技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是在肿瘤组织或肿瘤区域淋巴结中存在的一个异质性淋巴细胞群，包括被肿瘤抗原预活化的CD3+CD4+Th细胞(T helper lymphocytes)和CD3+CD8+CTL细胞(cytotoxic T lymphocytes)，能以MHC限制性方式特异性识别、杀伤肿瘤细胞；一定数量的肿瘤抗原非特异性的CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞；少量的CD3-CD56+NK细胞(natural killers)，以非MHC限制性方式杀伤肿瘤细胞；另外，还含有一定数量的具有免疫抑制作用的CD4+CD25+FoxP3+Tregs(regulatory T cells)和iDCs细胞(immature dendritic cells)等，与高水平表达的TGF-β、VEGF、PGE2、IL-6、IL-10等分子一起构成免疫抑制性微环境，阻止肿瘤抗原特异性淋巴细胞的持续活化，使其难于有效发挥肿瘤杀伤效应，导致肿瘤免疫逃逸发生。
在美国国立卫生研究院癌症研究所进行的一项临床研究中[Rosenberg SA,et al.Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.Clinical Cancer Research，2011，17(13)：4550-4557]，从手术切除或活检取得的恶性黑色素瘤组织或其区域淋巴结中分离并大量扩增制备TIL细胞，然后联合淋巴预清除方案将其过继输注晚期恶性黑色素瘤患者体内，治疗有效率(CR+PR)高达52％，CR患者最长缓解期超过82个月；在治疗有效的病例 中，客观的肿瘤消退几乎发生在所有的转移病灶中，如脑、肺、肝、骨、淋巴结、皮下组织等。这表明，TIL细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有巨大的临床应用潜力。
但是，从肿瘤组织或区域淋巴结中分离制备TIL细胞，需经历手术切块的剪切、酶解以及细胞分离、培养筛选、大规模扩增等一系列繁琐、漫长过程；同时，复杂的体外操作使TIL细胞面临非常高的污染风险，极易导致培养失败；而且，绝大多数晚期肿瘤患者并不具备手术条件，无法从手术切块获得TIL细胞；有的患者虽能实施手术或进行活检，但获取的肿瘤组织通常太少，难于从中扩增出足量的TIL细胞，无法满足临床治疗的需要。所以，通过肿瘤组织获取TIL细胞进行过继输注抗肿瘤治疗在临床实施过程中面临诸多难于克服的困难。
肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌或卵巢癌等患者常因肿瘤胸腹腔转移而出现恶性胸腹水，大量临床研究证据表明恶性胸腹水中存在肿瘤抗原反应性TIL细胞，具有潜在的提取利用价值。然而，恶性胸腹水中存在一个由Tregs、iDCs以及IL-10、TGF-β、VEGF等细胞因子构成的免疫抑制性微环境；同时，作为免疫逃逸的一个重要机制，肿瘤细胞通常低表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子，无法有效递呈各类肿瘤抗原，造成肿瘤反应性TIL细胞活化不足，或不同的肿瘤反应性T淋巴细胞克隆活化不均衡、数量稀少且普遍存在功能缺陷。
从恶性胸腹水中提取制备TIL细胞进行过继输注抗肿瘤治疗时，输注细胞中肿瘤特异性TIL细胞的比例、数量以及参杂的Tregs细胞的数量均是影响临床疗效的重要因素。中国专利文献CN104946589A利用PD-1、LAG-3或TIM-3的抗体包被磁珠对恶性胸/腹水中分离的单个核细胞进行筛选，然后用OKT3和IL-2刺激筛选细胞扩增，该法不能解决因肿瘤细胞低表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子和免疫抑制性微环境的存在而造成的恶性胸/腹水中肿瘤特异性TIL细胞活化不足、数量稀少的问题，难于筛选出高丰度 的肿瘤特异性TIL细胞；况且，由于Tregs及其他肿瘤抗原非特异性TIL细胞上也有PD-1、LAG-3或TIM-3等分子表达，它们也会随着免疫磁珠而进入到筛选细胞中并得到大量扩增，会影响到培养终产品中肿瘤特异性TIL细胞的纯度及抗瘤效果。至于另外一些TIL细胞制备方法，例如中国专利文献CN103468641A和CN1560234A，利用非特异活化剂如抗OX-40或OKT3、PHA、IL-2等刺激胸腹水中淋巴细胞的增殖，导致在扩增得到的TIL细胞中，除了含有肿瘤抗原特异性的CD3+CD4+Th1细胞和CD3+CD8+CTLs细胞外，还含有大量的肿瘤抗原非特异性的CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞、NK细胞以及具有免疫抑制作用的Tregs细胞，收获的TIL细胞对患者肿瘤细胞的杀伤效率低，难于持续地、高效地在患者体内发挥抗肿瘤作用。
发明内容
为此，本发明所要解决的是现有技术中从恶性胸腹水中分离培养的TIL细胞对肿瘤细胞特异杀伤效率不高的技术问题，进而提供一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为11.0～16.5U/mL；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸腹水移入离心管中，离心，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，离心；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM-V无血清培养基，混匀，离心，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×106～3.0×106个/mL，在适宜的条件下培养4～6天，培养期间用用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液至少1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第5～7天起，用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×106～2.0×106个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并利用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×106～2.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，离心，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。
优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为12.5～15.0U/mL；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸腹水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076～1.078的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM-V无血清培养基，混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×106～3.0×106个/mL，在适宜的条件下培养4～6天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第5～7天起，用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×106～2.0×106个/mL，在适宜的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调 整为1.0×106～2.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21～28天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。
优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(4)TIL细胞的定向诱导活化中，所述AIM-V完全培养基-Ⅰ含有IFN-γ、IL-2和灭活血清；
所述步骤(5)TIL细胞的优势扩增中，所述AIM-V完全培养基-Ⅱ含有IL-2、IFN-γ、抗CD3单克隆抗体和灭活血清。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸腹水的收集：无菌条件下，收集恶性胸腹水，并加入肝素，使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为12.5～15.0U/mL；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸腹水移入离心管中，离心，弃去上清液；将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，离心；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞，加入AIM-V无血清培养基，混匀，离心，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为2.2×106个/mL，在适宜的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×106个/mL，在适宜的条件下继续培养， 每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.5×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第25天时，收集细胞悬液，离心，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于0.9％NaCl混合溶液中，备用。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(4)TIL细胞的定向诱导活化中，所述AIM-V完全培养基-Ⅰ含有500～1000U/mL IFN-γ、10～100U/mL IL-2和3％灭活血清；
所述步骤(5)TIL细胞的优势扩增中，所述AIM-V完全培养基-Ⅱ含有500～2000U/mL IL-2、100～300U/mL IFN-γ、20～50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(2)单个核细胞的分离中，用AIM-V无血清培养基、RPMI1640无血清培养基或PBS缓冲液将沉淀细胞重悬。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(3)单个核细胞的洗涤中，所述单个核细胞为淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞的混合物。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(3)单个核细胞的洗涤中，还包括重复至少一次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，混匀，离心，弃去上清液。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(3)单个核细胞的洗涤中，还包括重复至少一次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，混匀，300×g离心5min，弃去上清液。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(4)TIL细胞的定向诱导活化和步骤(5)TIL细胞的优势扩增中，所述适宜的条件是指：37℃、5％CO2和饱和湿度。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述步骤(6)TIL细胞的收集中，所述0.9％NaCl混合溶液含有IL-2、人血Alb和葡萄糖。
进一步优选地，本发明上述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，
所述(6)TIL细胞的收集中，所述0.9％NaCl混合溶液含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖。
本发明还提供上述方法制备得到的TIL细胞。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
(1)本发明所述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，在诱导肿瘤细胞和DC细胞上调表达MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子、增强肿瘤抗原递呈的基础上，使恶性胸腹水中新鲜分离的肿瘤反应性淋巴细胞首先经历特异活化、克隆扩增的过程，然后再利用特定的细胞因子组合刺激其大规模扩增，同时抑制Tregs细胞的活化与增殖，使最终得到的细胞产品中 含有高比例的肿瘤特异性TIL细胞，从而确保所制备的TIL细胞对患者肿瘤细胞具有特异的、高效的杀伤活性；
(2)本发明所述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(338.6±134.2)×108个(n＝25)，细胞扩增达179.6±24.2倍；其中，CD3+细胞约占98.61％±3.22％，CD3+CD8+细胞约占74.56％±5.19％，CD3+CD4+细胞约占27.42％±6.35％，CD3+CD56+细胞约占51.88％±7.49％，而CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞仅占3.27％±1.75％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达66.54％±5.18％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)；
(3)与利用1000U/mL IL-2、50μg/mL PHA和50ng/mL抗CD3单克隆抗体直接对恶性胸腹水中分离的单个核细胞进行刺激扩增相比，本发明所述利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法所制备的TIL细胞含有更高比例的CD3+CD8+细胞及更低比例的CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞，且对肿瘤细胞的杀伤活性更强(p＜0.01，t检验)。
具体实施方式
本发明以下实施例和实验例中，
AIM-V无血清培养基：GIBCO，批号：1678674；
Ficoll分层液：GE Healthcare，批号10024695；
IL-2：山东泉港药业，批号：201501005；
IFN-γ：上海凯茂生物医药，批号：G20150101；
抗CD3单克隆抗体：eBioscience，批号：E06305-1691；
人血Alb：四川远大药业，批号：201504045A。
实施例1
本实施例利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸水的收集：无菌条件下，收集肺癌导致的恶性胸水1000mL，并加入1.5万U肝素；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；用50mL AIM-V无血清培养基将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用含有750U/mL IFN-γ、55U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为2.2×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有1250U/mL IL-2、200U/mL IFN-γ、35ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.5×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。
通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为2.36×1010个，共扩增159.2倍；其中，CD3+细胞占98.07％，CD3+CD8+细胞占79.69％， CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞占2.44％；对肿瘤细胞的杀伤活性为63.75％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
实施例2
本实施例利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性腹水的收集：无菌条件下，收集胃癌导致的恶性腹水1200mL，并加入1.8万U肝素；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性腹水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；用50mL AIM-V无血清培养基将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.076的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用含有500U/mL IFN-γ、100U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为1.5×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养6天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第7天起，用含有500U/mL IL-2、300U/mL IFN-γ、50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第28天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。
通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为2.18×1010个，共扩增146.5倍；其中，CD3+细胞占99.46％，CD3+CD8+细胞占77.37％，CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞占1.35％；对肿瘤细胞的杀伤活性为58.33％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
实施例3
本实施例利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸水的收集：无菌条件下，收集肺癌所导致的恶性胸水1600mL，并加入2万U肝素；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；用50mL AIM-V无血清培养基将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.078的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、10U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为3.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养4天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第5天起，用含有2000U/mL IL-2、 100U/mL IFN-γ、20ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为2.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为2.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。
通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为2.78×1010个，共扩增239.8倍；其中，CD3+细胞占98.46％，CD3+CD8+细胞占76.05％，CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞占2.78％；对肿瘤细胞的杀伤活性为62.18％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
实施例4
本实施例利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性腹水的收集：无菌条件下，收集结肠癌导致的恶性腹水1000mL，并加入1.5万U肝素；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性腹水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；用50mL AIM-V无血清培养基将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL- 2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为3.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有1000U/mL IL-2、200U/mL IFN-γ、25ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。
通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为2.93×1010个，共扩增185.6倍；其中，CD3+细胞占99.12％，CD3+CD8+细胞占77.46％，CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞占1.88％；对肿瘤细胞的杀伤活性为60.32％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
实施例5
本实施例利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸水的收集：无菌条件下，收集肺癌导致的恶性胸水1200mL，并加入1.8万U肝素；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；用50mL AIM-V无血清培养基将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含 有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、100U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为3.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有2000U/mL IL-2、300U/mL IFN-γ、50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。
通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为3.28×1010个，共扩增225.4倍；其中，CD3+细胞占98.47％，CD3+CD8+细胞占71.33％，CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞占3.62％；对肿瘤细胞的杀伤活性为57.67％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
实施例6
本实施例利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，包括以下步骤：
(1)恶性胸水的收集：无菌条件下，收集乳腺癌导致的恶性胸水900mL，并加入1.2万U肝素；
(2)单个核细胞的分离：将所述恶性胸水移入离心管中，500×g离心5min，弃去上清液；用50mL AIM-V无血清培养基将沉淀细胞重悬，平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上，1600×g离心15min；
(3)单个核细胞的洗涤：收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞(含有淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞)，加入AIM-V无血清培养基，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；重复2次以下步骤：加入AIM-V无血清培养基重悬细胞，吹打、混匀，300×g离心5min，弃去上清液；
(4)TIL细胞的定向诱导活化：用含有1000U/mL IFN-γ、50U/mL IL-2和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞，并调节细胞密度为3.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养5天，培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次；
(5)TIL细胞的优势扩增：从培养第6天起，用含有1000U/mL IL-2、200U/mL IFN-γ、25ng/mL抗CD3单克隆抗体和3％灭活血清的AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞，并调节细胞密度为1.0×106个/mL，在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下继续培养，每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×106个/mL；
(6)TIL细胞的收集：培养第21天时，收集细胞悬液，300×g离心5min，用0.9％NaCl溶液洗涤，将细胞重悬于含有1000U/mL IL-2、3％人血Alb和6mM葡萄糖的0.9％NaCl混合溶液中，备用。
通过检测可知，本实施例制备的TIL细胞总量为1.65×1010个，共扩增174.1倍；其中，CD3+细胞占98.89％，CD3+CD8+细胞占75.60％，CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞占2.83％；对肿瘤细胞的杀伤活性为64.25％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
综上，本发明利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法，在培养第21～28天时可收获TIL细胞(338.6±134.2)×108个(n＝25)，细 胞扩增达179.6±24.2倍；其中，CD3+细胞约占98.61％±3.22％，CD3+CD8+细胞约占74.56％±5.19％，CD3+CD4+细胞约占27.42％±6.35％，CD3+CD56+细胞约占51.88％±7.49％，而CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞仅占3.27％±1.75％，对肿瘤细胞的杀伤活性可达66.54％±5.18％(4h 51Cr释放法，效/靶＝40:1)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。