《蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101696233 B (45)授权公告日 2012.02.01 CN 101696233 B *CN101696233B* (21)申请号 200910217782.3 (22)申请日 2009.10.29 C07K 7/06(2006.01) C12P 21/06(2006.01) A61P 9/12(2006.01) (73)专利权人 吉林大学 地址 130062 吉林省长春市前进大街 2699 号 (72)发明人 刘静波 于志鹏 赵文竹 于一丁 CN 1784146 A,2006.06.07, 全文 . CN 1780639 A,2006.05.31, 全文 。
2、. CN 1632528 A,2005.06.29, 全文 . 孔青等 . 酶解胶原蛋白制备血管紧张素转化 酶抑制肽的研究. 食品科学 .2008, 第 29 卷 ( 第 5 期 ),298-302. 赵钰岚等 . 血管紧张素转化酶的结构功能及 相关抑制剂. 生物工程学报 .2008, 第 24 卷 ( 第 2 期 ),171-176. (54) 发明名称 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备 (57) 摘要 本发明提供了一种蛋清蛋白血管紧张素转化 酶抑制肽及其制备方法， 属于生物技术领域。 从蛋 清蛋白酶解物中分离纯化出新的具有血管紧张素 转化酶抑制作用的活性肽， 序列为 RVPSL。制备。
3、步 骤包括酶解蛋清蛋白制备酶解物、 蛋清蛋白血管 紧张素转化酶抑制肽的纯化、 蛋清蛋白血管紧张 素转化酶抑制肽的结构鉴定和血管紧张素转化酶 抑制肽的合成及活性验证。本发明可用于制备降 压药物和辅助降血压功能食品。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张彬 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 CN 101696233 B1/1 页 2 1. 一种蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽， 其特征在于， 所述的蛋清蛋白血管紧张素 转化酶抑制肽具有较高的活性， 其氨基酸序列为 RVPSL， 为白色粉末状， 采用马尿酰组氨酰 亮。
4、氨酸为底物利用高效液相色谱测定血管紧张素转化酶抑制活性， 其半抑制浓度 (IC50) 为 0.020mM。 权 利 要 求 书 CN 101696233 B1/3 页 3 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备 技术领域 0001 本发明涉及一种从蛋清蛋白酶解产物中分离纯化血管紧张素转化酶抑制肽及其 制备方法， 特别涉及一种生物酶解方法制备得到一种新的血管紧张素转化酶抑制肽， 属于 生物技术领域。 背景技术 0002 高血压病是一种常见的心血管疾病， 它发病率高， 常伴有心脏、 血管、 肺以及肾脏 等器官功能性或器质性改变， 是引发心、 脑、 肾和眼血管等各种并发症和导致中风、 促进动 脉粥样。
5、硬化、 冠心病的一个重要危险因子。 高血压病是中国目前首要的心血管疾病， 我国约 有 1.6 亿高血压患者， 高血压的治疗迫在眉睫。人工合成的降压药物具有明显的降压效果， 但是副作用较大， 人们将目光转向了安全无副作用的源于食品的血管紧张素转化酶抑制肽 的研究。 0003 食物来源的活性肽不仅能提供人体生长发育所需的营养， 还可降低血压、 抗凝血、 抗菌、 免疫、 抗氧化、 降胆固醇， 调节神经系统、 降血脂、 护肝等功能。 血管紧张素转化酶抑制 肽是一类具有抑制 ACE 活性的物质， 随着人们对食品安全问题的高度关注， 食源性血管紧 张素转化酶抑制肽成为当前研究热点。 0004 自 1965。
6、 年首次在南美茅头蝮蛇毒液中发现血管紧张素转化酶抑制肽以来， 国内 外研究人员已从不同来源的蛋白质中制备出各种具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽类 物质。 蛋清中含有丰富的蛋白质资源， 且与人体的蛋白模式相似， 可以很好的被人体全面吸 收。但蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的研究报道较少， 本发明以蛋清蛋白为原料开发 血管紧张素转化酶抑制肽。检索中国专利， 未见相同相似记载。 发明内容 0005 本发明针对现有技术的不足， 提供一种蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制 备方法。 0006 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽， 其特征在于， 氨基酸序列为 RVPSL， 本发明所 述的蛋清蛋白血管紧张素转。
7、化酶抑制肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性， 半抑制浓 度 (IC50) 为 0.020mM， 形态为白色粉末状。 0007 本发明所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽制备方法， 包括酶解蛋清蛋白酶 解物制备、 纯化、 结构鉴定和化学合成， 具体步骤如下 ： 0008 (1) 酶解蛋清蛋白制备酶解物 0009 取一定量蛋清蛋白质配制成浓度为 5的水溶液， 置于恒温水浴锅中 90热变性 10min。冷却至酶解温度 40 60， 用 0.5moL/L 氢氧化钠溶液调解 pH 至 8 11， 加入占 蛋清蛋白质质量 1 5的碱性蛋白酶 Alcalase 2.4L 进行水解， 水解过程中不断搅拌， 。
8、并不断加入适当浓度的氢氧化钠溶液以维持 pH 值在 8 11 范围内 (0.05)， 水解 2 20 小时后经 80灭酶 10min， 离心 1000 9000g 10min， 喷雾干燥或冷冻干燥， 保存备用 ； 说 明 书 CN 101696233 B2/3 页 4 0010 (2) 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的纯化 0011 酶解物配制成水溶液， 经交联葡聚糖凝胶进行柱层析纯化， 用蛋白核酸检测仪在 220nm 处进行检测， 根据色谱柱纯化得到的色谱峰分别收集， 收集的洗脱液冻干称重后， 测 定血管紧张素转化酶抑制活性 ； 0012 (3) 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定 0。
9、013 分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶高抑制活性的组分， 采用液相色谱 - 四极 杆线性离子阱串联质谱 (4000QTRAP) 测定其结构， 液相色谱分离流动相为 70乙腈 (A) 和 含 0.1甲酸水 (B)， 线性梯度洗脱 A ： 10 100 (0 10min)， 检测波长 220nm， 质谱扫 描模式为 EMS/ER/EPI/EPI， 扫描范围为 M/Z ： 275-1000。 0014 (4) 血管紧张素转化酶抑制肽的合成及活性验证 0015 采用 Fmoc 固相合成法合成活性肽 RVPSL， 纯度达到 95。利用高效液相色谱纯化 合成肽， 并通过DIONEX MSQ质谱测定其分。
10、子量， 质谱参数为 ： 源ESI， 锥孔电压+75v， 上样量 5ul， 扫描范围 m/z100-2000。 0016 本发明所采用的血管紧张素转化酶抑制活性测定方法为高效液相色谱法， 具体步 骤为 ： 0017 取 30L 马尿酰组胺酰亮氨酸 (HHL) 底物液， 加入 10L 抑制剂混合均匀， 在 37 0.5恒温水浴中预热 3-5min， 然后加人 20L 血管紧张素转化酶 (ACE) 液充分混 合， 37保温30min后， 再加入60L的1moL/LHCl终止反应， 得到反应液。 同时用10L pH 为 8.3 的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液用 0.45m 滤膜过滤。
11、后直 接用 HPLC 系统进行分析。色谱条件 ： 柱温 25， 流速 0.5mL/min， 流动相乙腈 / 水 (0.05 TFA) 比例为 25/75 等度洗脱， 检测波长 228nm. 0018 ACE 抑制活性计算公式如下 ： 0019 ACE 抑制活性 ( ) 100(M-N)/M 0020 式中 ： M 为空白对照组中马尿酸的峰面积。 0021 N 为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。 0022 本发明的优良效果在于将生物酶工程技术及蛋白质组技术应用于鸡蛋的深层次 开发利用。本发明以蛋清蛋白为酶解原料， 酶解产物经柱层析纯化色谱质谱鉴定血管紧张 素转化酶抑制肽氨基酸序列为 RVPSL， 。
12、IC50为 0.020mM。 附图说明 0023 图 1 是实施例 1 步骤 (1) 中蛋清蛋白质酶解产物经过交联葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 柱层析的色谱图。 0024 图2， 图3分别是实施例1步骤(3)中交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离 的高活性组分的一级质谱图和二级质谱图。 0025 图 4， 图 5 分别是实施例 1 步骤 (4) 中固相合成法合成 RVPSL 的色谱图及质谱图。 具体实施方式 0026 下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步阐述， 但不限于此。 0027 实施例 1 从蛋清蛋白酶解产物中纯化得到血管紧张素转化酶抑制肽 RVPSL 说 。
13、明 书 CN 101696233 B3/3 页 5 0028 (1) 酶解蛋清蛋白制备酶解物 0029 取一定量蛋清蛋白质配制成浓度为 5的水溶液， 置于恒温水浴锅中 90热变性 10min。冷却至酶解温度 40， 用 0.5moL/L 氢氧化钠溶液调解 pH 至 11， 加入占蛋清蛋白质 质量 5的碱性蛋白酶 Alcalase2.4L 进行水解， 水解过程中不断搅拌， 并不断加入适当浓 度的氢氧化钠溶液以维持 pH 值在 11 范围内 (0.05)， 水解 20 小时后经 80灭酶 10min， 离心 1000g 10min， 喷雾干燥， 保存备用 ； 0030 (2) 蛋清蛋白血管紧张素转。
14、化酶抑制肽的纯化 0031 酶解物配制成水溶液， 经交联葡聚糖凝胶进行柱层析纯化 (1.6*100cm)， 去离子水 作为洗脱液， 流速为 60mL/min， 用蛋白核酸检测仪， 在 220nm 处进行检测， 根据色谱柱纯化 得到的色谱峰分别收集， 收集的洗脱液冻干称重后， 测定血管紧张素转化酶抑制活性 ； 0032 (3) 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定 0033 分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶高抑制活性的组分， 采用液相色谱 - 四极 杆线性离子阱串联质谱(4000Q TRAP)测定其结构， 液相色谱分离流动相为70乙腈(A)和 含 0.1甲酸水 (B)， 线性梯度洗脱 A 。
15、： 10 100 (0 10min)， 检测波长 220nm， 质谱扫 描模式为 EMS/ER/EPI/EPI， 扫描波长范围为 275-1000amu。 0034 (4) 血管紧张素转化酶抑制肽的合成及活性验证 0035 采用 Fmoc 固相合成法合成活性肽 TPSPR， 纯度达到 95。利用高效液相色谱纯化 合成肽， 并通过DIONEX MSQ质谱测定其分子量， 质谱参数为 ： 源ESI， 锥孔电压+75v， 上样量 5ul， 扫描范围 m/z100-2000。 0036 实施例 2 如实施例 1 所述， 所不同的是蛋清蛋白制备酶解物的 Alcalase 2.4L 用 量为蛋清蛋白的 1， 酶解 pH 值为 8， 酶解时间为 2h， 灭酶后 9000g 离心 10min， 冷冻干燥， 保存备用。 说 明 书 CN 101696233 B1/3 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101696233 B2/3 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101696233 B3/3 页 8 图 5 说 明 书 附 图 。