一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610462362.1 (22)申请日 2016.06.17 (71)申请人 武汉生物工程学院 地址 430415 湖北省武汉市阳逻经济开发 区汉施路1号 (72)发明人 张军林田驰郭书奎郭晓红 李毅 (51)Int.Cl. C12N 15/861(2006.01) (54)发明名称 一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种提高AdEasy腺病毒载体 系统重组效率的方法， 属于生物工程领域。 将腺 病 毒 载 体 p Ad E a

2、s y 与 连 接 有目 的 基 因 的 pAdtrack-CMV重组载体共转化携带pKD46质粒的 BJ5183感受态细胞， 然后在培养基中培养； 所述 的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过 程中经过L-阿拉伯糖诱导。 本发明使得腺病毒载 体pAdEasy与pAdtrack-CMV的重组发生在能表达 Red重组酶的菌体中， 在L-阿拉伯糖诱导的条件 下使其稳定地表达Red重组酶， 重组酶能促进同 源基因序列完成重组， 大大提高了AdEasy腺病毒 载体系统的重组效率。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 105950659 A 2016.09.21 CN

3、105950659 A 1.一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法， 其特征在于： 将腺病毒载体 pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化携带pKD46质粒的BJ5183感受 态细胞， 然后在培养基中培养； 所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经 过L-阿拉伯糖诱导。 2.一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： (1)将pKD46质粒转化到BJ5183中， 获得含有pKD46质粒的BJ5183菌株， 利用L-阿拉伯糖 诱导其产生Red重组酶并且将其制备成感受态细胞； (2)将腺病毒载体pA

4、dEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化步骤(1) 制备的感受态细胞， 热击、 冰浴后加入液体培养基先培养， 再涂布到含Kan的固体培养基培 养去除pKD46质粒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105950659 A 2 一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体涉及一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的 方法。 背景技术 0002 腺病毒是一种线型双链DNA无包膜病毒， 它的DNA和核心蛋白形成内核， 蛋白外壳 是直径约80nm的正二十面体， 由240个六面体和12个位于正二十面体顶部的五面体构成

5、。 它 通过受体介导的内吞作用进入细胞内， 然后腺病毒基因组转移至细胞核内， 进行靶标蛋白 的表达， 不整合进入宿主细胞基因组中。 重组腺病毒是在体外和活体用于蛋白药物表达的 常见病毒载体， 体外构建和包装腺病毒载体是产生重组腺病毒颗粒的重要步骤。 其中， 体外 构建携带目标蛋白基因的腺病毒骨架基因载体是包装腺病毒颗粒的先决条件。 0003 传统的AdEasy腺病毒载体重组系统通过E.coliBJ5183载有的recET基因(RecE通 路)实施保守性双链DNA断裂修复， 从而具有高度基因同源重组活性， 且稳定传代的特点。 recE编码一种核酸外切酶； recT编码一种结合于ssDNA促使链交

6、换的蛋白。 传统的腺病毒载 体重组系统很不稳定， 产生阳性重组子的效率并不高， 而且筛选的工作量比较大。 Red重组 系统属于 噬菌体的重组系统， 其编码基因exo、 bet和gam置于PL操纵子的控制之下。 exo基 因的产物是 核酸外切酶， 它可将dsDNA5 端切开， 产生3 端突出。 bet基因编码的 蛋白， 可 与ssDNA结合促进互补链的复性， 并可以介导DNA链退火和交换反应。 它在溶液中的游离状 态为环状物， 当结合到ssDNA时形成大的环状物， 当结合到dsDNA时形成螺旋状纤维。 gam基 因的产物是一个分子量为16000Da的多肽， 结合到宿主的RecBCD蛋白， 形成二

7、聚体， 抑制 RecBCD的外切酶活性。 发明内容 0004 鉴于现有技术的上述不足， 本发明的目的是提供一种提高AdEasy腺病毒载体系统 重组效率的方法。 0005 本发明的目的通过下述技术方案实现： 0006 一种提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法， 包括如下步骤： 将腺病毒载体 pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化携带pKD46质粒的BJ5183感受 态细胞， 然后在培养基中培养。 所述的携带pKD46质粒的BJ5183感受态细胞在制备过程中经 过L-阿拉伯糖诱导。 0007 优选的， 所述的提高AdEasy腺病毒载体系统重组效率的方法， 具

8、体包括如下步骤： 0008 (1)将pKD46质粒转化到BJ5183中， 获得含有pKD46质粒的BJ5183菌株， 利用L-阿拉 伯糖诱导其产生Red重组酶并且将其制备成感受态细胞。 0009 (2)将腺病毒载体pAdEasy与连接有目的基因的pAdtrack-CMV重组载体共转化步 骤(1)制备的感受态细胞， 热击、 冰浴后加入液体培养基先培养使细菌恢复正常生长状态并 且表达质粒编码的抗生素基因， 再涂布到含卡那霉素(Kan)的固体培养基培养去除pKD46质 说明书 1/5 页 3 CN 105950659 A 3 粒。 挑取固体培养基上生长的单菌落培养、 提取质粒得到重组腺病毒载体。 0

9、010 本发明利用pKD46质粒， 构建出含有Red重组系统的BJ5183菌株， 使得腺病毒载体 pAdEasy与pAdtrack-CMV的重组发生在能表达Red重组酶的菌体中， 在L-阿拉伯糖诱导的条 件下使其稳定地表达Red重组酶， 重组酶能促进同源基因序列完成重组， 大大提高了AdEasy 腺病毒载体系统的重组效率(产生的重组腺病毒载体的酶切鉴定阳性效率可以达到 100)， 为今后重组腺病毒载体构建提供了很大的方便。 附图说明 0011 图1是对照组1重组提取的重组腺病毒载体电泳图。 1-7是重组腺病毒载体 pAdeasy-GFP的质粒， 质粒大小全部正确； M是DL10000。 001

10、2 图2是PacI酶切鉴定对照1重组提取的重组腺病毒的电泳图。 1-7是PacI酶切重组 腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物， 阳性载体经酶切后只有3和7为阳性， 酶切鉴定阳性率 28.6； M是DL10000。 0013 图3是实验组1重组提取的重组腺病毒载体电泳图。 1-7是重组腺病毒载体 pAdeasy-GFP的质粒， 大小全部正确； M是DL15000。 0014 图4是PacI酶切鉴定实验组1重组提取的重组腺病毒载体的电泳图。 1-7是PacI酶 切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物； 阳性载体经酶切后全部为阳性重组子， 酶切鉴 定阳性率100； M是DL1500

11、0。 0015 图5是实验组2重组提取的重组腺病毒载体电泳图。 1-7是重组腺病毒载体 pAdeasy-GFP/DrsB2的质粒， 1、 2、 3、 4、 7质粒大小正确； M是DL15000。 0016 图6是PacI酶切鉴定实验组2重组提取的重组腺病毒载体的电泳图。 1-7是PacI酶 切重组腺病毒载体pAdeasy-GFP/DrsB2质粒的产物， 阳性载体经酶切后全部为阳性重组子， 酶切鉴定阳性率100； M是DL15000。 0017 图7是对照组2重组提取的重组腺病毒载体电泳图。 1-8是重组腺病毒载体 pAdeasy-GFP的质粒， 1、 2、 6质粒大小正确； M是DL15000

12、。 0018 图8是PacI酶切鉴定对照组2重组提取重组腺病毒载体的电泳图。 1-8是PacI酶切 重组腺病毒载体pAdeasy-GFP质粒的产物， 载体经酶切后2和3是阳性， 酶切鉴定阳性率 25； M是DL15000。 具体实施方式 0019 应用AdEasy腺病毒载体系统， 以往的方法是将pAdEasy-1质粒和线性化pAdtrack- CMV和共转化BJ5183感受态中， 或者将线性化pAdtrack-CMV转化到含有pAdEasy-1质粒的 BJ5183感受态中。 本发明是将线性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-1质粒共转化含有Red重组酶 的BJ5183感受态中。 002

13、0 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 0021 实施例1 0022 一、 携带pKD46质粒的BJ5183感受态细菌的制备 0023 (1)从平板挑取用普通转化方法获得的携带pKD46质粒的BJ5183菌株单菌落接种 到4mL含有Amp(终浓度25-50 g/mL)的SOB培养基中， 30、 220rpm， 振荡培养过夜。 说明书 2/5 页 4 CN 105950659 A 4 0024 (2)实验组感受态细胞： 取1mL(接种量12)培养物接种到装100mL含有Amp (终浓度25-50 g/mL)SOB培养基的250mL锥形瓶中， 30、 220r

14、pm， 先振荡培养1h， 然后加入 L-阿拉伯糖(终浓度0.2)诱导培养至OD6000.40.5。 对照组感受态细胞： 除不加入L-阿 拉伯糖诱导外， 其余操作同上。 0025 (3)在已灭菌的超净台中将培养好的菌液转移到2个已灭菌的50mL离心管中， 冰浴 30min。 0026 (4)4、 4100rpm离心10min。 在超净台中弃去上清液， 倒置在滤纸上使液体尽可能 流尽。 0027 (5)先分别用0.5mL冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打 混匀至菌液呈云雾状)， 再加CaCl2溶液至30mL混匀， 冰浴90min。 0028 (6)4、 4100rp

15、m离心10min。 在超净台中弃去上清液， 倒置在滤纸上使液体尽可能 流尽。 0029 (7)先分别用0.5mL冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮菌体(菌体朝上用手轻轻拍打 混匀至菌液呈云雾状)， 再加CaCl2溶液至30mL混匀， 冰浴60min。 0030 (8)4、 4100rpm离心10min。 在超净台中弃去上清液， 倒置在滤纸上使液体尽可能 流尽。 0031 (9)先分别用0.5mL冷的甘油CaCl2溶液(0.1mol/LCaCl2与甘油体积比85 15)悬浮 菌体(菌体朝上用手轻轻拍打混匀至菌液呈云雾状)， 再加甘油CaCl2溶液至2mL混匀， 分装 至已灭菌的1.5mLE

16、P管中(每管200 L)。 -70条件下可以长期保存使用。 0032 通过上述方法制备得到经L-阿拉伯糖诱导携带pKD46质粒的BJ5183感受态(实验 组)和未经L-阿拉伯糖诱导携带pKD46质粒的BJ5183感受态(对照组)。 0033 二、 pAdtrack-CMV质粒的线性化 0034 (1)可选方法A(本操作中使用方法A)： PmeI单酶切 0035 向已灭菌的微量离心管中， 依次加如下组分： pAdtrack-CMV或pAdTrack-CMV/ DrsB23-5 g， 10BBuffer5 L， PmeI(5U/ L)1 L， ddH2O加至50 L。 0036 可选方法B： Ec

17、oRI单酶切 0037 向已灭菌的微量离心管中， 依次加如下组分： pAdtrack-CMV或pAdTrack-CMV/ DrsB23-5 g， 10HBuffer5 L， EcoRI(15U/ L)0.5 L， ddH2O加至50 L。 0038 上述pAdTrack-CMV/DrsB2质粒的构建如下： 0039 DrsB2基因是根据其氨基酸序列设计两对引物使用重叠PCR拼接获得， 引物序列如 下： 0040 DrsB2( sense )： GGGGTACCATGGGCCTGTGGAGCAAGATCAAGGAGGTGG GCAAGGAGGCCGCCAAGGCCGCCGCCAAG； 0041

18、DrsB2( antisense )： GCTCTAGATCACACGGCCTCGCTCACGGCGCCCAGGG CGGCCTTGCCGGCGGCCTTGGCGGCGGCCTTG。 0042 (a)应用常规重叠PCR技术扩增目的基因。 0043 重叠叠PCR反应体系如下： 10buffer2 L， DrsB2(sense)2 L， DrsB2(antisense) 2 L， Taq酶0.2 L， ddH2O11.8 L。 0044 重叠PCR程序设定如下： 945min； 9430s， 6430s， 7230s， 35个循环； 72 说明书 3/5 页 5 CN 105950659 A 5

19、5min， 1615min。 0045 (b)用普通DNA回收试剂盒回收PCR产物， 分别对PCR产物和pAdTrack-CMV做双酶切 处理。 0046 双酶切体系如下： 10Tagonbuffer5 L， KpnI2 L， XbaI1L， PCR产物或 pAdTrack-CMV20 L， ddH2O22 L。 0047 (c)普通琼脂糖凝胶电泳后， 切取目标条带使用普通DNA回收试剂盒回收酶切产 物， 构建连接体系。 16恒温水浴槽连接过夜。 10 L连接产物全部转化到感受态DH5 中并第 二天挑取单克隆过夜培养， 提取质粒鉴定获得pAdTrack-CMV/DrsB2。 0048 连接体系

20、如下： 10T4连接buffer1 L， T4连接酶1 L， 酶切回收的pAdTrack7 L， 酶切回收的PCR产物1 L。 0049 (2)37温浴酶切4h。 0050 (3)酶切产物全部上样， 1琼脂糖凝胶电泳回收， 110V100mA。 0051 (4)用普通胶回收试剂盒回收， 加30 LElutionSolution， 线性化pAdtrack-CMV 浓度可以在50ng/ L以上。 提取步骤详见试剂盒说明书。 0052 三、 线性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-1质粒共转化 0053 (1)实验组1为取100ngpAdEasy-1和400-500ng线性化质粒pAdtra

21、ck-CMV在已灭 菌的微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10)共转化于100 L上述制备的 携带pKD46质粒的BJ5183感受态(实验组感受态)中， 冰浴30min。 0054 实验组2为取100ngpAdEasy-1和400-500ng线性化携带靶标基因BrsB2的载体质 粒pAdtrack-CMV/BrsB2在已灭菌的微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的 10)共转化于100 L上述制备的携带pKD46质粒的BJ5183感受态(实验组感受态)中， 冰浴 30min。 0055 对照组1为取100ngpAdEasy-1和400-500ng线性化质粒pAdtrac

22、k-CMV在已灭菌的 微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10)共转化于100 L用普通氯化钙法 制备的不携带pKD46的BJ5183感受态中， 冰浴30min。 0056 对照组2为取100ngpAdEasy-1和400-500ng线性化质粒pAdtrack-CMV在已灭菌的 微量EP管中混匀(混合质粒体积不超过感受态体积的10)共转化于100 L上述制备的不使 用阿拉伯糖诱导的对照组BJ5183感受态(对照组感受态)中， 冰浴30min。 0057 (2)42保温90s进行热击。 热击后迅速放入冰中， 冰浴10min。 0058 (3)加入900 LSOB培养基混匀后， 30振

23、荡(摇床转速不超过150rpm)培养60min， 使细菌恢复正常生长状态， 并且表达质粒编码的抗生素基因。 0059 (4)室温下5000rpm离心3min。 用移液枪小心吸去800 L上清液。 0060 (5)再将剩余菌液混匀后在含Kan(终浓度25 g/mL)的LB固体培养基的平板上全部 涂布， 静置12min。 在37的培养箱中倒置培养过夜(一般要培养16h)， 可以去除pKD46质 粒。 0061 (6)培养完成， 从平板上挑单菌落提质粒鉴定。 0062 四、 重组腺病毒载体的提取 0063 (1)随机挑取平板上若干个单菌落接种到5mL含Kan(终浓度25 g/mL)的LB液体培 养基

24、中， 37振荡培养过夜。 说明书 4/5 页 6 CN 105950659 A 6 0064 (2)将摇混浊的菌液在已灭菌的超净台中首先进行保菌， 取600 L菌液于已灭菌的 1.5mLEP管中加入400 L已灭菌的50甘油， -70冰箱冻存， 剩余菌液用于提质粒鉴定。 0065 (3)将剩余菌液分别富集到1.5mLEP管中， 8000rpm离心1min， 弃上清。 0066 (4)向菌体沉淀中加入150 L溶液I， 用移液枪吹打混匀或在旋涡混合器上剧烈振 荡， 使菌体充分悬浮。 0067 (5)加入200 L新配制的溶液II(呈澄清状， 使细胞裂解)， 温和上下颠倒46次EP 管以便使菌体充

25、分裂解， 直至形成透亮溶液。 0068 (6)加入200 L溶液III， 上下颠倒68次混匀， 切记不可振荡， 有白色絮状物产生， 静置3min。 4、 12000g离心10min。 将上清液小心吸至新的已灭菌的EP管中。 0069 (7)加入200 L(上清液的体积)苯酚/氯仿/异戊醇， 充分混匀， 室温下12000g离心 10min。 0070 (8)吸取上层水相转移到新的已灭菌的EP管中， 并加入2倍体积的预冷的无水乙醇 上下颠倒混匀。 4、 12000g离心10min， 弃上清。 0071 (9)加入1mL70预冷的乙醇上下颠倒混匀， 洗涤沉淀和去盐。 4、 12000g离心 10mi

26、n， 弃上清。 倒置于洁净的滤纸上， 让液体流尽， 沉淀物自然干燥， 然后加入30 LddH2O 和适量RNA酶溶解沉淀， 37温育20-30min。 0072 (10)提取的质粒通过0.8琼脂糖凝胶电泳鉴定， 结果见图1、 3、 5、 7。 图1为对照组 1： pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP， 从质粒大小判断， 全部正确， 可以进行 酶切鉴定； 图3为实验组1： pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP， 从质粒大小判 断， 全部正确， 可以进行酶切鉴定； 图5为实验组2： pAdTrack-CMV/DrsB2与p

27、AdEasy-1重组获 得pAdEasy-GFP/DrsB2， 从质粒大小判断， 1、 2、 3、 4、 7为正确质粒， 可以进行酶切鉴定； 图7为 对照组2： pAdTrack-CMV与pAdEasy-1重组获得pAdEasy-GFP， 从质粒大小判断， 全部正确， 可 以进行酶切鉴定。 0073 (11)选出疑似正确的质粒， 质量分子量应该大于36kbp， 用于酶切鉴定。 0074 五、 重组腺病毒载体的酶切鉴定 0075 (1)向已灭菌的微量离心管中， 依次加如下组分： 重组腺病毒载体3g， 10H Buffer2 L， PacI(10U/ L)0.2 L， ddH2O加至20 L。 0

28、076 (2)37酶切3h。 0077 (3)酶切产物通过1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 结果见图2、 4、 6、 8。 经PacI酶切后， 阳 性重组腺病毒载体会产生一个大片段大约30kb和一个小片段大约3kb或4.5kb。 图2为对照 组1： pAdEasy-GFP重组载体酶切， 从酶切小片段判断， 3和7是正确的， 酶切鉴定阳性率 28.6； 图4为实验组1： pAdEasy-GFP重组载体酶切， 从酶切小片段判断， 酶切鉴定阳性率 100； 图6为实验组2： pAdEasy-GFP/BrsB2重组载体酶切， 对1、 2、 3、 4、 7从酶切小片段判断， 酶切鉴定阳性率100； 图8为对照组2

29、： pAdEasy-GFP重组载体酶切， 从酶切小片段判断， 2和 3是正确的， 酶切鉴定阳性率25。 0078 (4)将含阳性重组腺病毒载体的菌株保菌， -70冻存。 0079 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 105950659 A 7 0001 序列表 1/1 页 8 CN 105950659 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 105950659 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 105950659 A 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 105950659 A 11 图7 图8 说明书附图 4/4 页 12 CN 105950659 A 12