技术领域
本发明涉及分子生物学中基因克隆领域，具体地说，是涉及一种松墨天牛超气门蛋白基因全长序列及其克隆方法。
技术背景
超气门蛋白(ultraspiracle，USP)隶属于昆虫核受体(nuclear receptor，NR)，一般含有4个模块结构域：A/B域、C域、D域和E域。其中C域(DNA结合域，DNA binding domain，DBD)及E域(配体结合域，ligand binding domain，LBD)相对保守，C域含有两个锌脂结构。通过X射线结晶法发现在E域存在一个配体结合袋，是与EcR形成异源二聚体的结合域。蜕皮激素受体(ecdysone receptors，EcR)是蜕皮激素的作用靶标，是昆虫体内重要的调控蛋白，必须首先与超气门蛋白(ultraspiracle protein，USP)形成异源二聚体，再激活或抑制下游相关基因。
松墨天牛(Monochamus alternatus)属于鞘翅目，天牛科，是一种重要的针叶树害虫，主要危害马尾松、油松、黑松等树干和枝条的韧皮部和木质部，严重影响松树的生长，同时也是松材线虫萎蔫病的主要传播媒介。松墨天牛超气门蛋白基因尚无人研究，本发明填补了这一空白，为解析松墨天牛蜕皮及变态发育的机制提供理论依据，并可望为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供松墨天牛USP基因全长序列及其克隆方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
1、总RNA的提取
对松墨天牛成虫活体样品迅速用液氮冷冻，置于-70℃备用。用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒提取松墨天牛成虫总RNA。
2、引物设计和3′RACE扩增
根据本实验构建的松墨天牛cDNA文库，获得了松墨天牛超气门蛋白基因不含3′端、5′端片段序列，本发明在此基础上进行3′RACE扩增，以获得墨天牛超气门蛋白基因含3′端序列。
3′RACE扩增的特异性引物为：
Ma-USP-3′-Outer：GGATAAGACGGAGTTGGGATG
Ma-USP-3′-Inner：GATTCGCCAAACTGCTACTCC
3、目的基因克隆及测序
套式PCR产物经由1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA片段，与pMD20-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，进行AMP抗性蓝白斑筛选，挑阳性菌落经菌落PCR鉴定后将包含正确重组子的菌样送生工生物测序。
4、序列拼接
将测序结果正确的序列与所构建的eDNA文库中松墨天牛超气门蛋白基因不含3′端、5′端的片段序列拼接，获得松墨天牛超气门蛋白基因含3′端序列。
5、引物设计和5′RACE扩增
本发明在上述扩增出的松墨天牛超气门蛋白基因含3′端序列的基础上进行5′RACE扩增，以获得松墨天牛超气门蛋白基因全长序列。
5′RACE扩增的特异性引物为：
Ma-USP-5′-Gsp：TGGACCTGTGTGAGAAAGCGGCG
Ma-USP-5′-NGsp：CACAGCCTCTCGCTTCATACCCAT
6、目的基因克隆及测序
降落PCR及巢式PCR产物经由1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的DNA片段，与pMD20-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，进行AMP抗性蓝白斑筛选，挑选阳性菌落经菌落PCR鉴定后将包含正确重组子的菌样送生工生物测序。
7、序列拼接
将测序结果正确的序列与上述扩增出的松墨天牛超气门蛋白基因含3′端序列拼接，获得松墨天牛超气门蛋白基因全长序列。
松墨天牛超气门蛋白基因全长序列，该序列如下：
序列中下划线标示的atg为初始密码子，下划线标示的taa为终止密码子。
根据松墨天牛超气门蛋白基因全长序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：
本发明获得了松墨天牛超气门蛋白基因全长序列，填补了松墨天牛超气门蛋白基因的空白，为解析松墨天牛蜕皮及变态发育的机制提供理论依据，并可望为以蜕皮激素受体为靶标的新型杀虫剂提供前期理论基础，对预防松材线虫萎蔫病的传播提供了有利支持。通过对松墨天牛成虫进行RNA提取、3′RACE扩增、5′RACE扩增、目的基因克隆及序列拼接，获得松墨天牛超气门蛋白基因全长序列。该基因序列全长1582bp，开放阅读框为187-1341bp，共编码407个氨基酸。
具体实施方式
以下实施例将本发明进一步说明。
1、松墨天牛总RNA提取
松墨天牛成虫采自广州市从化马尾松林。成虫活体经液氮急冻后保存在1.5mL离心管中，置于-70℃冰箱内保存备用。
用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒提取松墨天牛成虫总RNA，具体方法如下：
1)在经高温高压灭菌、紫外线灭菌、70％无水乙醇灭菌并经液氮充分预冷的研钵中研磨成虫样品至粉末状，取约0.1g悬浮状样放入经液氮充分预冷的1.5mL离心管中，待液氮蒸发完后，加入1mL RNA-Solv Reagent。
2)将样品匀浆室温放置2-3min，使得样品完全裂解。
3)加入200μL氯仿，剧烈震荡15sec，冰上孵化10min；4℃下12000rpm离心15min，出现上层水相。
4)转移80％上层水相至新的1.5mL离心管，加入1/3无水乙醇，涡旋15sec，转移全部混合液至试剂盒提供的2mL Collecting tube，室温下10000rpm离心1min。
5)将收集管中液体重新转移至吸附柱中，室温下10000rpm离心1min。
6)将吸附柱放入新的2mL Collecting tube，加入300μL RNA wash Bufferl，室温下10000rpm离心1min，弃废液。
7)将吸附柱放回收集管中，加入400μL RNA wash Bufferl，室温下10000rpm离心1min，弃废液。
8)将吸附柱放回收集管中，加入500μL RNA wash Buffer2(事先加入48mL无水乙醇稀释)，室温下10000rpm离心1min，弃废液。
9)重复上一步骤后再室温下13000rpm离心2min。
10)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央悬空加入40μL DEPC Water，室温静置2min，室温下13000rpm离心1min，将所得到的RNA溶液转移到200μL PCR管，从中吸取1μL进行紫外分光光度测定浓度和纯度，吸取4μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测条带是否清晰完整以判断所提取的RNA有否降解，其余经检验合格的RNA溶液置于-70℃冰箱保存备用。
注意事项：用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌(180℃，60min)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装，也可使用RNA实验用的一次性塑料容器盛装，使用的无菌水用0.1％的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验使用的试剂盒无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。
2、cDNA 3′末端扩增
按照3′Full RACE Core Set Ver.2.0 kit试剂盒进行，具体操作步骤如下：
1)反转录反应
反应体系如下：
PCR反应程序为：42℃反应60min，70℃反应15min。
2)套式PCR扩增
a)Outer PCR扩增
反应体系如下：
PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，20个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
b)Inner PCR扩增
反应体系如下：
PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
3、目的基因克隆及测序
1)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中加入500μL平衡液BL，室温下，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
b)称取一干净1.5mL离心管重量，将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶切下(尽量切除多余部分)放入称重的离心管中，称取重量，计算胶块重量。
c)向胶块中加入等倍体积溶液PC(胶重0.1g，体积约100μL)，50℃金属浴加热10min左右，期间上下翻转离心管，直至胶块完全溶解。
d)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12000rpm离心1min，弃废液。
e)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前加入60mL无水乙醇稀释)，静置2-5min，12000rpm离心1min，弃废液。
f)重复上一步骤。
g)再次12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温放置3-5min，彻底晾干。
h)将吸附柱CB2放入新1.5mL离心管(去盖)中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液至200μL PCR管，置于-20℃冰箱保存，用于后续试验。
2)T载体连接
PCR管中依次加入：pMD20-T Vector 1μL、目标DNA片段产物3μL、Sterilized water 1μL，加入5μL的Solution I至终体积10μL，4℃反应过夜。
3)转化感受态细胞
a)从-70℃冰箱取出感受态细胞放于冰上融化，并分装到1.5mL离心管每管50μL。
b)每管中加入4μL T载体连接产物，缓慢混均。
c)冰上放置45min。
d)置于42℃水浴锅中，热激45sec。
e)立即将离心管插于冰上1min。
f)在37℃下，160-225rpm摇菌1h。
g)将离心管中的菌液混匀，吸取30～50μL加到配好的平板培养基上，用无菌的三角弯头玻棒将菌液均匀涂开，用锡箔纸严实包裹后正面朝上放置2h，倒置平板，37℃，培养12-16h。
4)阳性重组子的鉴定及测序
a)在1.5mL离心管中加入600μL含氨苄的培养液，挑选白色菌落放入培养液中，37℃下，160-225rpm培养3-4h。
b)菌落PCR
反应体系如下：
反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec；55℃30sec 30个循环；72℃1min；72℃10min。反应结束后取4μL反应产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
c)将包含正确重组子的克隆送至生工生物进行测序。
4、将测序正确的序列除去重叠部分，与构建的cDNA文库松墨天牛超气门蛋白基因不含3′端、5′端的片段序列拼接，获得松墨天牛超气门蛋白基因含3′端序列。
5、cDNA 5′末端扩增
按照RACE 5′/3′Kit试剂盒进行，具体操作步骤如下：
1)反转录反应
a)在一支200μL PCR管中加入5×Frist-Strand Buffer 4μL、DTT(100mM)0.5μL、dNTPs(20mM)1μL，总体积为5.5μL，室温下放置。
b)新的200μL PCR管中加入1μL 5′-CDS Primer A、1-10μL RNA(RNA含量在10ng-1μg)、0-9μL Sterik H2O(与RNA含量之和为10μL)，总体积为11μL，微型离心机离心数秒混匀。
PCR反应条件：72℃反应3min，42℃反应2min，反应后离心4000rpm 10sec，加入1μL SMARTER II A Oligonucleotide，得到总体积为12μL的混合溶液。
c)在第一步的PCR管中加入0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)、2μL SMART Suribe Reverse Transcriptase(100U)，将总体积为8μL的混合溶液全部加入到上一步骤所得混合溶液中，得到总体积为20μL的混合溶液，微型离心机离心数秒混匀。
PCR反应条件：42℃反应90min，70℃反应10min。
d)用Tricine-EDTA Buffer稀释(总RNA＜200ng，加10μL；总RNA＞200ng，加90μL；Poly A+RNA加240μL)，置于-20℃保存备用。
2)降落PCR扩增
a)在一支200μL PCR管中依次加入15.5μL PCR Grade H2O、25μL 2×Seq Amp Buffer，1μL Seq Amp DNA Polymerase，总体积41.5μL，微型离心机离心数秒混匀，不要产生气泡。
b)反应体系如下：
反应条件(5′Gsp引物Tm＞70℃)：94℃30sec，72℃3min(扩增长度＞3kb，加1min/kb)，5个重复；94℃30sec，70℃30sec，72℃3min，5个重复；94℃30sec，68℃30sec，72℃3min(扩增长度＞3kb，加1min/kb)，25个重复。
c)取4μL反应产物，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
注意：须在5′Gsp特异性引物5′端加上15bp交叠区在载体和5′端‘Gsps序列’：GATTACGCCAAGCTT。
3)巢式PCR
a)降落PCR产物稀释，取5μLPCR产物，加入245μL Tricine-EDTA Buffer。
b)在一支200μL PCR管中依次加入15.5μL PCR Grade H2O、25μL2×Seq Amp Buffer，1μL Seq Amp DNA Polymerase，总体积41.5μL，微型离心机离心数秒混匀，不要产生气泡。
c)反应体系如下：
反应条件：94℃30sec，68℃30sec，72℃3min，20个重复。
d)取4μL反应产物，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
注意：须在5′NGsp特异性引物5′端加上15bp交叠区在载体和5′端‘Gsps序列’：GATTACGCCAAGCTT。
6、目的基因克隆及测序
1)PCR产物鉴定
采用Nucelo Spin Gel and PCR Clean-Up Kit试剂盒回收目的DNA片段，具体操作步骤如下：
a)称取一干净1.5mL离心管重量，将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶切下(尽量切除多余部分)放入称重的离心管中，称取重量，计算胶块重量。
b)每100mg胶加入200μL Buffer NT I。
c)置于50℃金属浴中加热5-10min，每隔2-3min翻转离心管一次，直到胶完全溶解。
d)将吸附柱放入收集管中，转移样品溶液至吸附柱中，13000rpm离心30sec，弃废液(单次操作不得大于700μL)。
e)加入700μL Buffer NT 3(事先加入24mL 96％-100％无水乙醇稀释)，13000rpm离心30sec，弃废液，再次13000rpm离心1min，以完全除去Buffer NT 3。
f)将吸附柱放到新的1.5mL离心管(去盖)，向吸附膜中间位置悬空滴加15-30μLBuffer NE，室温下静置1min，13000rpm离心1min，收集DNA溶液转移到200μL PCR管，从中吸取1μL进行紫外分光光度测定浓度和纯度，其余经检验合格的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。
2)T载体连接
PCR管中依次加入：5×Infusion HD Enzyme Premix 2μL、Lineareized PRACE vector 1μL、DNA纯化物7μL，总体积10μL，50℃水浴热激15min，冰上保存。
3)转化感受态细胞
a)从-70℃冰箱取出感受态细胞放于冰上融化，并分装到1.5mL离心管每管50μL。
b)每管中加入4μL T载体连接产物，缓慢混均。
c)冰上孵化30min。
d)置于42℃水浴锅中，热激60sec。
e)立即将离心管插于冰上1-2min，加入SOC(事先置于37℃融化)446μL，定容至500μL。
f)在37℃下，160-225rpm摇菌1h。
g)将离心管中的菌液混匀，吸取100μL加到配好的平板培养基上，用无菌的三角弯头玻棒将菌液均匀涂开，用锡箔纸严实包裹后正面朝上放置2h，倒置平板，37℃，培养12-16h。
4)阳性重组子的鉴定及测序
a)在1.5mL离心管中加入600μL含氨苄的培养液，挑选白色菌落放入培养液中，37℃下，160-225rpm培养3-4h。
b)菌落PCR
反应体系如下：
反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec；55℃30sec 30个循环；72℃1min；72℃10min。反应结束后取4μL反应产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
c)将包含正确重组子的克隆送至生工生物进行测序。
7、将测序正确的序列除去重叠部分，与上述扩增出的松墨天牛超气门蛋白基因含3′端的片段序列拼接，获得松墨天牛超气门蛋白基因全长序列。