技术领域
本发明涉及一种转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症的药物中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，简称G6PD 缺乏症）俗称蚕豆病，是世界上最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病。红细胞在成熟的过程中丧失了细胞核和核糖体，因而不能合成蛋白质，无法进行三羧酸循环。因此成熟的红细胞主要靠磷酸戊糖途径来提供能量。G6PD是磷酸戊糖代谢途径的限速酶。6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate，R5P）。NADPH对维持谷胱甘肽（glutathione,GSH）的还原状态从而保护红细胞免受氧化剂的损害极为重要。G6pd 基因突变导致G6PD 酶活性降低，会影响NADPH的产生。NADPH是机体多种物质合成代谢的供氢体，同时维持还原型谷胱甘肽（GSH 的还原状态） 的生成量。NADPH缺乏会减弱机体抗氧化剂（还原型谷胱甘肽GSH、过氧化氢H2O2）的抗氧化效果，使红细胞中的血红蛋白及红细胞膜在接触氧化性损伤时受到损害及发生溶血。目前全世界就G6PD 缺乏症发病的详细机制尚不清楚，有待进一步的研究探讨。常见临床表现包括新生儿黄疸、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和先天性非球形细胞溶血性贫血（CNSHA）等。现今，对G6PD 缺乏症的治疗措施主要为早期筛查，避免诱发因素等预防治疗措施。一旦经确诊后的病例给予服禁用药物，避免诱发因紊。高胆红素血症予以蓝光照射、碱化血液、输白蛋白、输血等对症治疗，以及相关辅助治疗。国内外仍未有特异性治疗G6PD 缺乏症的治疗措施。
Gata-1 是原始红系发育中的特异性的启动子，标记早期红系细胞。在24hpf,斑马鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-1-egfp 标记的红细胞随循环流动。48h 之后gata-1 表达逐渐减少。所以利用gata-1 作为驱动突变的g6pd 基因的启动子可以使突变型g6pd 基因在红细胞中特异性表达。从而实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。
目前并没有一种十分理想的动物实验模型可以很好的实现g6pd 基因的结构变化与功能之间关系的研究。
目前，世界已报道400多种G6PD缺乏生化型和160多种G6PD基因突变类型。G6PD基因突变具有以下特点：多为单个碱基置换的错义突变，尚未发现整个基因或大片段基因的缺失，也未见无义突变及移码突变。中国人群中至少鉴定出31种点突变。1388G-A、1376G-T、1024C-T、1004C-T、871G-A和95A-T为中国人最常见的g6pd基因突变类型，其累计基因频率超过了86%。通过蛋白质比较，本课题组发现，人和斑马鱼的蛋白具有很高的相似性（相似度88%）。A95T是中国一个比较常见的突变位点，通过对蛋白质三维结构（PDB ID: 2BHL)的学习，发现在第32号氨基酸附近存在着以下二级结构：32-37号氨基酸是β折叠的区域，38-40号氨基酸是β转角的区域，40号氨基酸是NADP+的结合位点，42-46号氨基酸是α螺旋的区域[19]。通过和人的G6PD蛋白序列的比对，拟敲除斑马鱼G6PD的第40-48位氨基酸，即对斑马鱼G6PD基因序列118-144位置制造突变，通过分子生物学技术将突变型g6pd基因装入特定载体中，利用显微注射技术将目的质粒导入斑马鱼体内，实现显性负性效应，进而建立G6PD缺乏症的斑马鱼模型，从而进一步研究斑马鱼中g6pd的突变对其G6PD酶活性的影响，G6PD的结构及功能的变化导致红细胞受损的详细机制。为人类G6PD缺乏症的详细机制及大规模高通量药物筛选提供基础。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是开发出由gata-1 启动子驱动的118-144位点突变g6pd基因与egfp基因的转基因斑马鱼模型，并提供该转基因斑马鱼模型的建立方法及该转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中的应用。
本发明首先提出了一种转基因斑马鱼模型，该模型是由红系细胞特异性启动子gata1驱动118-144位点缺失的突变g6pd基因，同时也是表达EGFP的可示踪的转基因斑马鱼模型。
这种由gata1启动子驱动g6pd突变基因与egfp基因表达的转基因斑马鱼模型的建立方法，包括以下步骤：
1）将g6pdM118-144-egfp-PCS2+，gata-1-PBSK-Isce I质粒酶切连接构建了gata1-g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I质粒。
2）将gata1-g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I质粒通过显微注射的方式注入1细胞期斑马鱼胚胎动物极胚盘内。
3）通过观察24hpf期胚胎是否表达绿色荧光筛选出转基因的胚胎并孵化养至成鱼作为F0代转基因斑马鱼。
4）以F0代转基因斑马鱼与野生型交配后产生的表达绿色荧光的胚胎孵化并养至成鱼作为F1代转基因斑马鱼。
5）通过观察胚胎EGFP荧光情况和基因组PCR 法鉴定转入的g6pdM118-144-egfp基因的表达和插入情况。
其中，步骤1）中的g6pd基因的突变位点是118-144位点，该位点是模拟人类G6PD缺乏症中95A-T突变所产生的效应。
进一步的，这种由gata-1 启动子驱动g6pdM118-144突变基因和EGFP基因的转基因斑马鱼模式的应用主要是：该模型是通过显性负效应建立的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（G6PDD）的斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中能可示踪的观察到药物处理过程中红细胞的变化。
相比于传统的G6PD缺乏症动物模型，本发明具有如下优点：
1.gata-1是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑马鱼的血液循环开始建立，利用gata-1 作为驱动突变的g6pd 基因的启动子可以使突变型g6pd 基因在红细胞中特异性表达。
2.gata1同时驱动g6pd与egfp基因，可实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。
3.斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼体内荧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的动物模型。
附图说明
图1是gata1-g6pdM118-144-egfp转基因斑马鱼胚胎F1代幼鱼荧光表达鉴定情况。
图1中：A-E分别是zgata1:g6pdM118-144-egfp发育至11.24.36.48.72小时的荧光图；F-J野生型斑马鱼对照；
图2是基因组PCR鉴定结果。
图2中：M:DNA mark 1.zgata1:g6pdM118-144-egfp 转基因系斑马鱼；2.WT；3.zgata1-egfp ；4.空白；
图3是全胚胎原位杂交检测egfp鉴定转基因模型构建情况。
图3中：A.zgata1:g6pdM118-144-egfp 转基因系斑马鱼；B.zgata1-egfp 转基因系斑马鱼；C. WT斑马鱼。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
本发明提供通过胚胎显微注射质粒得到转基因斑马鱼的方法，构建了gata1- g6pdM118-144-egfp-PBSK-Isce I质粒，将新构建的质粒与Isce I酶通过显微注射的方法一起注入斑马鱼1细胞期胚胎，达到gata1启动子驱动突变的g6pd基因与egfp基因特异性在红系细胞表达的效果。
其中，制备G6PD转基因斑马鱼模型的方法，包括如下步骤：
（1）运用重叠延伸定点诱变的方法制备突变型zg6pdM118-144基因：
A.通过和人的G6PD蛋白序列的比对，确定致变斑马鱼G6PD的第40-48位氨基酸。根据NCBI所提供的斑马鱼cDNA（NCBI Reference Sequence: XM_694076.5）序列，分别设计了两对引物，第一对引物的上游加入BamHⅠ酶切位点和保护碱基，第二对引物的下游加入EcoRⅠ酶切位点和保护碱基，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成：
第一对正向引物反向引物：
B. 制备斑马鱼cDNA：
分别收集野生型斑马鱼24、36、48、72、96hpf共5个时相的胚胎各10枚，将裂解液吸入1.5ml的Epp管中，室温5分钟，加入200µl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
12000g离心12min（4℃），将上清移入RNase Free的EPP管中，加入500µl异丙醇，充分混匀后，-20℃放置1h；
将EPP管取出，12000g离心10min（4℃），弃上清，向试管中加入1ml预冷的75%乙醇，充分混匀后，7500g离心5分钟（4℃），弃上清；
重复上一步；
室温晾干10min.
加入预热的10µl DEPC-H2O溶解RNA，55℃放置10min，使其完全溶解；
取1µl的总RNA样品，用2%凝胶电泳检测其完整性,电压5V/cm,时间15min，并用紫外分光光度计检测其纯度及浓度。
利用随机引物法将上述步骤制备所得的总RNA进行反转录，从而得到斑马鱼cDNA。
C. 采用第一对引物对和第二对引物分别以cDNA为模板进行PCR反应。分别将PCR产物跑凝胶电泳后割胶回收引物一和引物二的扩增片段。以回收的目的片段为模板，引物一的上游片段与引物二的下游片段为配对引物进行第三次PCR反应。切胶回收该次PCR产物即为zg6pdM118-144基因片段。
（2）zg6pdM118-144-pCS2+重组质粒的建立：
将zg6pdM118-144基因及pCS2+载体分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，双酶切后跑凝胶电泳回收开链酶切产物，采用如下体系对酶切产物进行连接，获得zg6pdM118-144-pCS2+重组质粒：
组分 体积（µl）
pCS 2+ 割胶回收产物（100ng/µl） 3
zg6pd M118-144割胶回收产物（200ng/µl） 5
10× T4 DNA Ligase Buffer 1
T4 DNA Ligase 1
总体积 10
（3）zgata1-pBSK重组质粒的构建：
将zgata1-pBSK及pBSKISCEⅠ进行双酶切，将zgata1启动子连接到pBSKISCEⅠ。
组分 体积（µl）
pBSK ISCE （100ng/µl） 3
zgata1（200ng/µl） 5
10× T4 DNA Ligase Buffer 1
T4 DNA Ligase 1
总体积 10
（4）zgata1:g6pdM118-144-egfp-pBSKISCEⅠ重组质粒的构建：
将zg6pdM118-144-egfp-pCS2+和zgata1-pBSKISCEⅠ用BamHI 和NotⅠ酶切，分别跑凝胶电泳切胶回收开链片段，将两种开链片段用以下体系连接，获得zgata1:g6pdM118-144-egfp-pBSKISCEⅠ重组质粒：
组分 体积（µl）
zgata1-pBSK ISCEⅠ 3
g6pd M118-144-egfp 5
10× T4 DNA Ligase Buffer 1
T4 DNA Ligase 1
总体积 10
（5）显微注射
取斑马鱼1细胞胚胎，采用如下体系用将zgata1:g6pdM118-144-egfp-pBSKISCEⅠ重组质粒注入斑马鱼1细胞胚胎内。
组分 体积（µl）
质粒（终浓度50ng/μl) 1μl
I-SceⅠ 酶 0.5μl
I-SceⅠbuffer 0.3μl
水 3.2μl
总体积 5μl
（6）转基因系斑马鱼的筛选：
A.将显微注射后的胚胎置于egg water中培养至24小时后，在荧光显微镜下挑出绿色胚胎进行培养。
B.转基因系斑马鱼的筛选
将培养至性成熟的斑马鱼作为F0代，与野生型的斑马鱼进行交配;将收获的胚胎置于egg water中培养至24小时，挑选出可以表达绿色荧光的胚胎作为F1代。同时将F0代斑马鱼进行编号;将F1代鱼培养至性成熟以后，进行自交。挑选出纯合子作为F2代;将F2代鱼培养至性成熟以后，进行自交。挑选出纯合子作为F3代。
(7) 转基因系斑马鱼的鉴定
A.EGFP绿色荧光蛋白观察鉴定：
按照常规方法将转入质粒的胚胎孵化出幼鱼并饲养至性成熟，然后将其和野生型斑马鱼交配，在荧光显微镜下挑选出可以表达绿色荧光蛋白的斑马鱼作为F1代。
B. PCR法鉴定：
收集出生后5天的阳性胚胎，同时以野生型和zgata1:egfp的斑马鱼做对照，提取基因组DNA，以如下体系进行PCR反应：
组份 体积（µl）
10× Buffer KOD -Plus- 5
2mM dNTPsTM 5
25mM MgSO4 4
10µmol/μl Primer g6pd上游 1
10µmol/μl Primer g6pd下游 1
基因组DNA 2
PCR grade water 31
KOD-Plus- (1.0U/µl) 1
总体积 50
C.原位杂交鉴定：
采用egfp探针对受精后25h转基因斑马鱼胚胎进行原位杂交，杂交过程如下：
甲醛梯度脱水：
加入1ml 25%甲醛/PBST，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 50%甲醛/PBST，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 75%甲醛/PBST，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 100%甲醛，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 100%甲醛，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 100%甲醛 -20℃保存。
原位杂交第一天再水化胚胎：
加入1ml 75%甲醛/PBST，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 50%甲醛/PBST，室温轻摇10min，弃废液；
加入1ml 25%甲醛/PBST，室温轻摇10min，弃废液；
清洗胚胎：用1×PBST清洗三遍，1×quick，1×5min，1×quick，室温下轻摇；
胚胎再固定：加入1ml 4%多聚甲醛/PBST，4℃轻摇1h后，于室温下轻摇20min；
清洗胚胎：用1×PBST清洗三遍，1×quick，1×5min，1×quick，室温轻摇，将胚胎移入RNase Free的EPP管中；
预杂交：向RNase Free的EPP管中加入1ml 68℃预热的HYB(-)液体，置于杂交炉中68℃轻摇15min；
杂交：用RNase Free枪头将HYB(-)液体弃掉，加入预热的HYB(+)溶液400µl/管，68℃杂交炉中轻摇1h，再加入带有Dig标记的egfp探针（使其终浓度为1ng/µl），68℃杂交炉轻摇过夜。
原位杂交第二天
洗涤胚胎：
2× 30min，2×SSCT/50%甲酰胺2ml，68℃杂交炉中轻摇；
1× 15min，2×SSCT 2ml，68℃杂交炉中轻摇；
2× 30min，0.2×SSCT 2ml，68℃杂交炉中轻摇，
将胚胎移至12孔板；
MABT洗涤3×5min，室温轻摇；
每孔加入2.5ml阻滞液，室温轻摇1h；
加入抗地高辛抗体（anti-Dig FAB antibody)，抗体终浓度为1:5000。将12孔板移入4℃，摇床上轻摇过夜。
原位杂交第三天
洗涤胚胎：
1× 30min，阻滞液2.5ml，室温轻摇；
1× 1h，MABT2ml，室温轻摇；
3× 5min，staining buffer（PH=9.5）2ml, 摇床上室温避光轻摇；1× 5min，0.1M Tris（PH=9.5）2ml, 室温避光轻摇；
染色：在0.1M Tris（PH=9.5）中，每2.5ml内加入Vector BCIP/NBT试剂盒中的solution 1 一滴，混匀，加入solution 2 一滴，混匀，加入solution 3一滴，充分混匀即成。将染液加入12孔板后，用铝箔包裹12孔板避光，室温下轻摇，每隔20min观察一次，直至染色成功；
终止染色：染色成功后，加入1×PBST 1ml洗涤，2×5min，室温轻摇；
固定：加入4%多聚甲醛/PBST固定液，4℃轻摇过夜；
保存：加入1ml 4%多聚甲醛/PBST固定液，4℃保存；
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。