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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610340242.4 (22)申请日 2016.05.20 (83)生物保藏信息 CGMCC No.12413 2016.05.03 (71)申请人 吉林省希玛生物科技有限公司 地址 136201 吉林省辽源市西安区西二环 路2011号 (72)发明人 王杰鹏郗大兴 (74)专利代理机构 长春菁华专利商标代理事务 所 22210 代理人 于晓庆 (51)Int.Cl. C12N 1/16(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12P 23/00(200。
2、6.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一株富含虾青素的红法夫酵母菌株及其筛 选方法和应用 (57)摘要 一株富含虾青素的红法夫酵母菌株及其筛 选方法和应用， 属于生物发酵工程领域。 为了实 现红法夫酵母产业化生产虾青素， 本发明提供一 株富含虾青素的红法夫酵母菌株及其筛选方法 和应用。 本发明的一株富含虾青素的红法夫酵母 菌 株 ， 命 名为红 法 夫 酵 母 菌 株( Pha f f ia rhodozyma)XM-1601， 于2016年5月3日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCCNo.12413。 本发明的红法夫酵母 发。
3、酵生物量干重达到65g/L， 虾青素发酵产量达 到320mg/L， 虾青素含量约为4.92mg/g。 本发明的 红法夫酵母菌株XM-1601广泛应用于动物饲料添 加剂、 食品添加剂、 保健品等领域。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 105861342 A 2016.08.17 CN 105861342 A 1.一株富含虾青素的红法夫酵母菌株， 命名为红法夫酵母菌株(Phaffiarhodozyma) XM-1601， 于2016年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 为CGMCCNo.12413。 2.权利要求1所述的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株的筛。
4、选方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 步骤一、 对带有红法夫酵母的树叶层、 带有红法夫酵母的地表水和带有红法夫酵母的 地表泥土层分别进行预处理后获得含有红法夫酵母菌体的溶液， 根据红法夫酵母菌体浓度 分别稀释后涂平板， 分离培养基采用YM培养基； 步骤二、 将步骤一中涂有菌体的平板在12下培养710天， 挑取其中的红色菌落100 1000株分别在含有YM培养基的无菌平板上划线， 22培养35天， 获得纯种红色单菌落； 步骤三、 向10mL试管中加入3mLYM液体培养基， 将步骤二获得的纯种红色单菌落分别 接种于此试管中， 22、 220rpm摇床培养120h， 从中挑选2050株红色色素含。
5、量较多的菌 株； 步骤四、 向25mL摇瓶中加入10mLYM液体培养基， 将挑选的2050株菌株分别接种于此 摇瓶中， 22、 220rpm培养24h做种子； 取5mL种子液以9接种量接种于含50mLYM液体培养 基的250mL灭菌摇瓶中， 22、 220rpm摇床培养120h； 步骤五、 采用二甲亚砜法检测虾青素含量， 同时采用干重法测定红法夫酵母的生物量 干重， 从中选取一株虾青素产量最高的菌株， 即为红法夫酵母菌株XM-1601。 3.根据权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤一中， 对带有红法夫酵母的树叶 层进行预处理： 将带有红法夫酵母的树叶层在装有灭菌生理盐水的烧杯中反复浸。
6、洗， 将浸 洗液用0.22um醋酸纤维膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌液用10mL灭菌生理盐水复溶， 获得含有 红法夫酵母菌体的溶液。 4.根据权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤一中， 对带有红法夫酵母的地表 水进行预处理： 将带有红法夫酵母的地表水用0.22um醋酸纤维膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌 液用10mL灭菌生理盐水复溶， 获得含有红法夫酵母菌体的溶液。 5.根据权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤一中， 对带有红法夫酵母的地表 泥土层进行预处理： 将带有红法夫酵母的地表泥土层用灭菌生理盐水中反复清洗， 将微生 物悬浮于灭菌生理盐水中， 将悬浮液用0.22um醋酸纤维膜抽。
7、滤脱水， 将滤膜上的菌液用 20mL灭菌生理盐水复溶， 获得含有红法夫酵母菌体的溶液。 6.利用权利要求1所述的红法夫酵母菌株生产虾青素的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 步骤一、 一级种子 将红法夫酵母菌株XM-1601接种至含有50mLYM液体培养基的250mL灭菌三角瓶中， 20 25、 180240rpm摇床培养2030h； 步骤二、 二级种子 取上述摇瓶菌液10mL接种至含有100mLYM液体培养基的500mL灭菌三角瓶中， 接种量 为9， 2025、 180240rpm摇床培养2030h； 步骤三、 采用10L发酵罐进行发酵， 加入发酵培养基， 121灭菌2030min， 接。
8、种二级种 子的量为10， 装液量为6L， 发酵温度为(225)， 通气量为10L/min， 控制溶解氧在20 权利要求书 1/2 页 2 CN 105861342 A 2 以上， 发酵培养24168h后放罐， 获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤三中， 发酵过程中控制葡萄糖残糖浓 度在020g/L， 并用5MNaOH和2M稀硫酸控制pH为5.5。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基的配方为： (30.05)g/L 葡萄糖、 (5.05)g/L蛋白陈、 (5.05)g/L浓缩酵母浸出粉、 (3.03)g/LMgSO47H。
9、20、 (3.03)g/LKH2P04、 (1.01)g/L(NH4)2SO4， pH5.5。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述微量元素包括： 100mg/LCaCl22H2O、 100mg/LFeSO47H2O、 20mg/LZnSO47H2O、 10mg/LMnSO4H2O、 10mg/LCuSO45H2O、 5mg/ LCoSO47H2O。 10.权利要求1所述的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株在动物饲料添加剂、 食品添加 剂、 保健品中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105861342 A 3 一株富含虾青素的红法夫酵母菌株及其筛选方法和应用 技术领域 00。
10、01 本发明属于生物发酵工程技术领域， 具体涉及一株富含虾青素的红法夫酵母菌株 及其筛选方法和应用。 背景技术 0002 虾青素(3,3 -二羟基-4,4 -二酮基- , -胡萝 卜素， Astaxanthin)， 又名虾黄素， 是类胡萝 卜素的一种， 分子式为C40H52O4， 分子量为596.86， 其分子结构如图1所示。 虾青素具 有促进抗体产生、 增强宿主免疫功能、 抗氧化、 淬灭自由基产生的能力， 对于提高人体免疫 力、 减少疾病具有重要意义， 同时虾青素还具有抑制肿瘤生长、 改善视力及生育能力等多方 面的生物学功能。 因此， 虾青素在食品、 饲料、 渔牧业、 化妆品和医药保健品等方。
11、面有着广阔 的应用前景。 0003 目前市场上的虾青素绝大多数是化学合成的， 动物体对合成虾青素的利用率很 低， 在应用和安全性上存在较多的局限性。 通过动物和人体试验证明， 天然虾青素无任何毒 副作用， 对人体绝对安全。 自然界中产天然虾青素的微生物主要有近海的雨生红球藻 (Haematococcuspluvialis)和红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)。 雨生红球藻的虾青素含 量占细胞干重最高可达4， 是虾青素含量最高的微生物。 虽然雨生红球藻能积累大量的虾 青素， 但雨生红球藻的生长对气候条件要求较高， 需要强光照、 高温、 很大的昼夜温差、 高 盐、 高渗， 培养周期较长。
12、。 红法夫酵母是众多产虾青素的微生物中虾青素含量仅次于雨生红 球藻且是唯一可以代谢多种糖类的微生物。 相比之下， 红法夫酵母的虾青素含量虽然不能 和雨生红球藻相比， 但它的一些发酵经济学性状(生长快、 能利用多种碳氮源、 生长条件温 和)使得它具有良好的发酵产业化前景。 0004 利用红法夫酵母进行虾青素生产目前还处于实验研究的基础阶段。 红法夫酵母生 产虾青素的水平主要受两个因素影响： 单位细胞干重的虾青素含量和单位发酵体积的细胞 干重。 目前利用红法夫酵母发酵生产虾青素的水平普遍偏低， 一方面野生型红法夫酵母的 虾青素含量一般仅200500ug/g细胞菌体， 如公开号为CN10181814。
13、1A的中国专利 “红法夫 酵母菌株的复合诱变方法” ， 诱变出的菌株AS2.1557的色素产量为2.63mg/L， 细胞干重为 9.4g/L， 含色素280ug/g菌体， 经过多轮诱变后色素产量为5.1mg/L， 细胞干重为10.9g/L， 含 色素468ug/g菌体。 另一方面红法夫酵母的细胞干重偏低， 一般仅1030g/L发酵液， 如公开 号为CN103820520A的中国专利 “一种高产天然虾青素的发酵方法” ， 在优化的发酵条件下， 红法夫酵母CGMCC6355菌株在10L发酵罐中发酵36小时， 细胞干重达到21.7g/L， 虾青素产量 仅达到114.5mg/L， 含5.28mg/g菌。
14、体。 0005 因此， 若想实现红法夫酵母产业化生产虾青素， 必须对红法夫酵母进行广泛深入 的研究， 筛选获得优良的高产虾青素的红法夫酵母菌株， 并优化其发酵生产工艺， 提高发酵 液细胞生物量。 发明内容 说明书 1/7 页 4 CN 105861342 A 4 0006 为了实现红法夫酵母产业化生产虾青素， 本发明提供一株富含虾青素的红法夫酵 母菌株及其筛选方法和应用。 0007 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下： 0008 本发明的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株， 命名为红法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)XM-1601， 于2016年5月3日保藏于中国微生物菌种保。
15、藏管理委员会普通微生物 中心， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏号为CGMCCNo.12413。 0009 本发明还提供了上述的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株XM-1601(Phaffia rhodozymaXM-1601)的筛选方法， 包括以下步骤： 0010 步骤一、 对带有红法夫酵母的树叶层、 带有红法夫酵母的地表水和带有红法夫酵 母的地表泥土层分别进行预处理后获得含有红法夫酵母菌体的溶液， 根据红法夫酵母菌体 浓度分别稀释后涂平板， 分离培养基采用YM培养基； 0011 步骤二、 将步骤一中涂有菌体的平板在12下培养710天， 挑取其中的红色菌落 1001000株分别在含。
16、有YM培养基的无菌平板上划线， 22培养35天， 获得纯种红色单菌 落， 从中挑选1001000株单菌落； 0012 步骤三、 向10mL试管中加入3mLYM液体培养基， 将步骤二获得的纯种红色单菌落 分别接种于此试管中， 22、 220rpm摇床培养120h， 从中挑选2050株红色色素含量较多的 菌株； 0013 步骤四、 向25mL摇瓶中加入10mLYM液体培养基， 将挑选的2050株菌株分别接 种于此摇瓶中， 22、 220rpm培养24h做种子； 取5mL种子液以9接种量接种于含50mLYM液 体培养基的250mL灭菌摇瓶中， 22、 220rpm摇床培养120h； 0014 步骤五。
17、、 采用二甲亚砜法检测虾青素含量， 同时采用干重法测定红法夫酵母的生 物量干重， 从中选取一株虾青素产量最高的菌株， 即为红法夫酵母菌株XM-1601。 0015 作为优选的实施方式， 步骤一中， 对带有红法夫酵母的树叶层进行预处理： 将带有 红法夫酵母的树叶层在装有灭菌生理盐水的烧杯中反复浸洗， 将浸洗液用0.22um醋酸纤维 膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌液用10mL灭菌生理盐水复溶， 获得含有红法夫酵母菌体的溶液。 0016 作为优选的实施方式， 步骤一中， 对带有红法夫酵母的地表水进行预处理： 将带有 红法夫酵母的地表水用0.22um醋酸纤维膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌液用10mL灭菌生理盐。
18、水 复溶， 获得含有红法夫酵母菌体的溶液。 0017 作为优选的实施方式， 步骤一中， 对带有红法夫酵母的地表泥土层进行预处理： 将 带有红法夫酵母的地表泥土层用灭菌生理盐水中反复清洗， 将微生物悬浮于灭菌生理盐水 中， 将悬浮液用0.22um醋酸纤维膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌液用20mL灭菌生理盐水复溶， 获 得含有红法夫酵母菌体的溶液。 0018 利用本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)生产虾青 素的方法， 包括以下步骤： 0019 步骤一、 一级种子 0020 将红法夫酵母菌株XM-1601接种至含有50mLYM液体培养基的250mL灭菌。
19、三角瓶 中， 2025、 180240rpm摇床培养2030h； 0021 步骤二、 二级种子 0022 取上述摇瓶菌液10mL接种至含有100mLYM液体培养基的500mL灭菌三角瓶中， 接 说明书 2/7 页 5 CN 105861342 A 5 种量为9， 2025、 180240rpm摇床培养2030h； 0023 步骤三、 采用10L发酵罐进行发酵， 加入发酵培养基， 121灭菌2030min， 接种二 级种子的量为10， 装液量为6L， 发酵温度为(225)， 通气量为10L/min， 控制溶解氧在 20以上， 发酵培养24168h后放罐， 获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。 00。
20、24 作为优选的实施方式， 步骤三中， 发酵过程中控制葡萄糖残糖浓度在020g/L， 并 用5MNaOH和2M稀硫酸控制pH为5.5。 0025 作为优选的实施方式， 所述发酵培养基的配方为： (30.05)g/L葡萄糖、 (5.05) g/L蛋白陈、 (5.05)g/L浓缩酵母浸出粉、 (3.03)g/LMgSO47H20、 (3.03)g/L KH2P04、 (1.01)g/L(NH4)2SO4， pH5.5。 0026 作为优选的实施方式， 所述微量元素包括： 100mg/LCaCl22H2O、 100mg/L FeSO47H2O、 20mg/LZnSO47H2O、 10mg/LMnSO。
21、4H2O、 10mg/LCuSO45H2O、 5mg/L CoSO47H2O。 0027 本发明的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM- 1601)可以应用于动物饲料添加剂、 食品添加剂、 保健品等领域。 0028 本发明的有益效果是： 0029 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601， 在10L发酵罐中进行了发酵培养条件的优化研 究， 形成了一整套小试发酵生产工艺， 红法夫酵母发酵生物量干重达到65g/L， 虾青素发酵 产量达到320mg/L， 虾青素含量约为4.92mg/g。 与参考的专利文献技术相比， 红法夫酵母发 酵生物量干重提高了3倍左右，。
22、 虾青素发酵产量提高了23倍。 0030 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601同时拥有较高的单位细胞虾青素含量和较高的 单位发酵液细胞干重， 该菌株及其配套工艺满足了虾青素工业化生产的需要。 0031 利用本发明的红法夫酵母菌株XM-1601生产虾青素的优点是生产速度快、 培养条 件温和， 细胞中不但含有丰富的蛋白质、 脂类、 维生素， 而且还含有大量的不饱和脂肪酸及 多种虾青素前体， 并且易于实现高密度发酵， 无需光照。 附图说明 0032 图1为虾青素的分子结构。 0033 图2为本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)的形态特 征。 0034。
23、 图3为本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)的菌落 特征。 0035 图4为分光光度计法测量虾青素的标准曲线。 0036 图5为利用本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)生产 虾青素的结果。 具体实施方式 0037 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的 实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都 说明书 3/7 页 6 CN 105。
24、861342 A 6 属于本发明保护的范围。 0038 本发明的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM- 1601)， 该红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)于2016年5月3日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCCNo.12413。 0039 本发明的一株富含虾青素的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM- 1601)， 生物学特性包括： 0040 1、 形态特征如图3所示， 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(Phaffiarhodozyma。
25、 XM-1601)细胞呈卵圆形， 大小(36) m(512) m。 以单细胞为主， 还有几个细胞连在一 起的， 成团细胞用玻璃珠、 超声波均难于打散； 有时细胞呈假菌丝状， 长宽为(35) m (1017) m； 细胞主要以出芽方式繁殖， 在普通光学显微镜下细胞不呈红色， 细胞内无红色 颗粒出现。 0041 2、 菌落特征如图4所示， 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(Phaffiarhodozyma XM-1601)细胞在YM培养基上的菌落大小15mm， 菌落表面上凸， 菌落边缘整齐； 菌落颜色橘 红至深红， 菌落红色色度越深越有光泽， 其所含虾青素的量越高。 0042 3、 虾青素在本。
26、发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)细 胞内， 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)细胞破碎液经反复 离心水洗， 沉淀物仍为红色， 这说明虾青素是胞内脂溶性物质。 本发明的红法夫酵母菌株 XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)细胞含有17的脂肪酸， 虾青素提取液中含有大 量的脂肪酸， 所以虾青素可能均匀地分布于细胞脂质中。 0043 4、 生长特性： 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)为 好氧菌株， YM液体培养基中静置。
27、培养菌生长缓慢， 适宜发酵温度为22度， 过高或过低均会影 响菌体生长速度和虾青素含量， 最适pH为5.06.0。 0044 实施例1确定红法夫酵母菌株的筛选温度 0045 将涂有同样浓度混合菌液的平板， 分别置于18、 16、 14、 12、 10的培养箱 中培养， 观察红法夫酵母菌落长成红色明显菌落的时间， 同时观察红法夫酵母以外的杂菌 的菌落数量。 结果如下表所示： 0046 培养温度 18 16 14 12 10 红法夫酵母形成时间 3天 4天 5天 7天 10天 杂菌菌落数 + + + + + 0047 红法夫酵母具有耐低温的特性， 利用低温筛选红法夫酵母， 可以有效的抑制杂菌 生长。
28、， 使红法夫酵母在培养基上更易于被分离， 利于红法夫酵母菌株的大量筛选。 特别是当 温度小于12度， 微生物的生长普遍受到抑制， 生长缓慢， 因此， 确定使用低温培养710天， 培养温度控制在12来筛选红法夫酵母菌株。 0048 实施例2低温培养法筛选分离本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(Phaffia rhodozymaXM-1601) 0049 步骤一、 对带有红法夫酵母的树叶层进行预处理： 准备灭菌生理盐水和烧杯， 然后 将带有红法夫酵母的树叶层在装有灭菌生理盐水的烧杯中反复浸洗， 将浸洗液用0.22um醋 酸纤维膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌液用10mL灭菌生理盐水复溶， 获得含有红法。
29、夫酵母菌体 说明书 4/7 页 7 CN 105861342 A 7 的溶液， 根据红法夫酵母菌体浓度适当稀释后(稀释101000倍)涂平板， 所采用的分离培 养基为YM培养基； 0050 对带有红法夫酵母的地表水进行预处理： 将带有红法夫酵母的地表水用0.22um醋 酸纤维膜抽滤脱水， 将滤膜上的菌液用10mL灭菌生理盐水复溶， 根据红法夫酵母菌体浓度 适当稀释后(稀释101000倍)涂平板， 所采用的分离培养基为YM培养基； 0051 对带有红法夫酵母的地表泥土层： 将带有红法夫酵母的地表泥土层用灭菌生理盐 水中反复清洗， 将微生物悬浮于灭菌生理盐水中， 将悬浮液用0.22um醋酸纤维膜抽。
30、滤脱水， 将滤膜上的菌液用20mL灭菌生理盐水复溶， 根据红法夫酵母菌体浓度适当稀释后(稀释10 1000倍)涂平板， 所采用的分离培养基为YM培养基。 0052 步骤二、 将步骤一中涂有菌体的平板置于恒温恒湿培养箱中， 低温培养710天， 培养温度控制在12， 利用红法夫酵母适应低温生长的特性， 抑制杂菌生长。 0053 步骤三、 查看平板， 根据红法夫酵母的菌落形态初步排除非酵母菌落， 将潜在粉红 色菌落或红色菌落编号， 用接种针从平板上挑取1001000株红色菌落分别在含YM培养基 的无菌平板上划线， 将划线后的无菌平板在22培养箱中培养35天， 获得纯种红色单菌 落， 分别用无菌YM斜。
31、面培养基保存于4冰箱中备用。 0054 步骤一和步骤三中， 所说的YM培养基的pH为6.0， 其配方为： 10.0g/L葡萄糖、 5.0g/ L蛋白胨、 3.0g/L酵母浸粉、 3.0g/L麦芽提取物、 20.0g/L琼脂。 0055 步骤四、 在10mL试管中添加3mLYM液体培养基， 灭菌备用， 将上述步骤三获得的纯 种红色单菌落分别接种于此试管中， 22、 220rpm摇床培养120h， 从中挑选2050株红色色 素含量较多的菌株。 挑选时， 将菌株按照红色色素含量由多到少(菌株颜色由深至浅)的顺 序排序， 选取前2050株， 红色色素含量的多少主要以颜色深浅区别， 红色色素含量越多， 。
32、菌株颜色越深。 0056 步骤五、 在25mL摇瓶中加入10mLYM液体培养基， 灭菌备用， 将步骤四中获得的20 50株红色色素较多的菌株接种于此摇瓶中， 22、 220rpm培养24h做种子， 然后再取5mL种 子液以9接种量接种于250mL灭菌摇瓶(装液量为50mL)中， 22、 220rpm摇床培养120h。 0057 步骤四和步骤五中， 所说的YM液体培养基的pH为6.0， 其配方为： 50.0g/L葡萄糖、 5.0g/L蛋白胨、 3.0g/L酵母浸粉、 3.0g/L麦芽提取物。 0058 步骤六、 上述培养结束后， 采用二甲亚砜法检测虾青素含量(实施例3)， 同时采用 干重法测定红。
33、法夫酵母的生物量干重(实施例4)。 0059 由于虾青素为红法夫酵母的胞内产物， 虾青素含量以及红法夫酵母生物量干重是 虾青素高产量的基础， 虾青素含量以及红法夫酵母生物量干重是红法夫酵母菌株筛选的重 要指标， 因此， 以虾青素产量(由虾青素含量以及红法夫酵母生物量干重共同决定， 即虾青 素产量虾青素含量红法夫酵母发酵生物量干重)高低为标准来选取红法夫酵母菌株， 结合虾青素含量以及红法夫酵母生物量干重， 从获得的大量菌株中综合选取一株虾青素产 量最高的菌株作为本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)， 该菌 株即为研究和生产的出发菌株。 该红法夫酵。
34、母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601) 于2016年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.12413。 0060 实施例3虾青素含量的检测 说明书 5/7 页 8 CN 105861342 A 8 0061 首先， 采用分光光度计法检测虾青素的标准曲线， 如图4所示。 0062 虾青素的标准曲线检测方法为： 称取虾青素纯品(sigma公司生产的虾青素纯品) 1.000mg， 无水乙醇溶解(以0.5mL二氯甲烷助溶)并定容至100mL， 得到10mg/L虾青素标准 品， 分别量取虾青素标准品0mL、 0.5mL、 1。
35、mL、 2mL、 3mL、 4mL， 用无水乙醇定容至10mL， 得到浓 度分别为0mg/L、 0.5mg/L、 1mg/L、 2mg/L、 3mg/L、 4mg/L的虾青素标准溶液， 于分光光度计 478nm处测定各标准溶液吸光值， 空白对照为无水乙醇。 如图4所示， 以吸光度值OD480为横坐 标， 以虾青素含量(mg/L)为纵坐标， 获得虾青素标准溶液与吸光度值的线性关系， 线性关系 为Y(虾青素mg/L)4.935X-0.766(OD480)， 相关系数R20.99929， 表明虾青素含量与OD480 在测定范围内达到良好的线性关系； 0063 其次， 采用二甲亚砜法检测虾青素含量： 。
36、准确移取1mL实施例2中获得的红法夫酵 母发酵液于5mL离心管中， 10000rpm离心5min， 弃上清， 沉淀用去离子水重悬洗涤两次， 离心 后， 往菌体中加1mL60预热的二甲亚砜， 振荡充分摇匀， 置于50水浴锅中， 水浴加热破 壁5min， 加入2mL无水乙醇， 避光静置萃取1015min， 经破壁萃取处理后的色素菌体悬浊 液， 10000rpm离心5min， 将上清转移到容量适宜的棕色容量瓶中， 所得菌体重复上述步骤萃 取色素， 直到菌体为白色为止， 将萃取所得上清转移到同一个容量瓶中。 根据上述得到的 虾青素标准曲线， 同时采用现有的虾青素含量计算公式计算虾青素含量， 虾青素含量。
37、最高 为4.92mg/g， 即每g红法夫酵母菌株XM-1601菌体中含有虾青素4.92mg。 0064 实施例4红法夫酵母的生物量干重测定 0065 准确移取5mL实施例2中获得的红法夫酵母发酵液于干燥、 洁净的5mL离心管中， 10000rpm离心5min， 弃上清， 沉淀用去离子水洗涤两次， 再用少量的去离子水将沉淀洗到预 先烘干至恒重的称量瓶中(未装有菌液的称量瓶的恒重为G1)， 将装有菌液的称量瓶置于 105烘箱中， 烘干至恒重， 然后置于干燥器中冷却至室温， 准确称重(装有菌液的称量瓶的 恒重为G2)， 根据W(G2-G1)/5可算出红法夫酵母发酵生物量干重W(g/L)， 红法夫酵母。
38、发酵 生物量干重最高为65g/L。 0066 实施例5利用实施例2筛选出的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM- 1601)生产虾青素 0067 步骤一、 一级种子 0068 用接种环取实施例2筛选出的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM- 1601)接种至含有50mLYM液体培养基的250mL灭菌三角瓶中， 2025、 180240rpm摇床 培养2030h(优选的， 22、 220rpm摇床培养24h)。 0069 步骤二、 二级种子 0070 取上述摇瓶菌液(即一级种子液)10mL接种至含有100mLYM液体培养基的500mL灭。
39、 菌三角瓶中(接种量9)， 2025、 180240rpm摇床培养2030h(优选的， 22、 220rpm 摇床培养24h)。 0071 步骤一和步骤二中， 所说的YM液体培养基的pH为6.0， 其配方为： 50.0g/L葡萄糖、 5.0g/L蛋白胨、 3.0g/L酵母浸粉、 3.0g/L麦芽提取物。 0072 步骤三、 采用10L发酵罐(上海保兴)进行发酵， 加入发酵培养基， 121灭菌20 30min， 接种二级种子的量为10， 装液量为6L， 发酵温度为(225)(优选发酵温度为22 )， 通气量为10L/min， 控制溶解氧在20以上， 发酵培养24168h(优选发酵120h)后放 。
40、说明书 6/7 页 9 CN 105861342 A 9 罐， 获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液； 发酵过程中控制葡萄糖残糖浓度在020g/L左 右(优选010g/L， 更优选05g/L)， 并用5MNaOH和2M稀硫酸控制pH在5.5左右。 从发酵24h 开始直到发酵结束， 每间隔12h检测红法夫酵母发酵生物量干重(g/L)(按照实施例4检测红 法夫酵母的生物量干重)以及虾青素产量(mg/L)， 计算出虾青素含量(mg/g)(虾青素含量 虾青素产量红法夫酵母发酵生物量干重)。 0073 所加入的发酵培养基的pH为5.5， 其配方为： (30.05)g/L葡萄糖、 (5.05)g/L蛋 白陈、。
41、 (5.05)g/L浓缩酵母浸出粉、 (3.03)g/LMgSO47H20、 (3.03)g/LKH2P04、 (1.0 1)g/L(NH4)2SO4。 0074 优选的， 发酵培养基的配方为： 30.0g/L葡萄糖、 5.0g/L蛋白陈、 5.0g/L浓缩酵母浸 出粉、 3.0g/LMgSO47H20、 3.0g/LKH2P04、 1.0g/L(NH4)2SO4。 0075 所述加入的微量元素包括： 100mg/LCaCl22H2O、 100mg/LFeSO47H2O、 20mg/L ZnSO47H2O、 10mg/LMnSO4H2O、 10mg/LCuSO45H2O、 5mg/LCoSO4。
42、7H2O。 0076 结果如图5所示， 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM- 1601)， 在10L发酵罐中进行了发酵培养条件的优化研究， 形成了一整套小试发酵生产工艺， 红法夫酵母发酵生物量干重达到65g/L， 虾青素发酵产量达到320mg/L， 通过计算获得虾青 素的含量约为4.92mg/g。 该红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)同时拥 有较高的单位细胞虾青素含量和较高的单位发酵液细胞干重， 适合于虾青素工业化生产的 需要。 0077 本发明的红法夫酵母菌株XM-1601(PhaffiarhodozymaXM-1601)的用途： 该菌株 经过培养后富含虾青素， 可以应用于动物饲料添加剂， 食品添加剂和保健品等领域。 0078 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 7/7 页 10 CN 105861342 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 11 CN 105861342 A 11 图4 图5 说明书附图 2/2 页 12 CN 105861342 A 12 。