技术领域
本发明涉及一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法。
背景技术
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrheal Virus，BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV)是引起牛病毒性皮炎的5种主要病毒。感染病毒的牛在临床上均表现为口腔、口鼻之间、蹄、阴门及乳房发生病变，出现水泡、红斑、开裂、坏死和溃疡。由FMDV引发的牛口蹄疫、由VSV引发的牛水泡性口炎和由BTV引发的牛蓝舌病是牛的高度急性传染病，一般呈暴发性流行，死亡率高，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。BVDV和IBRV属于免疫抑制性疾病病毒，病毒感染机体后使免疫力下降，继发细菌感染，而且感染地区遍布全国各省市，感染率居高。牛群中相当一部份牛是BVDV携带者，孕牛感染BVDV后可造成出生持续性感染的小牛，它们终身带毒持续散毒，引起疾病的流行。这些疾病是养牛业的巨大潜患，一旦暴发，将会造成巨大的经济损失。由于这5种病毒在临床症状十分相似，难以区分，因此需建立一种高通量快速检测方法，对牛病毒性皮炎病毒进行准确诊断。
GeXP多基因表达分析系统是一种新型的高通量的基因检测技术，将多重PCR技术和毛细管电泳技术有效的结合起来，采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合从而引发多重体系的扩增，可同时对多达30个目的基因进行有效检测分析，实现真正意义上的高通量检测鉴别多种病原体的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法。
本发明提供了一种引物组合，由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV和引物对V组成；
所述引物对I由引物FMDV-F和引物FMDV-R组成；
所述引物FMDV-F为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)序列表的序列1自5′末端第19至36位核苷酸所示的DNA分子；
(a3)将(a1)或(a2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具 有相同功能的DNA分子；
所述引物FMDV-R为如下(a4)或(a5)或(a6)：
(a4)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a5)序列表的序列2自5′末端第20至43位核苷酸所示的DNA分子；
(a6)将(a4)或(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物对II由引物BTV-F和引物BTV-R组成；
所述引物BTV-F为如下(a7)或(a8)或(a9)：
(a7)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a8)序列表的序列3自5′末端第19至41位核苷酸所示的DNA分子；
(a9)将(a7)或(a8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物BTV-R为如下(a10)或(a11)或(a12)：
(a10)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a11)序列表的序列4自5′末端第20至37位核苷酸所示的DNA分子；
(a12)将(a10)或(a11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物对III由引物VSV-F和引物VSV-R组成；
所述引物VSV-F为如下(a13)或(a14)或(a15)：
(a13)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a14)序列表的序列5自5′末端第19至38位核苷酸所示的DNA分子；
(a15)将(a13)或(a14)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物VSV-R为如下(a16)或(a17)或(a18)：
(a16)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a17)序列表的序列6自5′末端第20至38位核苷酸所示的DNA分子；
(a18)将(a16)或(a17)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物对IV由引物BVDV-F和引物BVDV-R组成；
所述引物BVDV-F为如下(a19)或(a20)或(a21)：
(a19)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(a20)序列表的序列7自5′末端第19至36位核苷酸所示的DNA分子；
(a21)将(a19)或(a20)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且 与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物BVDV-R为如下(a22)或(a23)或(a24)：
(a22)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(a23)序列表的序列8自5′末端第20至44位核苷酸所示的DNA分子；
(a24)将(a22)或(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物对V由引物IBRV-F和引物IBRV-R组成；
所述引物IBRV-F为如下(a25)或(a26)或(a27)：
(a25)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(a26)序列表的序列9自5′末端第19至41位核苷酸所示的DNA分子；
(a27)将(a25)或(a26)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物IBRV-R为如下(a28)或(a29)或(a30)：
(a28)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(a29)序列表的序列10自5′末端第20至36位核苷酸所示的DNA分子；
(a30)将(a28)或(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的用途为如下(b1)至(b6)中的任意一种：
(b1)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒；
(b2)制备用于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的试剂盒；
(b3)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒；
(b4)制备用于检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒；
(b6)制备用于检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒。
本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(b1)至(b6)中的任意一种：
(b1)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒；
(b2)制备用于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的试剂盒；
(b3)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒；
(b4)制备用于检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒；
(b6)制备用于检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒；
(c2)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒；
(c3)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒；
所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的方法，包括如下步骤(d1)或(d2)：
(d1)将待测病毒的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩增(具体可进行GeXP多重PCR扩增；扩增产物可进行毛细管电泳检测)，如果扩增产物含有165-167bp的DNA片段、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果扩增产物含有135-137bp的DNA片段、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片段、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒；
(d2)检测待病毒的cDNA中是否含有所述引物对I的靶序列、所述引物对II的靶序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所述cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对II的靶序列、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对III的靶序列、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对IV的靶序列、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对V的靶序列、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还保护一种检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病毒、水泡性口炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤(e1)或(e2)：
(e1)将待测病毒的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩增(具体可进行GeXP多重PCR扩增；扩增产物可进行毛细管电泳检测)，如果扩增产物含有165-167bp的DNA片段、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果扩增产物含有135-137bp的DNA片段、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片段、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒；
(e2)检测待病毒的cDNA中是否含有所述引物对I的靶序列、所述引物对II的靶序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所述cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对II的靶序列、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对III的靶序列、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对IV的靶序列、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果所述cDNA中含有所述引物对V的靶序列、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤(f1)或(f2)：
(f1)将待测样本的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩增(具体可进行GeXP多重PCR扩增；扩增产物可进行毛细管电泳检测)，如果扩增产物含有165-167bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有口蹄疫病毒，如果扩增产物含有135-137bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有牛传染性鼻气管炎病毒；
(f2)检测待测样本的cDNA中是否含有所述引物对I的靶序列、所述引物对II的靶序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所述cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测样本含有或疑似含有口蹄疫病毒，如果所述cDNA中含有所述所述引物对II的靶序列、待测样本含有或疑似含有蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所述所述引物对III的靶序列、待测样本含有或疑似含有水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述所述引物对IV的靶序列、待测样本含有或疑似 含有牛病毒性腹泻病毒，如果所述eDNA中含有所述所述引物对V的靶序列、待测样本含有或疑似含有牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还保护引物组合，为如下(g1)或(g2)：
(g1)所述引物对I或所述引物对II或所述引物对III或所述引物对IV或所述引物对V；
(g2)所述引物对I、所述引物对II、所述引物对III、所述引物对IV和所述引物对V中的任意两个引物对的组合、任意三个引物对的组合、任意四个引物对的组合。
所述引物组合的用途为鉴别口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还保护所述引物组合的应用，为鉴别口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为鉴别口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒。
以上任一所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。
以上任一所述待测病毒具体可为FMDV O型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV AsiaI型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、BTV 8型灭活病毒、BTV 9型灭活病毒、BTV 15型灭活病毒、BTV 17型灭活病毒、BTV 18型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)、BVDV参考毒株NADL株(BVDV-1型)、BVDV参考毒株牦牛株(BVDV-1型)、BRV参考毒株NCDV、BRV参考毒株BRV014、IBRV病毒、BVDV毒株GX-BVDV1、BVDV毒株GX-BVDV2、BVDV毒株GX-BVDV3、BVDV毒株GX-BVDV4、BVDV毒株GX-BVDV5、BVDV毒株GX-BVDV6、BVDV毒株GX-BVDV7、BVDV毒株GX-BVDV8、BVDV毒株GX-BVDV9、BVDV毒株GX-BVDV10、BVDV毒株GX-BVDV11、BVDV毒株GX-BVDV12、BVDV毒株GX-BVDV13或BVDV毒株GX-041。
以上任一所述“所述引物对I的靶序列”具体可为如下(h1)或(h2)或(h3)：(h1)序列表的序列18所示的DNA分子；(h1)序列表的序列18自5′末端第19至146位核苷酸所示的DNA分子；(h3)与(h1)或(h2)具有98％以上同源性的DNA分子。
以上任一所述“所述引物对II的靶序列”具体可为如下(h4)或(h5)或(h6)：(h4)序列表的序列19所示的DNA分子；(h5)序列表的序列19自5′末端第19至117位核苷酸所示的DNA分子；(h6)与(h4)或(h5)具有98％以上同源性的DNA分子。
以上任一所述“所述引物对III的靶序列”具体可为如下(h7)或(h8)或(h9)：(h7)序列表的序列20所示的DNA分子；(h8)序列表的序列20自5′末端第19至 259位核苷酸所示的DNA分子；(h9)与(h7)或(h8)具有98％以上同源性的DNA分子。
以上任一所述“所述引物对IV的靶序列”具体可为如下(h10)或(h11)或(h12)：(h10)序列表的序列21所示的DNA分子；(h11)序列表的序列21自5′末端第19至289位核苷酸所示的DNA分子；(h12)与(h10)或(h11)具有98％以上同源性的DNA分子。
以上任一所述“所述引物对V的靶序列”具体可为如下(h13)或(h14)或(h15)：(h13)序列表的序列22所示的DNA分子；(h14)序列表的序列22自5′末端第19至169位核苷酸所示的DNA分子；(h15)与(h13)或(h14)具有98％以上同源性的DNA分子。
以上任一所述待测样本具体可为粪便拭子、眼试子、鼻粘液拭子、抗凝血、食道-咽部分泌物、水泡液、直肠黏膜组织样本、水泡皮组织样本或淋巴结组织样本。
以上任一所述GeXP多重PCR扩增的反应体系中，引物组合中的各条引物的浓度如下：FMDV-F和FMDV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2μmol/μL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为2μmol/μL，IBRV-F和IBRV-R的浓度均为0.2μmol/μL。
以上任一所述GeXP多重PCR扩增的反应体系(20μL)具体可为：模板1μL(10-100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer 4μL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25μM)，MgCl2(25μM)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1μL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20μL。
以上任一所述GeXP多重PCR扩增的反应程序具体可为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，10个循环；72℃延伸5min，结束反应。
以上任一所述毛细管电泳的电泳条件为：90℃120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。
本发明建立的GeXP检测方法可以同时鉴别口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒5种牛病毒性皮炎病毒。本方法具有高通量、特异性和灵敏度较高的特点，可用于牛病流行病学的监测和突发疫情的鉴别诊断，保障养牛业的健康发展。
附图说明
图1为实施例2中各待测样本的多重PCR扩增结果图。
图2为实施例2中5种牛病毒性皮炎病毒混合样本的多重PCR扩增结果图。
图3为实施例5中采用反应体系1-5时多重PCR的扩增结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
FMDV O型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV Asia I型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、BTV 8型灭活病毒、BTV 9型灭活病毒、BTV 15型灭活病毒、BTV 17型灭活病毒、BTV 18型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒：参考文献：秦敏，邹丰才，杨云庆，等.蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎多重PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2015，36(9)：18-22.；由云南出入境检验检疫局惠赠，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)：中国兽医药品监察所，货号：AV69。
BVDV参考毒株NADL株(BVDV-1型)：中国兽医药品监察所，货号：AV67。
BVDV参考毒株牦牛株(BVDV-1型)：中国兽医药品监察所，货号：AV68。
IBRV病毒：中国兽医微生物菌种保藏管理中心，货号：AV21。
BVDV毒株GX-BVDV1、BVDV毒株GX-BVDV2、BVDV毒株GX-BVDV3、BVDV毒株GX-BVDV4、BVDV毒株GX-BVDV5、BVDV毒株GX-BVDV6、BVDV毒株GX-BVDV7、BVDV毒株GX-BVDV8、BVDV毒株GX-BVDV9、BVDV毒株GX-BVDV10、BVDV毒株GX-BVDV11、BVDV毒株GX-BVDV12、BVDV毒株GX-BVDV13、BVDV毒株GX-041：参考文献：Fan Q，Xie Z，Xie L，et al.A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus[J].Journal of Virological Methods，2012，186(1-2)：43-48.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer：其中含有序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记；美国贝克曼库尔特公司。
样品缓冲液：美国贝克曼库尔特公司，货号：M409196。
DNA size standard kit-400 Base Pairs：美国贝克曼库尔特公司产品，货号：608098。
DNA polymerase：美国SIGMA公司，货号：D4184-1.5KU。
MgCl2(25μM)：美国SIGMA公司，货号：M8787-1.5ML。
EasyPure Viral DNA/RNA Kit：北京全式金生物技术有限公司，货号：ER201-01。
实施例1、引物组合的设计和制备
进行大量序列分析、比对获得了用于鉴别FMDV、BTV、VSV、BVDV和IBRV 5种牛病毒性皮炎病毒的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的5对特异性引物。每个特异性引物对，正向引物和反向引物均由靶向区段和通用引物区段组成，通用引物区段位于靶向区段的5’端。
用于鉴定FMDV的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：
FMDV-F(序列表的序列1)：AGGTGACACTATAGAATAGCCGTGGGACCATACAGG；
FMDV-R(序列表的序列2)：GTACGACTCACTATAGGGAAAGTGATCTGTAGCTTGGAATCTC。
下划线部分为通用引物区段。
用于鉴定BTV的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：
BTV-F(序列表的序列3)：AGGTGACACTATAGAATAAGGGTAACTCACAGCAAACTCAA；
BTV-R(序列表的序列4)：GTACGACTCACTATAGGGAGAGCAGCCTGTCCATCCC。
下划线部分为通用引物区段。
用于鉴定VSV的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：
VSV-F(序列表的序列5)：AGGTGACACTATAGAATAAAACTACTGGACGGGCTTGA；
VSV-R(序列表的序列6)：GTACGACTCACTATAGGGATGAGATGCCCAAATGTTGC。
下划线部分为通用引物区段。
用于鉴定BVDV的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：
BVDV-F(序列表的序列7)：AGGTGACACTATAGAATAGTGAGTTCGTTGGATGGC；
BVDV-R(序列表的序列8)：GTACGACTCACTATAGGGATATGTTTTGTATAAGAGTTCATTTG。
下划线部分为通用引物区段。
用于鉴定ETEC的引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：
IBRV-F(序列表的序列9)：AGGTGACACTATAGAATAGCGTCATTTACAAGGAGAACATC；
IBRV-R(序列表的序列10)：GTACGACTCACTATAGGGAATCTCGCCCATGCCCAC。
下划线部分为通用引物区段。
用于鉴定FMDV的引物对命名为引物对I。
用于鉴定BTV的引物对命名为引物对II。
用于鉴定VSV的引物对命名为引物对III。
用于鉴定BVDV的引物对命名为引物对IV。
用于鉴定IBRV的引物对命名为引物对V。
上述各引物对组成引物组合。
实施例2、特异性
一、单一模板实验
1、提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA。待测样本分别为：FMDV O型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)、IBRV病毒。
2、分别以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1的引物组合进行GeXP多重PCR。
多重PCR的反应体系(20μL)：模板1μL(约100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer 4μL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25μM)，MgCl2(25μM)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1μL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20μL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2μmol/μL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为2μmol/μL，IBRV-F和IBRV-R的浓度均为0.2μmol/μL。设置用等体积水作为模板的阴性对照。
多重PCR的反应程序：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，10个循环；72℃延伸5min，结束反应。
3、将步骤2的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为：将3μL多重PCR扩增产物、38.75μL样品缓冲液和0.25μL DNA size standardkit-400 Base Pairs漩涡震荡混匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入180μL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件：90℃120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软件Express Profiler software分析结果。
根据电泳结果进行判断，判断标准为：5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断大小分别为：FMDV：165-167bp，BTV：135-137bp，VSV：278-281bp，BVDV：308-310bp，IBRV：187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确结果。
电泳结果如图1所示。图1中，横坐标表示片段大小(单位为bp)，纵坐标表示信号强度，即PCR扩增产物的含量。图1A为FMDV O型灭活病毒cDNA的多重PCR扩增 结果，扩增得到165.03bp的DNA片段。图1B为BTV 4型灭活病毒cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到136.72bp的DNA片段。图1C为VSV NJ型灭活病毒cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到278.04bp的DNA片段。图1D为BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到309.58bp的DNA片段。图1F为IBRV病毒基因组DNA的多重PCR扩增结果，扩增得到188.21bp的DNA片段。每个反应只出现特异性单峰，无其它信号峰，且片段大小与判断标准相符。阴性对照均无扩增，无目的信号峰值。
二、混合模板实验
1、提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA。待测样本分别为：FMDV O型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)、IBRV病毒。
2、将步骤1得到的5种cDNA混合。
3、以步骤2得到的混合液为模板，采用实施例1的引物组合进行GeXP多重PCR。
多重PCR的反应体系(20μL)：模板1μL，Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer 4μL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25μM)，MgCl2(25μM)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1μL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20μL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2μmol/μL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为2μmol/μL，IBRV-F和IBRV-R的浓度均为0.2μmol/μL。设置用等体积水作为模板的阴性对照。
1μL模板中FMDV O型灭活病毒的cDNA约100ng，BTV 4型灭活病毒的cDNA为约100ng，VSV NJ型灭活病毒的cDNA为约100ng，BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)的cDNA为约100ng，IBRV病毒的cDNA为约100ng。
多重PCR的反应程序：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，10个循环；72℃延伸5min，结束反应。
4、将步骤3的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为：将3μL多重PCR扩增产物、38.75μL样品缓冲液和0.25μL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入180μL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件：90℃120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不 同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软件Express Profiler software分析结果。
根据电泳结果进行判断，判断标准为：5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断大小分别为：FMDV：165-167bp，BTV：135-137bp，VSV：278-281bp，BVDV：308-310bp，IBRV：187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确结果。
检测结果如图2所示。图2中，横坐标表示片段大小(单位为bp)，纵坐标表示信号强度，即PCR扩增产物的含量。结果表明，使用GeXP多重PCR可以同时检测出5种牛病毒性皮炎病毒对应的5种信号峰，FMDV：166.17bp，BTV：136.85bp，VSV：280.45bp，BVDV：309.67bp，IBRV：188.02bp，无其它杂峰。阴性对照均无扩增，无目的信号峰值。
实施例3、普适性
1、提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA。待测样本分别为：：FMDV O型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV Asia I型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、BTV 8型灭活病毒、BTV 9型灭活病毒、BTV 15型灭活病毒、BTV 17型灭活病毒、BTV 18型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型)、BVDV参考毒株NADL株(BVDV-1型)、BVDV参考毒株牦牛株(BVDV-1型)、BVDV毒株GX-BVDV1、BVDV毒株GX-BVDV2、BVDV毒株GX-BVDV3、BVDV毒株GX-BVDV4、BVDV毒株GX-BVDV5、BVDV毒株GX-BVDV6、BVDV毒株GX-BVDV7、BVDV毒株GX-BVDV8、BVDV毒株GX-BVDV9、BVDV毒株GX-BVDV10、BVDV毒株GX-BVDV11、BVDV毒株GX-BVDV12、BVDV毒株GX-BVDV13、BVDV毒株GX-041、IBRV病毒。
2、分别以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1的引物组合进行GeXP多重PCR。
多重PCR的反应体系(20μL)：模板1μL(约100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer 4μL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25μM)，MgCl2(25μM)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1μL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20μL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2μmol/μL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为2μmol/μL，IBRV-F和IBRV-R的浓度均为0.2μmol/μL。设置用等体积水作为模板的阴性对照。
多重PCR的反应程序：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，10个循环；72℃延伸5min，结束反应。
3、将步骤2的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为：将3μL多重PCR扩增产物、38.75μL样品缓冲液和0.25μL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入180μL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件：90℃120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软件Express Profiler software分析结果。
根据电泳结果进行判断，判断标准为：5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断大小分别为：FMDV：165-167bp，BTV：135-137bp，VSV：278-281bp，BVDV：308-310bp，IBRV：187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确结果。
采用实施例1的引物组合对待测样本进行多重PCR扩增，每个样本只出现对应病原体的特异性单峰，无其他信号峰，且片段大小与判断标准相符，结果表明，实施例1设计的引物组合普遍适用于5种牛病毒性皮炎病毒。
实施例4、质粒标准品制备
FMDV标准品：将序列表的序列11所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组质粒(命名为FMDV标准品)。
BTV标准品：将序列表的序列12所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组质粒(命名为BTV标准品)。
VSV标准品：将序列表的序列13所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组质粒(命名为VSV标准品)。
BVDV标准品：将序列表的序列14所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组质粒(命名为BVDV标准品)。
IBRV标准品：将序列表的序列15所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组质粒(命名为IBRV标准品)。
实施例5、敏感性
1、将实施4制备的FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准 品等拷贝数混合，得到混合液。
2、用ddH2O 10倍梯度稀释步骤2得到的混合液，得到各个稀释液。
3、将步骤2得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行GeXP多重PCR。
多重PCR的反应体系(20μL)：模板1μL(约100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer 4μL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25μM)，MgCl2(25μM)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1μL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20μL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2μmol/μL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为2μmol/μL，IBRV-F和IBRV-R的浓度均为0.2μmol/μL。设置用等体积水作为模板的阴性对照。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为106拷贝/μL；
反应体系2中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为105拷贝/μL；
反应体系3中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为104拷贝/μL；
反应体系4中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为103拷贝/μL；
反应体系5中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为102拷贝/μL；
反应体系6中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为10拷贝/μL；
反应体系7中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初始浓度均为1拷贝/μL。
多重PCR的反应程序：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，10个循环；72℃延伸5min，结束反应。
4、将步骤3的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为：将3μL多重PCR扩增产物、38.75μL样品缓冲液和0.25μL DNA size standard kit-400 Base Pairs 漩涡震荡混匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入180μL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件：90℃120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软件Express Profiler software分析结果。
根据电泳结果进行判断，判断标准为：5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断大小分别为：FMDV：165-167bp，BTV：135-137bp，VSV：278-281bp，BVDV：308-310bp，IBRV：187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确结果。
检测结果如图3所示。图3A-3E依次对应采用反应体系1-5时多重PCR的扩增结果，图3中，横坐标表示片段大小(单位为bp)，纵坐标表示信号强度，即PCR扩增产物的含量。结果表明，当检测体系中待测DNA的浓度低至100拷贝/μL时，也可以检测出5种牛病毒性皮炎病毒。
实施例5、临床样本检测
待测样本为：305份临床样本，其中包括156份粪便拭子，30份眼试子，30份鼻粘液拭子，70份抗凝血，2份OP液(食道-咽部分泌物)，2份水泡液，15份组织样品(10份直肠黏膜，2份水泡皮，3份淋巴结)。临床样品采集于2012-2014年广西各地，约1/2的样品来源于各地奶牛场无症状奶牛，约1/4的样品来源于具有腹泻，消瘦，流鼻涕等临床症状的牛，1/4样品来源于具有精神不撅，吞咽困难，发烧，口腔糜烂出现水泡，口鼻白沫的牛。
1、提取待测样本总RNA并反转录得到cDNA。
2、将步骤1得到的cDNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行进行GeXP多重PCR。
多重PCR的反应体系(20μL)：模板1μL(约100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5×buffer 4μL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5’末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25μM)，MgCl2(25μM)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1μL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20μL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2μmol/μL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μmol/μL，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为2μmol/μL，IBRV-F和IBRV-R的浓度均为0.2μmol/μL。设 置用等体积水作为模板的阴性对照。
多重PCR的反应程序：95℃5分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃30秒，10个循环；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，10个循环；72℃延伸5min，结束反应。
3、将步骤2的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为：将3μL多重PCR扩增产物、38.75μL样品缓冲液和0.25μL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入180μL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件：90℃120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软件Express Profiler software分析结果。
根据电泳结果进行判断，判断标准为：5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断大小分别为：FMDV：165-167bp，BTV：135-137bp，VSV：278-281bp，BVDV：308-310bp，IBRV：187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确结果。
4、将步骤3得到的阳性扩增产物进行测序以验证结果的正确性。
检测结果如表1所示。
表1临床样本检测结果统计
病原体 GeXP多重PCR阳性数目 测序阳性数目 阳性结果样本占总样本的比例 FMDV 6 6 2.0％ BTV 32 32 10.5％ VSV 0 0 0％ BVDV 41 41 13.4％ IBRV 4 4 1.31％
305份样品中，83份检测结果为阳性，均为单重感染，无混合感染。测序结果显示阳性结果均为对应的病毒，无非特异性扩增的假阳性。