技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法。
背景技术
腺病毒是一种线型双链DNA无包膜病毒,它的DNA和核心蛋白形成内核,蛋白外壳是直径约80nm的正二十面体,由240个六面体和12个位于正二十面体顶部的五面体构成。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内,然后腺病毒基因组转移至细胞核内,进行靶标蛋白的表达,不整合进入宿主细胞基因组中。重组腺病毒是在体外和活体用于蛋白药物表达的常见病毒载体,体外构建和包装腺病毒载体是产生重组腺病毒颗粒的重要步骤。其中,体外构建携带目标蛋白基因的腺病毒骨架基因载体是包装腺病毒颗粒的先决条件。
传统的AdEasy腺病毒载体重组系统通过E.coli BJ5183载有的recET基因(RecE通路)实施保守性双链DNA断裂修复,从而具有高度基因同源重组活性,且稳定传代的特点。recE编码一种核酸外切酶;recT编码一种结合于ssDNA促使链交换的蛋白。传统的腺病毒载体重组系统很不稳定,产生阳性重组子的效率并不高,而且筛选的工作量比较大。Red重组系统属于λ噬菌体的重组系统,其编码基因exo、bet和gam置于PL操纵子的控制之下。exo基因的产物是λ核酸外切酶,它可将dsDNA5’端切开,产生3’端突出。bet基因编码的β蛋白,可与ssDNA结合促进互补链的复性,并可以介导DNA链退火和交换反应。它在溶液中的游离状态为环状物,当结合到ssDNA时形成大的环状物,当结合到dsDNA时形成螺旋状纤维。gam基因的产物是一个分子量为16000Da的多肽,结合到宿主的RecBCD蛋白,形成二聚体,抑制RecBCD的外切酶活性。
发明内容
鉴于现有技术的上述不足,本发明的目的是提供一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法,包括如下步骤:将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化携带pKD46 质粒的BJ5183感受态细胞,然后在培养基中培养。所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经过L-阿拉伯糖诱导。
优选的,所述的提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法,具体包括如下步骤:
(1)将pKD46质粒转化到BJ5183中,获得含有pKD46质粒的BJ5183菌株,利用L-阿拉伯糖诱导其产生Red重组酶并且将其制备成感受态细胞。
(2)将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化步骤(1)制备的感受态细胞,热击、冰浴后加入液体培养基先培养使细菌恢复正常生长状态并且表达质粒编码的抗生素基因,再涂布到含卡那霉素(Kan)的固体培养基培养去除pKD46质粒。挑取固体培养基上生长的单菌落培养、提取质粒得到重组腺病毒载体。
本发明利用pKD46质粒,构建出含有Red重组系统的BJ5183菌株,使得腺病毒载体pAdEasy与pAdtrack-CMV的重组发生在能表达Red重组酶的菌体中,在L-阿拉伯糖诱导的条件下使其稳定地表达Red重组酶,重组酶能促进同源基因序列完成重组,大大提高了AdEasy腺病毒载体系统的重组效率(产生的重组腺病毒载体的酶切鉴定阳性效率可以达到100%),为今后重组腺病毒载体构建提供了很大的方便。
附图说明
图1是对照组1重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-7是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP的质粒,质粒大小全部正确;M是DL10000。
图2是PacI酶切鉴定对照1重组提取的重组腺病毒的电泳图。1-7是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物,阳性载体经酶切后只有3和7为阳性,酶切鉴定阳性率28.6%;M是DL10000。
图3是实验组1重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-7是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP的质粒,大小全部正确;M是DL15000。
图4是PacI酶切鉴定实验组1重组提取的重组腺病毒载体的电泳图。1-7是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物;阳性载体经酶切后全部为阳性重组子,酶切鉴定阳性率100%;M是DL15000。
图5是实验组2重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-7是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP/DrsB2的质粒,1、2、3、4、7质粒大小正确;M是DL15000。
图6是PacI酶切鉴定实验组2重组提取的重组腺病毒载体的电泳图。1-7是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP/DrsB2质粒的产物,阳性载体经酶切后全部为阳性重组子,酶切鉴定阳性率100%;M是DL15000。
图7是对照组2重组提取的重组腺病毒载体电泳图。1-8是重组腺病毒载体pAdeasy-GFP的质粒,1、2、6质粒大小正确;M是DL15000。
图8是PacI酶切鉴定对照组2重组提取重组腺病毒载体的电泳图。1-8是PacI酶切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物,载体经酶切后2和3是阳性,酶切鉴定阳性率25%;M是DL15000。
具体实施方式
应用AdEasy腺病毒载体系统,以往的方法是将pAdEasy-1质粒和线性化pAdtrack-CMV和共转化BJ5183感受态中,或者将线性化pAdtrack-CMV转化到含有pAdEasy-1质粒的BJ5183感受态中。本发明是将线性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-1质粒共转化含有Red重组酶的BJ5183感受态中。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、携带pKD46质粒的BJ5183感受态细菌的制备
(1)从平板挑取用普通转化方法获得的携带pKD46质粒的BJ5183菌株单菌落接种到4mL含有Amp(终浓度25-50μg/mL)的SOB培养基中,30℃、220rpm,振荡培养过夜。
(2)实验组感受态细胞:取1mL(接种量1%~2%)培养物接种到装100mL含有Amp(终浓度25-50μg/mL)SOB培养基的250mL锥形瓶中,30℃、220rpm,先振荡培养1h,然后加入L-阿拉伯糖(终浓度0.2%)诱导培养至OD600=0.4~0.5。对照组感受态细胞:除不加入L-阿拉伯糖诱导外,其余操作同上。
(3)在已灭菌的超净台中将培养好的菌液转移到2个已灭菌的50mL离心管中,冰浴30min。
(4)4℃、4100rpm离心10min。在超净台中弃去上清液,倒置在滤纸上使液体尽可能流尽。
(5)先分别用0.5mL冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打混匀至菌液呈云雾状),再加CaCl2溶液至30mL混匀,冰浴90min。
(6)4℃、4100rpm离心10min。在超净台中弃去上清液,倒置在滤纸上使液体尽可能流尽。
(7)先分别用0.5mL冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打混匀至菌液呈云雾状),再加CaCl2溶液至30mL混匀,冰浴60min。
(8)4℃、4100rpm离心10min。在超净台中弃去上清液,倒置在滤纸上使液体尽可能流尽。
(9)先分别用0.5mL冷的甘油CaCl2溶液(0.1mol/L CaCl2与甘油体积比85∶15)悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打混匀至菌液呈云雾状),再加甘油CaCl2溶液至2mL混匀,分装至已灭菌的1.5mL EP管中(每管200μL)。-70℃条件下可以长期保存使用。
通过上述方法制备得到经L-阿拉伯糖诱导携带pKD46质粒的BJ5183感受态(实验组)和未经L-阿拉伯糖诱导携带pKD46质粒的BJ5183感受态(对照组)。
二、pAdtrack-CMV质粒的线性化
(1)可选方法A(本操作中使用方法A):Pme I单酶切
向已灭菌的微量离心管中,依次加如下组分:pAdtrack-CMV或pAdTrack-CMV/DrsB2 3-5μg,10×B Buffer 5μL,PmeI(5U/μL)1μL,ddH2O加至50μL。
可选方法B:EcoR I单酶切
向已灭菌的微量离心管中,依次加如下组分:pAdtrack-CMV或pAdTrack-CMV/DrsB2 3-5μg,10×H Buffer 5μL,EcoRI(15U/μL)0.5μL,ddH2O加至50μL。
上述pAdTrack-CMV/DrsB2质粒的构建如下:
DrsB2基因是根据其氨基酸序列设计两对引物使用重叠PCR拼接获得,引物序列如下:
DrsB2(sense):GGGGTACCATGGGCCTGTGGAGCAAGATCAAGGAGGTGG GCAAGGAGGCCGCCAAGGCCGCCGCCAAG;
DrsB2(antisense):GCTCTAGATCACACGGCCTCGCTCACGGCGCCCAGGG CGGCCTTGCCGGCGGCCTTGGCGGCGGCCTTG。
(a)应用常规重叠PCR技术扩增目的基因。
重叠叠PCR反应体系如下:10×buffer 2μL,DrsB2(sense)2μL,DrsB2(antisense) 2μL,Taq酶0.2μL,ddH2O 11.8μL。
重叠PCR程序设定如下:94℃5min;94℃30s,64℃30s,72℃30s,35个循环;72℃5min,16℃15min。
(b)用普通DNA回收试剂盒回收PCR产物,分别对PCR产物和pAdTrack-CMV做双酶切处理。
双酶切体系如下:10×Tagon buffer 5μL,KpnI 2μL,XbaI 1μL,PCR产物或pAdTrack-CMV 20μL,ddH2O 22μL。
(c)普通琼脂糖凝胶电泳后,切取目标条带使用普通DNA回收试剂盒回收酶切产物,构建连接体系。16℃恒温水浴槽连接过夜。10μL连接产物全部转化到感受态DH5α中并第二天挑取单克隆过夜培养,提取质粒鉴定获得pAdTrack-CMV/DrsB2。
连接体系如下:10×T4连接buffer 1μL,T4连接酶1μL,酶切回收的pAdTrack7μL,酶切回收的PCR产物1μL。
(2)37℃温浴酶切4h。
(3)酶切产物全部上样,1%琼脂糖凝胶电泳回收,110V 100mA。
(4)用普通胶回收试剂盒回收,加30μL Elution Solution,线性化pAdtrack-CMV浓度可以在50ng/μL以上。提取步骤详见试剂盒说明书。
三、线性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-1质粒共转化
(1)实验组1为取100ng pAdEasy-1和400-500ng线性化质粒pAdtrack-CMV在已灭菌的微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10%)共转化于100μL上述制备的携带pKD46质粒的BJ5183感受态(实验组感受态)中,冰浴30min。
实验组2为取100ng pAdEasy-1和400-500ng线性化携带靶标基因BrsB2的载体质粒pAdtrack-CMV/BrsB2在已灭菌的微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10%)共转化于100μL上述制备的携带pKD46质粒的BJ5183感受态(实验组感受态)中,冰浴30min。
对照组1为取100ng pAdEasy-1和400-500ng线性化质粒pAdtrack-CMV在已灭菌的微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10%)共转化于100μL用普通氯化钙法制备的不携带pKD46的BJ5183感受态中,冰浴30min。
对照组2为取100ng pAdEasy-1和400-500ng线性化质粒pAdtrack-CMV在 已灭菌的微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10%)共转化于100μL上述制备的不使用阿拉伯糖诱导的对照组BJ5183感受态(对照组感受态)中,冰浴30min。
(2)42℃保温90s进行热击。热击后迅速放入冰中,冰浴10min。
(3)加入900μL SOB培养基混匀后,30℃振荡(摇床转速不超过150rpm)培养60min,使细菌恢复正常生长状态,并且表达质粒编码的抗生素基因。
(4)室温下5000rpm离心3min。用移液枪小心吸去800μL上清液。
(5)再将剩余菌液混匀后在含Kan(终浓度25μg/mL)的LB固体培养基的平板上全部涂布,静置1~2min。在37℃的培养箱中倒置培养过夜(一般要培养16h),可以去除pKD46质粒。
(6)培养完成,从平板上挑单菌落提质粒鉴定。
四、重组腺病毒载体的提取
(1)随机挑取平板上若干个单菌落接种到5mL含Kan(终浓度25μg/mL)的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
(2)将摇混浊的菌液在已灭菌的超净台中首先进行保菌,取600μL菌液于已灭菌的1.5mL EP管中加入400μL已灭菌的50%甘油,-70℃冰箱冻存,剩余菌液用于提质粒鉴定。
(3)将剩余菌液分别富集到1.5mLEP管中,8000rpm离心1min,弃上清。
(4)向菌体沉淀中加入150μL溶液I,用移液枪吹打混匀或在旋涡混合器上剧烈振荡,使菌体充分悬浮。
(5)加入200μL新配制的溶液II(呈澄清状,使细胞裂解),温和上下颠倒4~6次EP管以便使菌体充分裂解,直至形成透亮溶液。
(6)加入200μL溶液III,上下颠倒6~8次混匀,切记不可振荡,有白色絮状物产生,静置3min。4℃、12000g离心10min。将上清液小心吸至新的已灭菌的EP管中。
(7)加入200μL(上清液的体积)苯酚/氯仿/异戊醇,充分混匀,室温下12000g离心10min。
(8)吸取上层水相转移到新的已灭菌的EP管中,并加入2倍体积的预冷的无水乙醇上下颠倒混匀。4℃、12000g离心10min,弃上清。
(9)加入1mL 70%预冷的乙醇上下颠倒混匀,洗涤沉淀和去盐。4℃、12000g 离心10min,弃上清。倒置于洁净的滤纸上,让液体流尽,沉淀物自然干燥,然后加入30μL ddH2O和适量RNA酶溶解沉淀,37℃温育20-30min。
(10)提取的质粒通过0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果见图1、3、5、7。图1为对照组1:pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP,从质粒大小判断,全部正确,可以进行酶切鉴定;图3为实验组1:pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP,从质粒大小判断,全部正确,可以进行酶切鉴定;图5为实验组2:pAdTrack-CMV/DrsB2与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP/DrsB2,从质粒大小判断,1、2、3、4、7为正确质粒,可以进行酶切鉴定;图7为对照组2:pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP,从质粒大小判断,全部正确,可以进行酶切鉴定。
(11)选出疑似正确的质粒,质量分子量应该大于36kbp,用于酶切鉴定。
五、重组腺病毒载体的酶切鉴定
(1)向已灭菌的微量离心管中,依次加如下组分:重组腺病毒载体3μg,10×H Buffer 2μL,PacI(10U/μL)0.2μL,ddH2O加至20μL。
(2)37℃酶切3h。
(3)酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果见图2、4、6、8。经PacI酶切后,阳性重组腺病毒载体会产生一个大片段大约30kb和一个小片段大约3kb或4.5kb。图2为对照组1:pAdEasy-GFP重组载体酶切,从酶切小片段判断,3和7是正确的,酶切鉴定阳性率28.6%;图4为实验组1:pAdEasy-GFP重组载体酶切,从酶切小片段判断,酶切鉴定阳性率100%;图6为实验组2:pAdEasy-GFP/BrsB2重组载体酶切,对1、2、3、4、7从酶切小片段判断,酶切鉴定阳性率100%;图8为对照组2:pAdEasy-GFP重组载体酶切,从酶切小片段判断,2和3是正确的,酶切鉴定阳性率25%。
(4)将含阳性重组腺病毒载体的菌株保菌,-70℃冻存。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。