5%， 硫酸 镁0.05-0.15%， 余量为水， 各组分以重量百分计； 调pH至7.5后灭菌， 接种， 37摇瓶培养8- 1。
12、2h， 当pH下降至6.5-6.7时进入种子罐； （3） 种子罐发酵： 配料A： 硫酸铵： 3.5kg， 脱脂大豆粉： 17kg， 磷酸二氢钠： 13kg， 磷酸二氢 钾： 4.2kg， 玉米浆： 60kg， 硫酸镁： 1.39kg， 硫酸亚铁： 3.06g， 硫酸锰： 18.2g， 硫酸锌： 4.8g， 消 泡剂： 1.5kg， 在种子罐中121-123条件下灭菌50min； 配料B： 结晶葡萄糖35kg在另外一罐 中121-123灭菌35min， 冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中， 然后将种子罐调整到温度32- 34， pH为6.6-6.8， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h， 溶氧。
13、100%， 定容1m3， 然后接种后在温度 32-34， pH为6.6-6.8， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h的条件下发酵20-30h， 当溶氧68-72%， 镜检菌体正常时转入发酵罐； 说明书 1/6 页 3 CN 105861467 A 3 （4） 发酵罐发酵： 配料A： 脱脂大豆粉： 180kg， 玉米浆： 500kg， 磷酸氢二钾： 175kg， 磷酸二 氢钾： 57kg， 硫酸铵： 33kg， 硫酸镁： 0.77kg， 硫酸亚铁17g， 硫酸锰6.67g， 硫酸锌5g， 消泡剂： 12kg， 在发酵罐中121-123灭菌50min； 配料B： 氯化钙33kg在另一罐中12。
14、1-123灭菌 40min， 冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中； 配料C： 结晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123灭 菌35min， 冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中； 将发酵罐调整到pH为6.6-6.8， 罐压0.4Mpa， 空 气流量650m3/h， 溶氧100%， 定容10m3， 接种后在温度38， pH为6.6-6.8， 风量650m3/h， 罐 压0.4Mpa条件下发酵100-120h； （5） 酶的提取： 取发酵醪液， 调pH至9.0， 然后依次加入醪液体积量2.5-4%的CaCl2， 2.5- 4%的Na2HPO4， 稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理， 加热至65-70。
15、后， 经板框 压滤、 超滤泵超滤后获得滤液， 然后向滤液中依次加入干糊精2%、 醋酸钠8-10%、 氯化钠18- 22%进行调配， 之后用醋酸调节pH至6.0-6.5， 迅速加热至65-70， 保持5-10min， 立即冷却， 取样测酶活， 酶活力可达20000-40000U/mL， 之后用硅藻土进行成品精过滤， 装入成品储罐。 0006 所述摇瓶培养中每150mL种母液接1-2个培养好的单菌落， 每毫升种母液加氯霉素 2.5单位后接种。 0007 所述发酵罐发酵过程中控制溶氧20%， 在溶氧低于20%时可通过提高风量、 提高 罐压、 降低补糖速度来提高溶氧。 0008 所述超滤泵超滤时维持系。
16、统压力在正常范围之内， 初始压力0.3MPa， 后期0.5MPa。 0009 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 1、 本发明酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法采用的经过基因工程改良的枯草芽孢杆菌 不会产生芽孢、 适应能力强、 不容易染菌、 活力高、 周期短。 0010 2、 通过调整风量控制， 培养基的配比以及有效控制pH， 最终制得的酸性耐高温 - 淀粉酶最佳反应条件在90-110、 pH在4.0-5.5， 酶活力达到40000U/mL,发酵周期仅为120 小时， 是目前国内在最短的发酵周期内酶活力最高的耐酸性淀粉酶。 具体实施方式 0011 下面通过具体的实施方案叙述本发明。 除非特别说。
17、明， 本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。 另外， 实施方案应理解为说明性的， 而非限制本发明的 范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。 对于本领域技术人员而言， 在不背离本 发明实质和范围的前提下， 对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。 0012 实施例1酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过平 皿培养、 摇瓶培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶的提取制得， 其特征在于： 其步骤如下： （1） 平皿培养： 培养基配方： 蛋白胨： 1%， 酵母粉： 0.2%， 牛肉粉： 0.3%， 氯化钠：。
18、 0.2%， 葡萄 糖： 5%， 玉米淀粉： 1%， 琼脂粉： 1.7%， 余量为水， 各组分以重量百分计， 控制pH为6.7,然后 在温度121、 压力0.1Mpa条件下灭菌30min， 接种后36恒温培养40h； （2） 摇瓶培养： 培养基配方： 酵母粉1.5%， 葡萄糖0.5%， 磷酸二氢钾0.3%， 硫酸镁0.1%， 余 量为水， 各组分以重量百分计； 调pH至7.5后灭菌， 接种， 37摇瓶培养10h， 当pH下降至6.6 时进入种子罐； （3） 种子罐发酵： 配料A： 硫酸铵： 3.5kg， 脱脂大豆粉： 17kg， 磷酸二氢钠： 13kg， 磷酸二氢 说明书 2/6 页 4 CN。
19、 105861467 A 4 钾： 4.2kg， 玉米浆： 60kg， 硫酸镁： 1.39kg， 硫酸亚铁： 3.06g， 硫酸锰： 18.2g， 硫酸锌： 4.8g， 消 泡剂： 1.5kg， 在种子罐中122条件下灭菌50min； 配料B： 结晶葡萄糖35kg在另外一罐中122 灭菌35min， 冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中， 然后将种子罐调整到温度33， pH为 6.7， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h， 溶氧100%， 定容1m3， 然后接种后在温度33， pH为6.7， 罐 压0.5Mpa， 空气流量40m3/h的条件下发酵20h， 当溶氧70%， 镜检菌体正常时转入发酵。
20、罐； （4） 发酵罐发酵： 配料A： 脱脂大豆粉： 180kg， 玉米浆： 500kg， 磷酸氢二钾： 175kg， 磷酸二 氢钾： 57kg， 硫酸铵： 33kg， 硫酸镁： 0.77kg， 硫酸亚铁17g， 硫酸锰6.67g， 硫酸锌5g， 消泡剂： 12kg， 在发酵罐中122灭菌50min； 配料B： 氯化钙33kg在另一罐中122灭菌40min， 冷却并 入灭菌冷却后的发酵罐中； 配料C： 结晶葡萄糖70kg在另一罐中122灭菌35min， 冷却并入 灭菌冷却后的发酵罐中； 将发酵罐调整到pH为6.7， 罐压0.4Mpa， 空气流量650m3/h， 溶氧 100%， 定容10m3， 。
21、接种后在温度38， pH为6.7， 风量650m3/h， 罐压0.4Mpa条件下发酵100h； （5） 酶的提取： 取发酵醪液， 调pH至9.0， 然后依次加入醪液体积量3%的CaCl2， 3%的 Na2HPO4， 稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理， 加热至68后， 经板框压滤、 超 滤泵超滤后获得滤液， 然后向滤液中依次加入干糊精2%、 醋酸钠9%、 氯化钠20%进行调配， 之 后用醋酸调节pH至6.3， 迅速加热至68， 保持8min， 立即冷却， 取样测酶活， 酶活力为 40000U/mL， 之后用硅藻土进行成品精过滤， 装入成品储罐。 0013 所述摇瓶培养中每150mL。
22、种母液接2个培养好的单菌落， 每毫升种母液加氯霉素 2.5单位后接种。 0014 所述发酵罐发酵过程中控制溶氧20%， 在溶氧低于20%时可通过提高风量、 提高 罐压、 降低补糖速度来提高溶氧。 0015 所述超滤泵超滤时维持系统压力在正常范围之内， 初始压力0.3MPa， 后期0.5MPa。 0016 实施例2酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过平 皿培养、 摇瓶培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶的提取制得， 其特征在于： 其步骤如下： （1） 平皿培养： 培养基配方： 蛋白胨： 0.5%， 酵母粉： 0.1%， 牛肉粉： 0.1%， 氯化钠： 0.1%，。
23、 葡 萄糖： 3%， 玉米淀粉： 0.5%， 琼脂粉： 1.5%， 余量为水， 各组分以重量百分计， 控制pH为6.5,然 后在温度121、 压力0.1Mpa条件下灭菌30min， 接种后36恒温培养36h； （2） 摇瓶培养： 培养基配方： 酵母粉1%， 葡萄糖0.3%， 磷酸二氢钾0.1%， 硫酸镁0.05%， 余 量为水， 各组分以重量百分计； 调pH至7.5后灭菌， 接种， 37摇瓶培养8h， 当pH下降至6.5时 进入种子罐； （3） 种子罐发酵： 配料A： 硫酸铵： 3.5kg， 脱脂大豆粉： 17kg， 磷酸二氢钠： 13kg， 磷酸二氢 钾： 4.2kg， 玉米浆： 60kg，。
24、 硫酸镁： 1.39kg， 硫酸亚铁： 3.06g， 硫酸锰： 18.2g， 硫酸锌： 4.8g， 消 泡剂： 1.5kg， 在种子罐中121-123条件下灭菌50min； 配料B： 结晶葡萄糖35kg在另外一罐 中121-123灭菌35min， 冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中， 然后将种子罐调整到温度32 ， pH为6.6， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h， 溶氧100%， 定容1m3， 然后接种后在温度32-34， pH为6.6， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h的条件下发酵25h， 当溶氧68%， 镜检菌体正常时转入 发酵罐； （4） 发酵罐发酵： 配料A： 脱脂大豆粉。
25、： 180kg， 玉米浆： 500kg， 磷酸氢二钾： 175kg， 磷酸二 氢钾： 57kg， 硫酸铵： 33kg， 硫酸镁： 0.77kg， 硫酸亚铁17g， 硫酸锰6.67g， 硫酸锌5g， 消泡剂： 12kg， 在发酵罐中121灭菌50min； 配料B： 氯化钙33kg在另一罐中121灭菌40min， 冷却并 说明书 3/6 页 5 CN 105861467 A 5 入灭菌冷却后的发酵罐中； 配料C： 结晶葡萄糖70kg在另一罐中121灭菌35min， 冷却并入 灭菌冷却后的发酵罐中； 将发酵罐调整到pH为6.6， 罐压0.4Mpa， 空气流量650m3/h， 溶氧 100%， 定容1。
26、0m3， 接种后在温度38， pH为6.6， 风量650m3/h， 罐压0.4Mpa条件下发酵110h； （5） 酶的提取： 取发酵醪液， 调pH至9.0， 然后依次加入醪液体积量2.5%的CaCl2， 2.5%的 Na2HPO4， 稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理， 加热至65后， 经板框压滤、 超 滤泵超滤后获得滤液， 然后向滤液中依次加入干糊精2%、 醋酸钠8%、 氯化钠18%进行调配， 之 后用醋酸调节pH至6.0， 迅速加热至65， 保持5min， 立即冷却， 取样测酶活， 酶活力为 30000U/mL， 之后用硅藻土进行成品精过滤， 装入成品储罐。 0017 所述摇瓶。
27、培养中每150mL种母液接1个培养好的单菌落， 每毫升种母液加氯霉素 2.5单位后接种。 0018 所述发酵罐发酵过程中控制溶氧20%， 在溶氧低于20%时可通过提高风量、 提高 罐压、 降低补糖速度来提高溶氧。 0019 所述超滤泵超滤时维持系统压力在正常范围之内， 初始压力0.3MPa， 后期0.5MPa。 0020 实施例3酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过平 皿培养、 摇瓶培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶的提取制得， 其特征在于： 其步骤如下： （1） 平皿培养： 培养基配方： 蛋白胨： 1.5%， 酵母粉： 0.3%， 牛肉粉： 0.5%， 氯。
28、化钠： 0.3%， 葡 萄糖： 7%， 玉米淀粉： 1.5%， 琼脂粉： 2%， 余量为水， 各组分以重量百分计， 控制pH为7.0,然后 在温度121、 压力0.1Mpa条件下灭菌30min， 接种后36恒温培养48h； （2） 摇瓶培养： 培养基配方： 酵母粉2%， 葡萄糖0.7%， 磷酸二氢钾0.5%， 硫酸镁0.15%， 余 量为水， 各组分以重量百分计； 调pH至7.5后灭菌， 接种， 37摇瓶培养12h， 当pH下降至6.7 时进入种子罐； （3） 种子罐发酵： 配料A： 硫酸铵： 3.5kg， 脱脂大豆粉： 17kg， 磷酸二氢钠： 13kg， 磷酸二氢 钾： 4.2kg， 玉米。
29、浆： 60kg， 硫酸镁： 1.39kg， 硫酸亚铁： 3.06g， 硫酸锰： 18.2g， 硫酸锌： 4.8g， 消 泡剂： 1.5kg， 在种子罐中123条件下灭菌50min； 配料B： 结晶葡萄糖35kg在另外一罐中123 灭菌35min， 冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中， 然后将种子罐调整到温度34， pH为 6.8， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h， 溶氧100%， 定容1m3， 然后接种后在温度34， pH为6.8， 罐 压0.5Mpa， 空气流量40m3/h的条件下发酵30h， 当溶氧72%， 镜检菌体正常时转入发酵罐； （4） 发酵罐发酵： 配料A： 脱脂大豆粉： 1。
30、80kg， 玉米浆： 500kg， 磷酸氢二钾： 175kg， 磷酸二 氢钾： 57kg， 硫酸铵： 33kg， 硫酸镁： 0.77kg， 硫酸亚铁17g， 硫酸锰6.67g， 硫酸锌5g， 消泡剂： 12kg， 在发酵罐中123灭菌50min； 配料B： 氯化钙33kg在另一罐中123灭菌40min， 冷却并 入灭菌冷却后的发酵罐中； 配料C： 结晶葡萄糖70kg在另一罐中123灭菌35min， 冷却并入 灭菌冷却后的发酵罐中； 将发酵罐调整到pH为6.8， 罐压0.4Mpa， 空气流量650m3/h， 溶氧 100%， 定容10m3， 接种后在温度38， pH为6.8， 风量650m3/h。
31、， 罐压0.4Mpa条件下发酵120h； （5） 酶的提取： 取发酵醪液， 调pH至9.0， 然后依次加入醪液体积量4%的CaCl2， 4%的 Na2HPO4， 稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理， 加热至70后， 经板框压滤、 超 滤泵超滤后获得滤液， 然后向滤液中依次加入干糊精2%、 醋酸钠10%、 氯化钠22%进行调配， 之后用醋酸调节pH至6.5， 迅速加热至70， 保持10min， 立即冷却， 取样测酶活， 酶活力为 35000U/mL， 之后用硅藻土进行成品精过滤， 装入成品储罐。 0021 所述摇瓶培养中每150mL种母液接2个培养好的单菌落， 每毫升种母液加氯霉素 。
32、说明书 4/6 页 6 CN 105861467 A 6 2.5单位后接种。 0022 所述发酵罐发酵过程中控制溶氧20%， 在溶氧低于20%时可通过提高风量、 提高 罐压、 降低补糖速度来提高溶氧。 0023 所述超滤泵超滤时维持系统压力在正常范围之内， 初始压力0.3MPa， 后期0.5MPa。 0024 1、 超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 选用基因改良的枯草芽孢杆菌， 通过平皿 培养、 摇瓶培养、 种子罐发酵、 发酵罐发酵、 酶的提取制得， 其特征在于： 其步骤如下： （1） 平皿培养： 培养基配方： 蛋白胨： 0.5-1.5%， 酵母粉： 0.1-0.3%， 牛肉粉： 0.1-0。
33、.5%， 氯 化钠： 0.1-0.3%， 葡萄糖： 3-7%， 玉米淀粉： 0.5-1.5%， 琼脂粉： 1.5-2%， 余量为水， 各组分以重 量百分计， 控制pH为6.5-7.0,然后在温度121、 压力0.1Mpa条件下灭菌30min， 接种后36 恒温培养36-48h； （2） 摇瓶培养： 培养基配方： 酵母粉1-2%， 葡萄糖0.3-0.7%， 磷酸二氢钾0.1-0.5%， 硫酸 镁0.05-0.15%， 余量为水， 各组分以重量百分计； 调pH至7.5后灭菌， 接种， 37摇瓶培养8- 12h， 当pH下降至6.5-6.7时进入种子罐； （3） 种子罐发酵： 配料A： 硫酸铵： 3。
34、.5kg， 脱脂大豆粉： 17kg， 磷酸二氢钠： 13kg， 磷酸二氢 钾： 4.2kg， 玉米浆： 60kg， 硫酸镁： 1.39kg， 硫酸亚铁： 3.06g， 硫酸锰： 18.2g， 硫酸锌： 4.8g， 消 泡剂： 1.5kg， 在种子罐中121-123条件下灭菌50min； 配料B： 结晶葡萄糖35kg在另外一罐 中121-123灭菌35min， 冷却后并入灭菌冷却后的种子罐中， 然后将种子罐调整到温度32- 34， pH为6.6-6.8， 罐压0.5Mpa， 空气流量40m3/h， 溶氧100%， 定容1m3， 然后接种后在温度 32-34， pH为6.6-6.8， 罐压0.5M。
35、pa， 空气流量40m3/h的条件下发酵20-30h， 当溶氧68-72%， 镜检菌体正常时转入发酵罐； （4） 发酵罐发酵： 配料A： 脱脂大豆粉： 180kg， 玉米浆： 500kg， 磷酸氢二钾： 175kg， 磷酸二 氢钾： 57kg， 硫酸铵： 33kg， 硫酸镁： 0.77kg， 硫酸亚铁17g， 硫酸锰6.67g， 硫酸锌5g， 消泡剂： 12kg， 在发酵罐中121-123灭菌50min； 配料B： 氯化钙33kg在另一罐中121-123灭菌 40min， 冷却并入灭菌冷却后的发酵罐中； 配料C： 结晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123灭 菌35min， 冷却并入灭菌冷却后。
36、的发酵罐中； 将发酵罐调整到pH为6.6-6.8， 罐压0.4Mpa， 空 气流量650m3/h， 溶氧100%， 定容10m3， 接种后在温度38， pH为6.6-6.8， 风量650m3/h， 罐 压0.4Mpa条件下发酵100-120h； （5） 酶的提取： 取发酵醪液， 调pH至9.0， 然后依次加入醪液体积量2.5-4%的CaCl2， 2.5- 4%的Na2HPO4， 稀释2倍后加醪液体积量2%的硅藻土进行絮凝处理， 加热至65-70后， 经板框 压滤、 超滤泵超滤后获得滤液， 然后向滤液中依次加入干糊精2%、 醋酸钠8-10%、 氯化钠18- 22%进行调配， 之后用醋酸调节pH至。
37、6.0-6.5， 迅速加热至65-70， 保持5-10min， 立即冷却， 取样测酶活， 最终发酵酶可达20000-40000U/mL， 之后用硅藻土进行成品精过滤， 装入成品 储罐。 0025 2.根据权利要求1所述的超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 其特征在于： 摇瓶培 养中每150mL种母液接1-2个培养好的单菌落， 每毫升种母液加氯霉素2.5单位后接种。 0026 3.根据权利要求1所述的超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 其特征在于： 发酵罐 发酵过程中控制溶氧20%， 在溶氧低于20%时可通过提高风量、 提高罐压、 降低补糖速度来 提高溶氧。 0027 4.根据权利要求1所述的超酸性耐高温 -淀粉酶的生产方法， 其特征在于： 超滤泵 说明书 5/6 页 7 CN 105861467 A 7 超滤时维持系统压力在正常范围之内， 初始压力0.3MPa， 后期0.5MPa。 说明书 6/6 页 8 CN 105861467 A 8 。