技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种人造组织或器官，具体涉及一种生物型人工肝脏，及其制备方法和应用。
背景技术
肝脏移植是当前唯一能有效治疗肝衰竭的方法，但是器官短缺已经成为一个全球性的难题。长久以来，医疗行业投入了大量的资源进行研究以期解决移植器官不足的难题。由于我国不同原因导致的肝衰竭患者比较多，在目前供肝短缺，肝移植数量短期内难以增加的情况下，人工肝得到了快速的发展和广泛的应用。
人工肝是指借助体外机械、化学或生物性装置，暂时及部分替代肝脏功能，从而协助治疗肝功能不全、肝衰竭或相关疾病的方法。目前，现有技术中的人工肝根据其组成和性质分为三类：物理型、生物型和混合型。这些人工肝均可以通过过滤血液中有害物质为肝再生创造时间。但现有的人工肝还伴有一些生物安全问题，也限制了其应用。
近年来，3D打印成为全球瞩目的一项新兴技术。目前已经广泛应用于制造业，航天工业等领域。3D打印在生物医学领域的应用目前多以制造解剖模型、外科器械、植入体和假体为主，具体在肝脏外科的应用也主要是以制造用于辅助手术的非生物性肝脏模型为主。
3D生物打印技术的发展为活体组织打印及器官打印带来了希望和曙光。3D打印被誉为“第三次工业革命”的代表性技术，而3D生物打印是3D打印技术最前沿和最富生命力的研究领域。3D生物打印可定义为以特制生物打印机为主要手段，以加工活性材料包括细胞、生长因子、生物材料等为主要内容，以重建人体组织和器官为主要目标的跨学科和领域的新型再生医学工程技术。3D生物打印技术相比于其它组织工程支架快速成型技术具有不可比拟的优点：①构建复杂组织或器官的精度高，能真正实现细胞层面的组装和构建。作为构成人体的基本单元，细胞尺寸在几微米到几十微米的范围内，调控细胞分布的分辨率需在10μm以下，而采用传统组织工程技术难以实现如此小的分辨率。②可实现细胞与材料有机组合。3D打印能将组织器官中的不同细胞和组分进行一体化成型。③可以根据缺损组织或器官的实际情况进行即时、快速、可控的计算机三维模型再现，并通过临床影像采集数据进行三维重建。 再使用3D打印机制造出完全符合患者需要的产品。④个性化制造复杂组织器官，成本可控。就传统制造而言，产品结构越复杂，成本越高，生产数量越少，制造成本越高。而在3D打印中不存在这种问题，完全个性化的制造可以按需生产，打印复杂结构不增加额外成本。
目前尚未在公开出版物中见到3D生物打印人工肝组织的具体报道，本发明基于上述背景提出一种新的生物型人工肝脏。
发明内容
本发明的首要目的在于：提供一种近似活肝的生物型人工肝脏，具有优异的生物安全性和结构稳定性，而且具备全面有效的肝功能。
本发明的再一个目的在于：提供所述的生物型人工肝脏的制备方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
首先，提供一种生物型人工肝脏，它是由含有原代肝细胞或终末分化肝细胞(HepaRG)的细胞打印墨水与细胞支架材料一起三维细胞打印后，经过培养和诱导分化得到的具有固定空间构型的生物结构体。
本发明优选的方案中，所述的生物结构体内具有肝脏细胞团。
本发明进一步优选的方案中，所述的生物结构体内还具有胆管结构。
本发明优选的方案中，所述的细胞打印墨水进一步含有胶原；所述的胶原占细胞打印墨水的85～95％，进一步优选90％。
本发明优选的方案中，所述的细胞打印墨水中细胞浓度为0.8×106/ml～1.2×106/ml。
本发明优选的方案中，所述的细胞支架材料含有明胶和/或明胶衍生物。
本发明优选的方案中，所述的诱导分化使用不高于2％浓度的DMSO溶液。
在此基础上，本发明还提供一种制备所述的生物型人工肝脏的方法，包括以下步骤：
1)配制细胞打印墨水和细胞支架材料：
1.1)将按照常规方法培养好的原代肝细胞或终末分化肝细胞(HepaRG细胞)和胶原一起混合配制成悬浮液，调节细胞浓度在0.8×106/ml～1.2×106/ml，备用；
1.2)按常规方法配制含有明胶和/或明胶衍生物的细胞支架材料，备用；
2)三维细胞打印：
2.1)先将步骤1.2)配制的细胞支架材料经3D打印机按照预定图形文件打印至预设位置 形成所述结构体基底层；
2.2)将步骤1.1)配制的细胞打印墨水和步骤1.2)配制的细胞支架材料混合得到混合材料，混合材料中细胞浓度控制在0.8×105/ml～1.2×105/ml；将所述的混合材料使用3D打印机按照预定图形文件在步骤2.1)得到的基底层上逐层打印，直至完成整个打印过程得到预定结构，所述3D打印机的喷头直径控制在100～1000μm；
2.3)将步骤2.2)打印完成的结构使用0.5％～1％浓度的戊醛溶液浸泡2～5分钟完成固定；
3)培养及诱导分化
3.1)将步骤2.3)固定后的结构在培养液中培养至少7天，培养温度为35～37℃，培养环境CO2含量为4～6％，所述的培养液中含有8～15％的胎牛血清、0.2～0.8％的青霉素、0.2～0.8％的链霉素及余量的DMEM细胞培养基；
3.2)在步骤3.1)培养好的结构中加入浓度不高于2％的DMSO溶液进行诱导分化，诱导分化不超过7天；完成诱导分化即得到本发明所述的生物型人工肝脏结构体。
本发明优选的制备所述的生物型人工肝脏的方法中，步骤1.1)所述的悬浮液中，胶原占85～95％，更优选90％；控制细胞浓度在1×106/ml。
本发明优选的制备所述的生物型人工肝脏的方法中，步骤2)所述的打印，环境温度控制在18‐22℃，打印精度精确到50μm。
本发明优选的制备所述的生物型人工肝脏的方法中，步骤2.3)所述的固定，是使用0.5％浓度的戊醛溶液浸泡3分钟。
本发明优选的制备所述的生物型人工肝脏的方法中，步骤3)优选将步骤2.3)固定后的结构按照所述的条件培养7天并诱导分化7天。
本发明进一步优选的制备所述的生物型人工肝脏的方法中，步骤3.2)优选在步骤3.1)培养好的结构中加入浓度在0.5％～2％的DMSO溶液进行诱导分化。
与现有技术中的人工肝装置相比，本发明的人工肝脏是具有真正生物学意义的肝组织结构体，不论是结构还是功能都更加接近活肝组织。
现有技术中，理论上可用于3D打印肝组织的细胞有很多种，但是其打印后增殖及诱导分化的效果差别显著。本发明人经过反复验证和筛选，发现HepaRG细胞具有非常优异的细胞干性，而且在特定诱导分化条件下可以将其诱导成原代肝细胞和胆管上皮细胞。这种细胞在 本发明培养和诱导条件下的3D打印结构体中可以分化成原代肝细胞，同时伴随有胆管树的结构，使得分化后的结构体更加接近活肝组织结构特征。
在此基础上，本发明进一步优化了打印后的培养条件和诱导分化条件，选择了DMSO溶液作为诱导试剂，并经过大量的试验筛选和验证确定了DMSO溶液的浓度，这对本发明的诱导分化过程起到了关键作用。DMSO溶液是一种生物医学研究中常用的有机溶剂，具有一定的细胞毒性。但是低浓度的DMSO可以具有诱导干细胞分化的功能。发明人经过大量试验发现，在本发明所述3D打印的培养环境下，浓度不超过2％的DMSO溶液对于诱导结构体具有良好效果。其中，浓度接近1％的DMSO溶液诱导后结构体肝脏代谢功能较好，对药物代谢比较敏感；浓度接近2％的DMSO溶液诱导后结构体能产生较多的胆管树状结构。而浓度超过2％的DMSO溶液则具有一定的细胞毒性，不能有效诱导结构体内细胞的分化。
此外，本发明培养和诱导分化所采用的其他条件，包括培养和诱导分化时间的控制、培养条件的控制，以及培养液的组成等等，都是发明人经过大量反复试验筛选的优化的结果。
以上诸多方面的选择和优化，最终使得本发明的生物型人工肝脏结构体中肝细胞的存活率高达95％以上，分化后出现明显的肝样细胞，且肝细胞成团生长；各种代表肝细胞功能的蛋白在结构体中均表达明显；总体上结构体稳定性好、可重复性好、有肝功能。经实验验证，本发明的人工肝脏结构体在常规组织培养条件下能够持续至少8周结构不散、细胞不死。
目前，常规细胞培养是药物代谢研究的主要方法，但却并不准确。而本发明的经3D细胞打印和3D培养后得到的，具有固定空间构型、具有与活肝高度类似的组织结构及功能的结构体，经研究发现，其在药物的处理过程中可以激发出较传统细胞培养更强的代偿能力，因此对于药物代谢研究具有更高的应用价值。
因此，本发明还提供所述的生物型人工肝脏在药物代谢研究中作为模拟肝脏的应用。
附图说明
图1体现了本发明实施例1和实施例2的生物型人工肝脏的表观状态。
图2体现了本发明实施例1和实施例2的生物型人工肝脏的细胞分化结果。其中，A是实施例2所述加入0.5％浓度的DMSO诱导7天后结构体的微观表现；B是A的局部放大图；C是实施例1所述加入2％浓度的DMSO诱导7天后结构体的微观表现；D是C的局部放大图。
图3体现了本发明实施例1所述的生物型人工肝脏肝功能相关蛋白表达。其中，a体现 了白蛋白ALB的表达；b体现的是重组人细胞角蛋白CK18的表达；c体现的是肝细胞膜转运蛋白MRP2的表达；d体现的是细胞色素酶CYP3A4的表达；e体现的是紧密连接蛋白ZO‐1的表达。
图4体现了本发明实施例1所述的生物型人工肝脏中的胆管树结构。其中的a通过CK19/ZO‐1的表达，预示着胆管壁的结构；b通过ALB/MRP2的表达体现了肝细胞/胆管细胞精细结构。
图5体现了2D培养肝细胞和实施例2所述的生物型人工肝脏的肝功能指标的对比。
图6体现了利用本发明实施例2所述的生物型人工肝脏对扑热息痛进行肝脏代谢解毒实验的结果。
具体实施方式
以下通过实施例的方式详细阐述本发明，但本发明的思想并不局限于所列举的实施例。所列举实施例中所有使用的试剂、材料及器械均为现有产品。
实施例1
一种生物型人工肝脏，它是由含有HepaRG细胞的细胞打印墨水与细胞支架材料一起三维细胞打印后，经过培养和诱导分化得到的具有固定空间构型的生物结构体；具有肝脏细胞团和胆管结构。
上述生物型人工肝脏通过以下步骤制备：
1)配制细胞打印墨水和细胞支架材料：
1.1)HepaRG细胞购自Invitrogen公司，按说明书要求培养，悬浮至培养液中，离心，和胶原混合后配制成悬浮液，调整细胞浓度为1×106/ml，备用；
1.2)从天津绿岛公司购买细胞支架材料试剂盒，按说明书配制成含有明胶和/或明胶衍生物的细胞支架材料，备用；
2)三维细胞打印：
2.1)先将步骤1.2)配制的细胞支架材料经3D打印机按照预定图形文件打印至预设位置形成所述结构体基底层；环境温度控制在18℃
2.2)将步骤1.1)配制的细胞打印墨水和步骤1.2)配制的细胞支架材料混合得到混合材料，混合材料中细胞浓度控制在1×105/ml；将所述的混合材料使用3D打印机按照预定图形 文件在步骤2.1)得到的基底层上逐层打印，直至完成整个打印过程得到预定结构，所述3D打印机的喷头直径控制在500μm；环境温度控制在18℃，打印精度精确到50μm。
2.3)将步骤2.2)打印完成的结构使用0.5％浓度的戊醛溶液浸泡3分钟完成固定；
3)培养及诱导分化
3.1)将步骤2.3)固定后的结构在培养液中培养7天，培养温度为37℃，培养环境CO2含量为5％，所述的培养液中含有10％的胎牛血清、0.5％的青霉素和0.5％的链霉素及余量的DMEM细胞培养基；
3.2)在步骤3.1)培养好的结构中加入浓度为2％的DMSO溶液进行诱导分化，诱导分化7天；完成诱导分化即得到本发明所述的生物型人工肝脏结构体。
本实施例制备的生物型人工肝脏表观如图1所示，通过免疫荧光染色法观察白蛋白分泌、肝细胞功能相关蛋白表达、以及胆管细胞相关蛋白表达，可见该结构体中的以下结构特征：
如图2中B、D所示，肝细胞呈现出类似组织结构的抱团样生长；而且如图3所示，代表肝细胞功能的蛋白在结构体中表达明显：ALB的存在，说明这种培养的细胞具有分泌功能；CK18是重组人细胞角蛋白18，它是肝脏细胞中主要的结构蛋白；MRP2是肝细胞膜转运蛋白，其存在说明肝脏细胞具有膜转运功能；CYP3A4是人体一种主要的药物代谢酶，其存在说明此类细胞存在药物代谢的能力；ZO‐1为紧密连接蛋白，常被用来观察各种组织结构紧密连接屏障功能和通透功能的指标。
此外，如图4所示，一些蛋白的表达可能预示着细胞在结构体中可以分化并呈现出胆管结构：图4a体现的是CK19/ZO‐1的表达，CK19是重组人细胞角蛋白19，多表达在管状上皮细胞中；ZO‐1为紧密连接蛋白，常被用来观察各种组织结构紧密连接屏障功能和通透功能的指标；这两种蛋白的表达意味着树状胆管网络形成，可能预示着胆管结构的存在；图4b体现的是ALB/MRP2的表达，可以看到肝细胞/胆管细胞精细结构。
实施例2
一种生物型人工肝脏，它是由含有人原代肝细胞的细胞打印墨水与细胞支架材料一起三维细胞打印后，经过培养和诱导分化得到的具有固定空间构型的生物结构体；具有肝脏细胞团和胆管结构。
上述生物型人工肝脏通过以下步骤制备：
2)配制细胞打印墨水和细胞支架材料：
1.1)利用肝切除手术时产生的废弃肝脏组织，使用胶原酶灌注后，消化获得人原代肝细胞，在培养皿中培养1天，离心，和胶原混合后配制成悬浮液，调整细胞浓度为0.8×106/ml，备用；
1.2)从天津绿岛公司购买细胞支架材料试剂盒，按说明书配制成含有明胶和/或明胶衍生物的细胞支架材料，备用；
2)三维细胞打印：
2.1)先将步骤1.2)配制的细胞支架材料经3D打印机按照预定图形文件打印至预设位置形成所述结构体基底层；环境温度控制在20℃
2.2)将步骤1.1)配制的细胞打印墨水和步骤1.2)配制的细胞支架材料混合得到混合材料，混合材料中细胞浓度控制在0.8×105/ml；将所述的混合材料使用3D打印机按照预定图形文件在步骤2.1)得到的基底层上逐层打印，直至完成整个打印过程得到预定结构，所述3D打印机的喷头直径控制在800μm；环境温度控制在20℃，打印精度精确到50μm。
2.3)将步骤2.2)打印完成的结构使用0.5％浓度的戊醛溶液浸泡5分钟完成固定；
3)培养及诱导分化
3.1)将步骤2.3)固定后的结构在培养液中培养8天，培养温度为37℃，培养环境CO2含量为5％，所述的培养液中含有12％的胎牛血清、0.2％的青霉素和0.8％的链霉素及余量的DMEM细胞培养基；
3.2)在步骤3.1)培养好的结构中加入浓度为0.5％的DMSO溶液进行诱导分化，诱导分化7天；完成诱导分化即得到本发明所述的生物型人工肝脏结构体。
本实施例制备的生物型人工肝脏表观及微观结构特征与实施例1相似。观察其微观结构，如图2中A、C所示，肝细胞呈现出类似组织结构的抱团样生长。
对本实施例所述的生物型人工肝脏进行如下体外实验检测：
1.肝功能检测：
将实施例2制备的结构体按照常规组织培养方法培养不同的时间后，分别检测其肝脏功能，包括：
1.1通过免疫荧光染色法观察白蛋白分泌，肝细胞功能相关蛋白表达，胆管细胞相关蛋白 (观察结果与实施例1相近)；
1.2以常规2D培养的肝细胞为对照细胞，采用ELISA法，分别检测2D培养的肝细胞(图中以*标记)和实施例2经3D打印并诱导分化得到的结构体(图中无*标记)在相同的培养液中培养相同时间后，培养液上清液中ALB，AST，Fe的含量；同时采用promega公司的试剂盒检测上清液中多种CYP同工酶的酶活性；结果如下：
如图5所示，各图中横坐标均为诱导完成后的培养时间，随着培养时间的延长，细胞在实施例2结构体中能维持一定的ALB分泌功能和CYP3A4酶活性，且细胞损伤少于对照细胞(因为AST和Fe较低，说明细胞破损少)。诱导完成后1天，对照细胞和实施例2结构体培养液上清中AST，Fe，ALB和CYP3A4活性的水平没有显著性差异。诱导完成7天后，实施例2结构体培养液AST浓度23±7U/L，低于对照细胞的27±6U/L，说明实施例2结构体肝细胞损伤较小，而在诱导完成14天后，这一差异更加显著，实施例2结构体培养液AST浓度24±6U/L，低于对照细胞的38±11U/L。对照细胞和实施例2结构体培养液上清中的Fe含量也呈现这种趋势，诱导完成7天后，实施例2结构体培养液Fe浓度8±3U/L，低于对照细胞的16±6U/L；诱导完成14天后，实施例2结构体培养液Fe浓度6±2U/L，低于对照细胞的17±8U/L，且有显著性差异。实施例2的结构体分泌ALB的能力远高于对照细胞，在诱导完成7天后，实施例2结构体的上清液中ALB浓度为43±15g/L，是对照细胞上清液中ALB浓度中的两倍；而在诱导完成14天后，实施例2结构体培养液上清中ALB浓度达到对照细胞培养液上清中的3.7倍(44±21g/L vs 12±4g/L)。在诱导完成7天后，实施例2结构体的上清液中CYP3A4活性为3043±343，而对照细胞为1651±273。诱导完成14天后，实施例2结构体的培养液上清液中CYP3A4活性为1951±287，是对照细胞的3倍。
2.药物代谢研究：
取本发明实施例2方法得到的生物型人工肝脏结构体，分别在培养液中加入生理盐水(空白对照Blank control)和600μmol/L的扑热息痛(APAP)，作用相同时间后检测各组活细胞数量、细胞增殖情况、多种CYP酶活性及蛋白和mRNA表达量，结果如图6显示，本发明实施例2制备的人工肝结构体培养液中加入扑热息痛后，CYP3A4酶的活性(2136±102vs2956±387)及蛋白表达(0.890±0.69vs 10.9±7.70)明显增高，说明本发明的人工肝结构体在药物代谢中可以激发出很强的代偿能力。