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1、(10)授权公告号 CN 101709073 B (45)授权公告日 2013.01.23 CN 101709073 B *CN101709073B* (21)申请号 200910238737.6 (22)申请日 2009.12.01 C07H 19/207(2006.01) C07H 19/10(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 47/26(2006.01) C12N 15/88(2006.01) (73)专利权人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路 5 号 (72)发明人 杨振军 唐晨 潘德林 张礼和 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识。
2、产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 费碧华 EP 1460082 A1,2004.09.22, 说明书第 2 页 第 1 段至第 7 页第 42 页 . US 2009/0186343 A1,2009.07.23,说明书第 1 页第 1 段至第 24 页第 218 段 . Xiao-Feng Wang,et al.Cell penetrating peptides and their applications in siRNA delivery. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences .2009, 第 18 卷 ( 第 2 期 )。
3、, 第 99-105 页 . 王佩等 . 环腺苷二磷酸核糖类似物的合成、 表征及性质 .高等学校化学学报 .2008, 第 29 卷 ( 第 2 期 ), 第 314-318 页 . (54) 发明名称 核苷酸磷脂分子及脂质体及其制备方法和应 用 (57) 摘要 本发明公开了一类核苷酸磷脂化合物及其 制备方法， 具有通式 (VIII) 或 (IX) 的结构， 基 于 “一釜法” 策略大量简便制取得到。本发明进 一步提供一类新型脂质体以及其制备方法， 本发 明涉及的磷脂脂质体， 具有制备简单、 效用良好、 应用范围广泛等特点。该种脂质体可以作为研 究反义寡核苷酸与小干扰 RNA(siRNA) 机。
4、理的 分子生物学工具， 也具有潜在的药物开发前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 姜雪 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种核苷酸磷脂分子， 其具有如式 (VIII) 或式 (IX) 所示的两亲性结构 ： 即， 一个核苷结构的亲水基团和一个脂肪醇或甘油脂的亲脂基团， 两种基团由磷脂连 接构成一个核苷酸磷脂分子 ； 其中所含碱基， 即式 (VIII) 和式 (IX) 中的 Base 基团， 为腺嘌呤、 鸟嘌呤、 次黄嘌呤、 胞 嘧啶。
5、、 胸腺嘧啶或尿嘧啶 ； 其中磷酸部分除结合亲水及亲脂基团的两个羟基之外的第三个羟基， 即式 (VIII) 和 式 (IX) 中的 R1基团， 为甲基或腈乙基 ； 其中所含的脂肪醇或甘油脂的亲脂基团， 即式 (VIII) 和式 (IX) 中的 R2基团， 为长度 在 10 到 18 个碳原子的饱和脂肪烃取代基。 2. 根据权利要求 1 所述核苷酸磷脂分子， 其中的 R2基团为十六烷基。 3. 一种制备权利要求 1 所述核苷酸磷脂分子的方法， 包括下列步骤的方法实现 ： (a) 在无水无氧条件下的亚磷酰化反应 ； 通过三价亚磷酰试剂构建含有三价磷的亚磷 脂化合物中间体 ； (b) 反应完成后蒸干。
6、溶剂， 无需转移的氧化反应 ； (c) 氧化之后无需转移、 条件温和的脱保护基反应。 4. 根据权利要求 3 所述的制备方法， 进一步包括脱除保护基完成后经由正相硅胶色谱 方法进行纯化。 5. 一种脂质体， 其是由权利要求 1 所述的核苷酸磷脂分子构建 ； 该脂质体单独由权利 要求 1 所述的核苷酸磷脂分子构成， 或由权利要求 1 所述的核苷酸磷脂分子和其他化合物 混合构成 ； 其中， 所述其他化合物是胆固醇、 含阳离子的磷脂或大豆磷脂。 6. 根据权利要求 5 所述的脂质体， 携带核苷分子、 核苷酸链或 siRNA 分子 ； 所述的核苷 分子是指天然核苷、 经由化学修饰的核苷、 异核苷 ； 。
7、所述的核苷酸链是指各种天然核苷酸链 和经由化学修饰的核苷酸链 ； 所述的siRNA分子是指化学合成的siRNA分子、 经由Dicer酶 降解生产的 siRNA 分子和化学修饰的 siRNA 分子。 7. 根据权利要求 6 所述的脂质体， 其中所述的核苷酸链包括单 / 双链寡核苷酸、 直链 / 环状核苷酸链或脱氧 / 非脱氧核苷酸形成的链。 8. 一种制备权利要求 6-7 任一项所述脂质体的方法， 是通过制剂手段使核苷分子、 寡 核苷酸链或 siRNA 分子包裹在脂质体内， 或是将空白脂质体和上述分子简单混合后孵育形 成可以透过细胞膜的结合物。 9. 权利要求 6-7 任一项所述脂质体用于制备作。
8、为携带基因分子透过细胞膜的转染试 权 利 要 求 书 CN 101709073 B 2 2/2 页 3 剂的用途， 其中所述的基因分子指携带遗传性息的 DNA 单链、 RNA 单链、 DNA 双链、 RNA 双链 及其他用作质粒转染的 DNA 分子。 权 利 要 求 书 CN 101709073 B 3 1/7 页 4 核苷酸磷脂分子及脂质体及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于药物转运载体技术领域， 涉及一种用于核酸跨膜转运的新型核苷酸磷 脂分子及其制备方法， 还涉及该核苷酸磷脂分子所形成的脂质体及其制备方法和应用。 背景技术 0002 基于核酸的一些药物和生物活性分子如异核苷、。
9、 寡核苷酸、 小干扰 RNA(siRNA) 及 各种 RNA、 DNA 单链和双链要想发挥其生物活性， 必须能有效的解决其透过细胞膜的能力。 很多技术已经被用来提高这些化合物的细胞摄取， 例如， 高压静脉注射、 脂质体和纳米聚合 物等， 但是这些方法都存在各自的短板而限制其发展。 0003 目前在核酸类分子跨膜方面应用最广泛的是脂质体载体， 包括天然磷脂脂质体和 阳离子脂质体。 天然磷脂含负电荷， 对核酸类分子的携带能力差， 需要繁琐的处理和制剂设 备及工艺方能制成脂质体， 虽然有成本优势但是易用性差， 且不可能作为转染试剂使用。 阳 离子脂质体虽然能高效地携带转运核酸类分子， 但其对细胞膜也。
10、会造成严重损伤， 虽然使 用简便， 但细胞毒性决定了其只能在低浓度下用于转染实验， 无法大规模用于药物制剂。 而 且作为高效转染试剂的阳离子脂质体工艺为外国所把持， 价格高昂。 这一切， 使得寻找高效 的电中性的脂质体载体成为极为必要的举措。 发明内容 0004 为了解决上述现有技术中存在的问题， 本发明的目的在于提供一类具有高效转运 核酸类化合物透膜能力的磷脂脂质体及其制备方法和应用， 包括方便地大量制备核苷酸磷 脂化合物并进一步形成脂质体的方法。 0005 为了达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0006 一种核苷酸磷脂分子， 其具有如式 (VIII) 或式 (IX) 所示的两亲性。
11、结构 ： 0007 0008 即， 一个核苷结构的亲水基团和一个脂肪醇或甘油脂的亲脂基团， 两种基 0009 团由磷脂连接构成一个核苷酸磷脂分子。 0010 其中， 所述核苷酸磷脂分子中所含碱基， 即式 (VIII) 和式 (IX) 中的 Base 基团， 为 各种常见的天然嘌呤和嘧啶碱基， 包括腺嘌呤、 鸟嘌呤、 次黄嘌呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶及尿嘧 啶等。 说 明 书 CN 101709073 B 4 2/7 页 5 0011 磷酸部分除结合亲水及亲脂基团的两个羟基之外的第三个羟基， 即式 (VIII) 和 式 (IX) 中的 R1基团， 为长度在 1nm 以内， 含 12 个碳原子以下的。
12、非离子型取代基， 如甲基、 乙基、 腈乙基、 苄基等， 也可以是非取代的氢原子。 0012 所含的脂肪醇或甘油脂的亲脂基团， 即式(VIII)和式(IX)中的R2基团， 为长度在 10 到 18 个碳原子的脂肪烃或醚类取代基， 可以是饱和的或不饱和的， 例如十六烷基、 十八 烯基、 聚乙二醇等。 0013 本发明还提供所述核苷酸磷脂分子的制备方法， 是亚磷酰化方法， 其可以但不必 须经由一釜法策略制备。 0014 所述一釜法策略使用能够简单大量获得的试剂， 在常温条件下， 8 小时之内得到目 标化合物。该策略包括下列步骤 ： 0015 (a) 在无水无氧条件下的亚磷酰化反应 ； 通过三价亚磷酰。
13、试剂构建磷脂分子， 尤 其是存在含有三价磷的亚磷脂化合物中间体 ； 0016 (b) 反应完成后蒸干溶剂， 无需转移的氧化反应 ； 0017 (c) 氧化之后无需转移、 条件温和的脱保护基反应。 0018 进一步， 所得化合物还可经由正相硅胶色谱方法纯化。 0019 本发明进一步提供所述核苷酸磷脂分子的应用， 可将其用于制备脂质体， 但不仅 仅局限于此一用途。 0020 所述脂质体可以由本发明公开的核苷酸磷脂分子构成， 或由本发明公开的核苷酸 磷脂分子和其他化合物混合构成。这些化合物可以是胆固醇、 含阳离子的磷脂、 大豆磷脂 等， 但不仅仅局限于这一范围。 0021 上述由本发明公开的核苷酸磷。
14、脂分子构成， 或由本发明公开的核苷酸磷脂分子和 其他化合物混合构成的空白脂质体可以携带核苷分子、 核苷酸链、 siRNA 分子透过细胞膜。 所述的核苷分子是指天然核苷、 经由化学修饰的核苷、 异核苷 ； 所述的核苷酸链是指各种天 然核苷酸链和经由化学修饰的核苷酸链， 包括但不局限于单/双链寡核苷酸、 直链/环状核 苷酸链、 脱氧 / 非脱氧核苷酸形成的链 ； 所述的 siRNA 分子是指化学合成的 siRNA 分子、 经 由 Dicer 酶降解生产的 siRNA 分子和化学修饰的 siRNA 分子。 0022 本发明进一步提供一种制备上述脂质体的方法， 可以是通过制剂手段使核苷分 子、 核苷酸。
15、链或 siRNA 分子包裹在脂质体内， 也可以是将空白脂质体和上述分子简单混合 后孵育形成可以透过细胞膜的结合物。 0023 本发明还提供所述脂质体的用途， 可以作为转染试剂， 携带基因分子透过细胞膜 ； 所述的基因分子指携带遗传性息的 DNA 单链、 RNA 单链、 DNA 双链、 RNA 双链及其他可以用作 质粒转染的 DNA 分子。 0024 本发明可以实现以下优点 ： 提供了一类核苷和各种核酸的高效透膜载体， 低细胞 毒性， 体内可降解为内源性物质， 且使用简便 ； 且该类载体经由一釜法完成的合成路线及简 单的纯化方法制备得到， 具有相对低廉的制造成本。 本发明涉及的磷脂脂质体， 具有。
16、制备简 单、 效用良好、 应用范围广泛等特点， 是一类膜透性好的载体分子， 可用于介导核苷酸类化 合物如 siRNA、 质粒的透膜。该种脂质体可以作为研究反义寡核苷酸与小干扰 RNA(siRNA) 机理的分子生物学工具， 或一种通用的转染试剂， 同时也具有潜在的药物开发前景。 说 明 书 CN 101709073 B 5 3/7 页 6 附图说明 0025 图 1 为代表性化合物 B 的合成路线 ； 0026 图 2 为代表性化合物 B 的核磁共振氢谱谱图 ； 0027 图 3 为代表性化合物 F 的合成路线 ； 0028 图 4 为毛细管电泳评价脂质体对核酸链的亲和力 ； 0029 图 5 。
17、为荧光法观测脂质体内包合 siRNA 的情况及使用其进行细胞转染的结果， 其 中A表示HEK293细胞系转染实验 ； B表示BT474细胞系转染实验 ； C和D表示激光共聚焦显 微观测脂质体 - 核酸复合物颗粒。 具体实施方式 0030 一、 核苷酸磷脂化合物的合成 0031 根据本发明， 制备核苷酸磷脂化合物的合成方法， 主要包括以下步骤 ： 0032 A.使用式(I)的结构与式(II)或式(III)通过亚磷酰化方法构建式(IV)化合物 或式 (V) 化合物， 即在无水无氧条件下进行亚磷酰化反应， 亚磷酰试剂式 (I)R1基团为一短 的亲脂基团， 可以是但不局限于甲基、 腈乙氧基、 苄基 ；。
18、 0033 0034 B.对式(IV)、 式(V)的亚磷酰进行氧化， 氧化剂可以是但不局限于双氧水、 过氧叔 丁醇， 得到式 (VI) 和式 (VII) ； 0035 说 明 书 CN 101709073 B 6 4/7 页 7 0036 C.将式(VI)和式(VII)脱除DMTr保护， 从而形成核苷酸磷脂分子式(VIII)和式 (IX)。 0037 0038 以上所示 Base 为各种常见的天然嘌呤和嘧啶碱基， 包括腺嘌呤、 鸟嘌呤、 次黄嘌 呤、 胞嘧啶、 胸腺嘧啶及尿嘧啶等 ； 0039 以上所示R1为长度在1nm以内， 含12个碳原子以下的不含电荷的取代基， 如甲基、 乙基、 腈乙基、。
19、 苄基等 ； 0040 以上所示 R2为长度在 10 到 18 个碳原子内的脂肪烃取代基， 为长度在 10 到 18 个 碳原子的脂肪烃或醚类取代基， 可以是饱和的或不饱和的， 例如十六烷基、 十八烯基、 聚乙 二醇等。 0041 (1) 一釜法策略 0042 根据本发明， 核苷酸磷脂化合物的制备应通过包括下列步骤的方法实现 ： (a) 在 无水无氧条件下的亚磷酰化反应 ； (b) 反应完成后蒸干溶剂， 无需转移的氧化反应 ； (c) 氧 化之后无需转移条件温和的脱保护基反应 ； 0043 根据本发明， 用于亚磷酰化的试剂可以是 1H- 四氮唑。 0044 根据本发明， 用于脱除 DMTr 保。
20、护基的试剂可以是三氟乙酸 (TFA)。 0045 根据本发明， 用于反应的溶剂包括， 但不限于 ： 吡啶 (Py)、 二氯甲烷 (DCM)、 乙腈 (MeCN)、 甲醇 (MeOH) 和 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)。 0046 (2) 纯化方法 0047 一釜法合成核苷酸磷脂之后的产物可进一步经由正相硅胶色谱方法纯化， 以二氯 甲烷甲醇 50 1 10 1( 体积比 ) 的洗脱条件可分离纯化上述系列核苷酸磷脂产 物。 0048 以下通过具体合成的实施例进一步说明本发明， 但不代表对本发明有任何限制。 0049 根据上述的方法， 我们得到了一系列核苷酸磷脂化合物， 代表性的例举其中六个。
21、 说 明 书 CN 101709073 B 7 5/7 页 8 化合物 A-F ： 0050 0051 实施例 1 化合物 B 的合成 0052 反应路线如图 1 所示。 0053 取化合物B1(亚磷酰化核苷单体均购自国药集团， 为DNA合成常用化合物， 市场来 源广泛 )(740mg)， 1H- 四唑 (70mg)， 无水无氧条件下混合， 溶于双蒸无水 CH3CN 15ml 中， 搅 拌。取化合物正十六醇 ( 棕榈醇 )(360mg)， 溶于 10ml 双蒸无水 CH3CN 中， 缓缓注入前述搅 拌反应中。室温继续搅拌反应 2 小时， TLC 鉴定反应基本完全后冰浴降温。 0054 冰浴搅拌。
22、下逐滴滴加过氧叔丁醇 (0.3ml， 4eq.)， 观察无剧烈放热后撤去冰浴， 继 续反应 30 分钟。然后向反应体系中加入 30ml 5 CHCl2COOH 的 CH2Cl2溶液， 室温搅拌反应 15 分钟， TLC 鉴定反应完全后， 硅胶柱层析 ( 环己烷乙酸乙酯 3 1) 分离， 产物为白色 小胶珠状固体， 完全抽干后为贴壁白色间带红色固体， 共计 390mg， 总收率 66 . 0055 产物核磁氢谱检验如图 2 所示。 0056 1H NMR(CD 3OD) ： 7.73(s， 1H)， 6.24(t， 1H，J 6.0Hz， 1H)， 5.01(m， 1H)， 4.78-4.08(。
23、m， 5H)， 3.73(d， J 2.8， 2H)， 2.83(m， 2H)， 2.48(m， 1H)， 2.34(m， 1H)， 1.81(s， 3H)， 1.62-1.67(m， 2H)， 1.33(s， 26H)， 0.82(t， J 7.2Hz， 3H). 0057 高分辨质谱得 MS ： m/z 600.3409M+H+. 0058 实施例 2 化合物 F 的合成 0059 反应路线如图 3 所示。 0060 取化合物 F1( 购自国药集团 )(400mg)， 1H- 四唑 (40mg)， 无水无氧条件下混合， 溶 于双蒸无水 CH3CN 10ml 中， 搅拌。取化合物正十二醇 (。
24、180mg)， 溶于 10ml 双蒸无水 CH3CN 中， 缓缓注入前述搅拌反应中。室温继续搅拌反应 2 小时， TLC 鉴定反应基本完全后冰浴降 温。 0061 冰浴搅拌下逐滴滴加过氧叔丁醇 (0.2ml)， 观察无剧烈放热后撤去冰浴， 继续反应 30 分钟。然后向反应体系中加入 25ml 5 CHCl2COOH 的 CH2Cl2溶液， 室温搅拌反应 15 分 钟， TLC 鉴定反应完全后， 注入饱和浓氨水 10ml， 搅拌反应 30 分钟， TLC 鉴定反应完全后， 以 说 明 书 CN 101709073 B 8 6/7 页 9 硅胶柱层析(二氯甲烷甲醇301)分离， 产物为白色小胶珠状。
25、固体， 共计183mg， 总收 率 73 . 0062 高分辨质谱得 MS ： m/z 514.3233M+H+. 0063 本发明要求权利的系列化合物都可以用和产物相对应的原料， 以上述方法合成， 故不再一一赘述。 0064 二、 核苷酸磷脂脂质体的制备 0065 (1) 空白脂质体的制备 ： 0066 经过纯化后的上述核苷酸磷脂化合物可用于制备空白脂质体， 通过以下方法实 施 ： 0067 (a) 将核苷酸磷脂的乙醇溶液通过薄膜分散法制为空白脂质体 ； 0068 (b) 透析去小分子杂质 ； 0069 (c) 冻干。 0070 该空白脂质体可按照中华人民共和国药典中关于脂质体药物载体的使用。
26、方法， 用 做各种药物的载体。 0071 (2) 脂质体 - 核酸复合物的制备 ： 0072 除预制空白脂质体用于包载药物之外， 本发明公开的系列核苷酸磷脂化合物还可 以通过溶液状态与核酸分子相互作用， 形成脂质体 - 核酸复合物， 从而发挥转染试剂的作 用。具体通过以下方法实施 ： 0073 (a) 将核苷酸磷脂分散在乙醇水 100 0 50 50 的溶液中 ； 0074 (b) 将上述溶液同核酸 ( 如 siRNA、 反义寡核苷酸、 质粒 ) 溶液混合 ； 0075 (c) 将上述混合液 25 摄氏度下振摇孵育 30 分钟 ； 0076 (d) 上述孵育后混合液即为脂质体 - 核酸复合物，。
27、 可以直接用于细胞转染， 也可以 通过薄膜法、 冻融法等方法修饰粒径或进一步提高包封率。 0077 根据本发明， 用于制备脂质体和透析的主要溶剂包括， 但不限于， 去离子水 (H2O)、 吡啶 (Py)、 二氯甲烷 (DCM)、 乙腈 (MeCN)、 甲醇 (MeOH) 和 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)。其中 具体操作方法为相关专业人员所熟知， 故不再赘述。 0078 三、 根据本发明， 核苷酸磷脂脂质体可以用于以下用途 ： 0079 A.siRNA 透膜转运 ： 0080 核苷酸磷脂脂质体可以用于协助 siRNA 的透膜转运。通过制备脂质体包裹的 siRNA或者将siRNA和核苷酸磷。
28、脂简单共孵育制得的复合物， 可以有效的将siRNA转运进细 胞膜。 0081 B. 寡核苷酸透膜转运 ： 0082 寡核苷酸也可以用和 A 所述同样的方式进行转运。 0083 C. 基因转染 ： 0084 本发明也可以用作基因转染试剂， 通过将核苷酸磷脂和质粒进行大约 30 分钟的 简单共孵育， 即能形成转染复合物， 完成有效转染。 0085 应用实例 1 ： 对寡核苷酸双链的结合能力 ； 0086 使用 21 个碱基对长度的双链 DNA 和化合物合成方法举例中的核苷酸磷脂化合物 C， 对比在有无脂质体参与情况下 DNA 双链的毛细管电泳行为， 说明该类脂质体对寡核苷酸 说 明 书 CN 10。
29、1709073 B 9 7/7 页 10 的结合能力， 如图 4 所示。 0087 实验条件 ： 0088 所用双链 DNA 序列 ( 购买自北京奥科生物技术有限公司 ) 如下 ： 0089 5 -TCGGGAAATTTCTCTATTATT-3 0090 3 -TTAGCCCTTTAAAGAGATAAT-5 0091 所用核苷酸磷脂化合物 C 为其乙醇的真溶液。 0092 毛细管电泳实验温度25， 检测波长254nm， 电泳电压25kV， 流动相缓冲液为25mM TBE， pH 8.0。图中所示峰为溶液中游离的双链 DNA 的检出峰。所用 DNA 为 0.2od/L 的 21 碱基 dsDNA。
30、 在 25mM 的 TBE 中的溶液。 0093 图 4 中所示三条曲线， 自上而下分别为 ： 0094 (1)DNA ： 仅以 DNA 双链溶液单独进行毛细管电泳 ； 0095 (2)0 ： 以 DNA 双链和 50 倍质量当量的核苷酸磷脂混合振摇后立刻进行毛细管电 泳 ； 0096 (3)30 ： 以 DNA 双链和 50 倍质量当量的核苷酸磷脂混合后振摇 30 分钟再进行毛 细管电泳。 0097 电泳结果显示， 加入该种磷脂后， 溶液中游离的双链 DNA 片段大幅减少， 说明该磷 脂可以迅速捕捉结合双链 DNA 寡核苷酸片段。 0098 应用实例 2 ： 转染和透膜能力， 如图 5 所示。
31、。 0099 转染实验 ： 使用化合物合成方法举例中的核苷酸磷脂 B 和羧基荧光素 (FAM) 荧光 标记的siRNA(序列如下， 购买自北京奥科生物技术有限公司)混合孵育， 即将核苷酸磷脂B 的乙醇真溶液加入到siRNA中孵育， 在激光共聚焦显微下能够观察到脂质体-siRNA复合物 (图5C、 D， 脂质体中可见明显绿色荧光聚集) ； 以粒度仪检测该复合物的平均粒径为350nm。 将该复合物和细胞共孵育后， 观察到细胞内荧光(图5A、 B)， 证明siRNA已被转染入细胞内。 0100 实验所用 siRNA 序列 ： 0101 5 -UCGGGAAAUUUCUCUAUUAdTdT-3 010。
32、2 3 -dTdTAGCCCUUUAAAGAGAUAAU-5 0103 本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的， 因此本发明的优选实施 方案代表本发明的主题， 该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领 域技术人员来说显而易见的实施方案， 因此， 本发明的范围不被除所附权利要求之外的任 何内容所限制， 其中除了明确说明外， 所用元素的单数形式并不是指 “一个和唯一” ， 而是指 “一个或更多” 。对本领域一般技术人员来说， 所有公知的上述优选的实施方案和附加实施 方案部分的结构、 组成和功能上的等价物因此引入本文作参考， 而且试图被本发明的权利 要求所涵盖。 0104 。
33、此外， 不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题， 因为它们都已包 括在本发明的权利要求之内。另外， 无论本发明公开事实中的所有部分、 成分， 或者方法步 骤是否在权利要求中被明确叙述， 它们都没有贡献给公众。 但是， 对本领域普通技术人员来 说， 很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下， 可以在形 式、 试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。 说 明 书 CN 101709073 B 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101709073 B 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101709073 B 12 3/3 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 101709073 B 13 。