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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610295590.4 (22)申请日 2016.05.06 (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区上下店 路15号 (72)发明人 赵超杨成凤刘斌陈明军 陈玉青 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12P 19/14(2006.01) C12P 19/12(2006.01) C12P 19/04(2006.01) C12P 19/00(2006.01) C07H 3/06。
2、(2006.01) C07H 1/06(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 一种泡叶藻寡糖的制备方法及其在降血糖 药物中的应用 (57)摘要 本发明提供了一种泡叶藻寡糖的制备方法 及其在降血糖药物中的应用。 该工艺流程特征在 于以脱脂、 除蛋白及色素的泡叶藻岩藻多糖为原 料， 联合微波辅助处理， 添加果胶酶、 纤维素酶、 岩藻多糖酶和硫酸酯酶以酶解岩藻多糖， 经乙醇 沉降去除未充分降解岩藻多糖及酶蛋白， 离心上 清液经蒸馏浓缩与提取多糖过程中产生的寡糖 合并后过分子筛， 截留物冷冻干燥制备得到泡叶 藻寡糖， 过程中所用乙醇回收循环利用。 经体外 及细胞试验。
3、， 本发明中制备的泡叶藻活性寡糖对 糖代谢具有显著的改善作用。 本发明提供了一套 绿色高效、 环境友好的利用微波辅助酶解制备泡 叶藻活性寡糖的工艺方法。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 105861593 A 2016.08.17 CN 105861593 A 1.一种泡叶藻寡糖的制备方法， 其特征在于， 具体步骤如下： （1） 泡叶藻干燥粉碎后， 向泡叶藻干粉中加入体积浓度95%乙醇回流提取1-2h， 泡叶藻干粉与乙醇溶液重量比为1: 15-20， 回流提取结束后回收乙醇备用， 烘干得到干燥脱脂的泡叶藻粉末； （2） 向步骤 （1） 得到的泡叶藻粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粉末。
4、与蒸馏水重量比为1: 25-30， 浸泡0.5-1h， 500-800W微波辐照1-2min， 冷却后， 重复辐照2-3次， 提取结束后， 进 行过滤， 将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取， 将获得的滤液混合后浓缩至原体积的1/4-1/ 3， 加入3-4倍体积的步骤 （1） 所回收乙醇， 4-10静置沉淀8-10h， 3000rpm离心15-20min 收集沉淀物， 沉淀物真空冷冻干燥后粉碎， 得到泡叶藻粗岩藻多糖粉末； 离心后上清液经旋 转蒸发回收乙醇， 上清浓缩后保存备用； （3） 向步骤 （2） 所得泡叶藻粗岩藻多糖粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粗岩藻多糖粉末 与蒸馏水重量比为1:10-。
5、20， 进行搅拌复溶， 用Sevag法、 三氟三氯乙烷法、 三氯乙酸法中一 种或几种除蛋白5-8次得多糖提取液； （4） AB-8树脂经活化后湿法装入1.660cm层析柱中， 蒸馏水平衡， 以1.0mL/min的流 速连续通过步骤 （3） 多糖提取液， 分管收集， 重复处理3-5次后得多糖精提液； （5） 步骤 （4） 的多糖精提液经截留分子量8000-14000规格透析袋透析得截留液， 截留液 在50-60及转速为20-40r/min条件下旋转蒸发， 浓缩至膏状并真空冷冻干燥， 得到泡叶 藻精岩藻多糖粉末； （6） 将步骤 （5） 中所得泡叶藻精岩藻多糖粉末用蒸馏水溶解， 质量浓度为4-10。
6、%， 利用 500-800W微波辐照2-3min， 冷却后， 重复辐照1-2次； 调节pH为6.5-7.8， 加入硫酸酯酶后 置于32-40， 速度为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1.0h后取出， 沸水加热5-10min以 灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心5-10min取上清液； （7） 将步骤 （6） 离心所得上清液调节pH为5.5-6.0， 加入岩藻多糖酶后置于35-50， 速 度为65-90r/min水浴摇床中酶解1-1.2h后取出， 沸水加热5-10min以灭酶活， 冷却至室 温， 3000rpm离心5-10min取上清液； （8） 将步骤 （7） 离心所得上清液。
7、调节pH为4.5-5.0， 加入纤维素酶后置于50-60， 速度 为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1.0h后取出， 沸水加热10-15min以灭酶活， 冷却至室 温， 3000rpm离心5-10min取上清液； （9） 将步骤 （8） 离心所得上清液调节pH为3.0-4.5， 加入果胶酶后置于45-50， 速度为 65-90r/min水浴摇床中酶解10-20min后取出， 沸水加热10-15min以灭酶活， 冷却至室 温， 3000rpm离心5-10min取上清液备用； （10） 向步骤 （9） 中上清液加入等体积的浓度95%乙醇沉降去除蛋白， 4-8静置沉淀 0.5-2.0h后，。
8、 离心收集上清并在50-60及转速为20-40r/min条件下旋转蒸发除去乙醇； （11） 向步骤 （10） 除乙醇后的上清液中加入体积比1:3-4的体积浓度95%乙醇沉降除去 未充分降解岩藻多糖， 4-10静置沉淀4-6h后， 离心收集上清并在50-60及转速为20-40 r/min条件下旋转蒸发回收乙醇， 即得泡叶藻寡糖粗品溶液； （12） 将步骤 （2） 中上清浓缩液和步骤 （11） 中泡叶藻寡糖粗品溶液混合， 通过3000D超滤 膜， 滤出液再通过500D的分子筛， 将截留物进行冷冻干燥， 制备得泡叶藻寡糖。 2.根据权利要求1所述的一种泡叶藻寡糖的制备方法， 其特征在于， 所述果胶酶。
9、、 纤维 素酶、 岩藻多糖酶和硫酸酯酶与步骤 （6） 泡叶藻精岩藻多糖粉末质量比分别为1:45-60、 1: 权利要求书 1/2 页 2 CN 105861593 A 2 100-130、 1:45-62、 1:220-350。 3.如权利要求1所述的一种泡叶藻寡糖的制备方法制得的泡叶藻寡糖。 4.如权利要求3所述的泡叶藻寡糖在制备降血糖药物中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105861593 A 3 一种泡叶藻寡糖的制备方法及其在降血糖药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于功能性低聚糖酶解法生产工艺， 涉及一种微波辅助分步酶解法制备泡 叶藻寡糖方法及其在降血糖中的应用。 背。
10、景技术 0002 泡叶藻岩藻聚糖是一种含硫酸基团的水溶性杂多糖， 主要由硫酸基岩藻糖以及少 量的半乳糖、 甘露糖、 木糖、 阿拉伯糖、 糖醛酸等组成， 又被称为褐藻糖胶、 褐藻岩藻多糖硫 酸酯， 其主要有效成份是 -L-岩藻糖-4-硫酸酯。 泡叶藻寡糖具有多种生物功能， 在药物、 保 健品、 食品等方面用途广泛。 与多糖相比， 寡糖具有易溶于水、 无抗原性， 以及在宿主体内具 有较弱的积累效应等优点。 但在规模化应用上受到很大的限制， 对寡糖制备技术的研究尚 不够深入。 0003 微波具有强大的穿透能力， 细胞经微波处理会吸收能量， 细胞内部的高温高压会 使岩藻多糖糖苷键断裂并改变分子聚合度，。
11、 从而提高了寡糖的产量。 该方法结合酶解法， 具 有操作方便、 提取时间短、 效率高、 无污染、 节约能源等优点。 0004 在目前所公开的海藻寡糖相关专利中， CN102827899B公开了一种龙须菜琼胶寡糖 及其制备方法， 制得寡糖可用于制备抗氧化、 抗紫外线保健品和化妆品； CN103333876B公开 了一种可与唾液淀粉酶的激活剂 （氯离子） 协同增强唾液淀粉酶活性的琼胶寡糖的制备方 法； CN103288978B公开了一种岩藻聚糖硫酸酯的制备方法， 此岩藻聚糖硫酸酯对 -糖苷酶 具有抑制作用， 可用于制备具有抗糖尿病作用的 -糖苷酶抑制剂。 CN100508985C公开了一 种低分子。
12、量褐藻胶寡糖及其在糖尿病防治方面的应用， 该专利所述低分子量褐藻胶寡糖是 利用酸水解海藻酸钠制得， 而本发明中所述泡叶藻寡糖为利用微波辅助酶解的绿色制备方 法制备， 具有无副反应、 条件温和、 环境友好、 节约能耗等优点。 因此， 本发明中通过微波辅 助分步酶解制备具有降血糖活性的泡叶藻寡糖均未见其它研究报道或专利。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种制备泡叶藻寡糖的方法。 制备工艺路线简单合理、 绿色 高效， 是一种制备泡叶藻活性寡糖的有效方法。 0006 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 一种泡叶藻寡糖的制备方法， 具体步骤如下： （1） 泡叶藻干燥粉碎后， 向泡叶藻干粉。
13、中 加入体积浓度95%乙醇回流提取1-2h， 泡叶藻干粉与乙醇溶液重量比为1:15-20， 回流提取 结束后回收乙醇， 烘干得到干燥脱脂的泡叶藻粉末； （2） 向步骤 （1） 得到的泡叶藻粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粉末与蒸馏水重量比为1: 25-30， 浸泡0.5-1h， 500-800W微波辐照1-2min， 冷却后， 重复辐照2-3次， 提取结束后， 进 行过滤， 将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取， 将获得的滤液混合后浓缩至原体积的1/4-1/ 3， 加入3-4倍体积步骤 （1） 所回收乙醇， 4-10静置沉淀8-10h， 3000rpm离心15-20min收 集沉淀物， 沉淀物真空。
14、冷冻干燥后粉碎， 得到泡叶藻粗岩藻多糖粉末； 离心后上清液经旋转 说明书 1/7 页 4 CN 105861593 A 4 蒸发回收乙醇， 上清浓缩后保存备用； （3） 向步骤 （2） 所得泡叶藻粗岩藻多糖粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粗岩藻多糖粉末 与蒸馏水重量比为1:10-20， 进行搅拌复溶， 用Sevag法、 三氟三氯乙烷法、 三氯乙酸法中一 种或几种除蛋白5-8次得多糖提取液； （4） AB-8树脂经活化后湿法装入1.660cm层析柱中， 蒸馏水平衡， 以1.0mL/min的流 速连续通过步骤 （3） 多糖提取液， 分管收集， 重复处理3-5次后得多糖精提液； （5） 步骤 （4） 。
15、的多糖精提液经截留分子量8000-14000规格透析袋透析得截留液， 截留液 在50-60及转速为20-40r/min条件下旋转蒸发， 浓缩至膏状并真空冷冻干燥， 得到泡叶 藻精岩藻多糖粉末； （6） 将步骤 （5） 中所得泡叶藻精岩藻多糖粉末用蒸馏水溶解， 质量浓度为4-10%， 利用 500-800W微波辐照2-3min， 冷却后， 重复辐照1-2次； 调节pH为6.5-7.8， 加入硫酸酯酶后 置于32-40， 速度为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1.0h后取出， 沸水加热5-10min以 灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心5-10min取上清液； （7） 将步骤 （。
16、6） 离心所得上清液调节pH为5.5-6.0， 加入岩藻多糖酶后置于35-50， 速 度为65-90r/min水浴摇床中酶解1-1.2h后取出， 沸水加热5-10min以灭酶活， 冷却至室 温， 3000rpm离心5-10min取上清液； （8） 将步骤 （7） 离心所得上清液调节pH为4.5-5.0， 加入纤维素酶后置于50-60， 速度 为65-90r/min水浴摇床中酶解0.5-1.0h后取出， 沸水加热10-15min以灭酶活， 冷却至室 温， 3000rpm离心5-10min取上清液； （9） 将步骤 （8） 离心所得上清液调节pH为3.0-4.5， 加入果胶酶后置于45-50， 速。
17、度为 65-90r/min水浴摇床中酶解10-20min后取出， 沸水加热10-15min以灭酶活， 冷却至室 温， 3000rpm离心5-10min取上清液备用； （10） 向步骤 （9） 中上清液加入等体积的浓度95%乙醇沉降去除蛋白， 4-8静置沉淀 0.5-2.0h后， 离心收集上清并在50-60及转速为20-40r/min条件下旋转蒸发除去乙醇； （11） 向步骤 （10） 除乙醇后的上清液中加入体积比1:3-4的体积浓度95%乙醇沉降除去 未充分降解岩藻多糖， 4-10静置沉淀4-6h后， 离心收集上清并在50-60及转速为20-40 r/min条件下旋转蒸发除去乙醇， 即得泡叶藻。
18、寡糖粗品溶液； （12） 将步骤 （2） 中上清浓缩液和步骤 （11） 中泡叶藻寡糖粗品溶液混合， 通过3000D超滤 膜， 滤出液再通过500D的分子筛， 将截留物进行冷冻干燥， 制备得泡叶藻寡糖。 0007 所述果胶酶、 纤维素酶、 岩藻多糖酶和硫酸酯酶与步骤 （6） 泡叶藻精岩藻多糖粉末 质量比分别为1:45-60、 1:100-130、 1:45-62、 1:220-350。 0008 一种泡叶藻寡糖的制备方法制得的泡叶藻寡糖。 0009 泡叶藻寡糖在制备降血糖药物中的应用。 0010 本发明的优势在于： （1） 采用微波辅助分步酶解法， 依次利用果胶酶、 纤维素酶、 岩藻多糖酶和硫酸。
19、酯酶处 理泡叶藻岩藻多糖， 可多位点酶切泡叶藻岩藻多糖复杂键合结构， 大幅提高酶解效率并降 低酶用量， 同时回收了提取多糖过程中产生的寡糖， 生产过程中乙醇重复循环利用， 具有操 作方便、 提取时间短、 效率高、 无污染的优点。 0011 （2） 制备的泡叶藻活性寡糖对 -葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性， 其IC50值为 说明书 2/7 页 5 CN 105861593 A 5 4.82mg/mL， 且呈现剂量依赖性， 同时， 对胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢具有明显的改善 作用。 附图说明 0012 图1泡叶藻寡糖对 -葡萄糖苷酶活性的影响。 0013 实施例1 一种泡叶藻寡糖的制备方法， 。
20、具体步骤如下： （1） 泡叶藻干燥粉碎后， 向泡叶藻干粉中 加入体积浓度95%乙醇回流提取1h， 泡叶藻干粉与乙醇溶液重量比为1:15， 回流提取结束后 回收乙醇， 烘干得到干燥脱脂的泡叶藻粉末； （2） 向步骤 （1） 得到的泡叶藻粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粉末与蒸馏水重量比为1: 25， 浸泡0.5h， 500W微波辐照1min， 冷却后， 重复辐照2次， 提取结束后， 进行过滤， 将滤渣 重复上述步骤进行2次提取， 将获得的滤液混合后进行浓缩至原体积的1/4， 加入3倍体积步 骤 （1） 所回收乙醇， 4静置沉淀8h， 3000rpm离心15min收集沉淀物， 沉淀物真空冷冻干 燥后。
21、粉碎， 得到泡叶藻粗岩藻多糖粉末。 离心后上清液经旋转蒸发回收乙醇， 上清浓缩液保 存备用； （3） 向步骤 （2） 所得泡叶藻粗岩藻多糖粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粗岩藻多糖粉末 与蒸馏水重量比为1:10， 进行搅拌复溶。 用Sevag法除蛋白5次得多糖提取液； （4） AB-8树脂经活化后湿法装入1.660cm层析柱中， 蒸馏水平衡， 以1.0mL/min的流 速连续通过步骤 （3） 多糖提取液， 分管收集， 重复处理3次后得多糖精提液； （5） 步骤 （4） 的多糖精提液经截留分子量8000规格透析袋透析得截留液， 截留液在50 及转速为20r/min条件下旋转蒸发， 浓缩至膏状并真空。
22、冷冻干燥， 得到泡叶藻精岩藻多糖 粉末； （6） 将步骤 （5） 中所得泡叶藻精岩藻多糖粉末用蒸馏水溶解， 质量浓度为4%， 利用500W 微波辐照2min， 冷却后， 重复辐照1次。 调节pH为6.5， 加入硫酸酯酶后置于32， 速度为65 r/min水浴摇床中酶解0.5h后取出， 沸水加热5min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心 5min取上清液； （7） 将步骤 （6） 离心所得上清液调节pH为5.5， 加入岩藻多糖酶后置于35， 速度为65 r/min水浴摇床中酶解1h后取出， 沸水加热5min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心 5min取上清液； （8） 将步骤。
23、 （7） 离心所得上清液调节pH为4.5， 加入纤维素酶后置于50， 速度为65r/ min水浴摇床中酶解0.5h后取出， 沸水加热10min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心5 min取上清液； （9） 将步骤 （8） 离心所得上清液调节pH为3.0， 加入果胶酶后置于45， 速度为65r/min 水浴摇床中酶解10min后取出， 沸水加热10min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心5min 取上清液备用； （10） 向步骤 （9） 中上清液加入等体积的浓度95%乙醇沉降去除蛋白， 4静置沉淀0.5h 后， 离心收集上清并在55及转速为20r/min条件下旋转蒸发除去乙醇。
24、； （11） 向步骤 （10） 除乙醇后的上清液中加入体积比1:3的体积浓度95%乙醇沉降除去未 充分降解岩藻多糖， 4静置沉淀4h后， 离心收集上清并在55及转速为20r/min条件下旋 说明书 3/7 页 6 CN 105861593 A 6 转蒸发回收乙醇， 即得泡叶藻寡糖粗品溶液； （12） 将步骤 （2） 中上清浓缩液和步骤 （11） 中泡叶藻寡糖粗品溶液混合， 通过3000D分子 筛， 滤出液再通过500D的分子筛， 将截留物进行冷冻干燥， 制备得泡叶藻寡糖。 0014 所述果胶酶、 纤维素酶、 岩藻多糖酶和硫酸酯酶与步骤 （6） 泡叶藻精岩藻多糖粉末 质量比分别为1:45、 1:。
25、100、 1:45、 1:220。 0015 一种泡叶藻寡糖的制备方法制得的泡叶藻寡糖。 0016 泡叶藻寡糖在制备降血糖药物中的应用。 0017 实施例2 一种泡叶藻寡糖的制备方法， 具体步骤如下： （1） 泡叶藻干燥粉碎后， 向泡叶藻干粉中 加入体积浓度95%乙醇回流提取1h， 泡叶藻干粉与乙醇溶液重量比为1:18， 回流结束后除去 乙醇， 烘干得到干燥脱脂的泡叶藻粉末； （2） 向步骤 （1） 得到的泡叶藻粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粉末与蒸馏水重量比为1: 28， 浸泡0.8h， 700W微波辐照2min， 冷却后， 重复辐照2次， 提取结束后， 进行过滤， 将滤渣 重复上述步骤进行。
26、2次提取， 将获得的滤液混合后进行浓缩至原体积的1/4， 加入4倍体积步 骤 （1） 所回收乙醇， 6静置沉淀9h， 3000rpm离心18min收集沉淀物， 沉淀物真空冷冻干 燥后粉碎， 得到泡叶藻粗岩藻多糖粉末； 离心后上清液经旋转蒸发回收乙醇， 上清浓缩后保 存备用； （3） 向步骤 （2） 所得泡叶藻粗岩藻多糖粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粗岩藻多糖粉末 与蒸馏水重量比为1:15， 进行搅拌复溶。 用三氟三氯乙烷法除蛋白6次得多糖提取液； （4） AB-8树脂经活化后湿法装入1.660cm层析柱中， 蒸馏水平衡， 以1.0mL/min的流 速连续通过步骤 （3） 多糖提取液， 分管收集。
27、， 重复处理4次后得多糖精提液； （5） 步骤 （4） 的多糖精提液经截留分子量10000规格透析袋透析得截留液， 截留液在55 及转速为30r/min条件下旋转蒸发， 浓缩至膏状并真空冷冻干燥， 得到泡叶藻精岩藻多 糖粉末； （6） 将步骤 （5） 中所得泡叶藻精岩藻多糖粉末用蒸馏水溶解， 质量浓度为8%， 利用700W 微波辐照3min， 冷却后， 重复辐照2次。 调节pH为7.0， 加入硫酸酯酶后置于35， 速度为80 r/min水浴摇床中酶解1.0h后取出， 沸水加热8min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心 8min取上清液； （7） 将步骤 （6） 离心所得上清液调节pH。
28、为6.0， 加入岩藻多糖酶后置于40， 速度为70 r/min水浴摇床中酶解1.1h后取出， 沸水加热8min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心 8min取上清液； （8） 将步骤 （7） 离心所得上清液调节pH为5.0， 加入纤维素酶后置于55， 速度为80r/ min水浴摇床中酶解1.0h后取出， 沸水加热15min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心8 min取上清液； （9） 将步骤 （8） 离心所得上清液调节pH为4.0， 加入果胶酶后置于48， 速度为70r/min 水浴摇床中酶解15min后取出， 沸水加热12min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心8。
29、min 取上清液备用； （10） 向步骤 （9） 中上清液加入等体积的浓度95%乙醇沉降去除蛋白， 6静置沉淀1.0h 后， 离心收集上清并在60及转速为30r/min条件下旋转蒸发除去乙醇； 说明书 4/7 页 7 CN 105861593 A 7 （11） 向步骤 （10） 除乙醇后的上清液中加入体积比1:3的体积浓度95%乙醇沉降除去未 充分降解岩藻多糖， 6静置沉淀5h后， 离心收集上清并在60及转速为30r/min条件下旋 转蒸发回收乙醇， 即得泡叶藻寡糖粗品溶液； （12） 将步骤 （2） 中上清浓缩液和步骤 （11） 中泡叶藻寡糖粗品溶液混合， 通过3000D超滤 膜， 滤出液再。
30、通过500D的分子筛， 将截留物进行冷冻干燥， 制备得泡叶藻寡糖。 0018 所述果胶酶、 纤维素酶、 岩藻多糖酶和硫酸酯酶与步骤 （6） 泡叶藻精岩藻多糖粉末 质量比分别为1:50、 1:120、 1:50、 1:280。 0019 一种泡叶藻寡糖的制备方法制得的泡叶藻寡糖。 0020 泡叶藻寡糖在制备降血糖药物中的应用。 0021 实施例3 一种泡叶藻寡糖的制备方法， 具体步骤如下： （1） 泡叶藻干燥粉碎后， 向泡叶藻干粉中 加入体积浓度95%乙醇回流提取2h， 泡叶藻干粉与乙醇溶液重量比为1:20， 回流结束后除 去乙醇， 烘干得到干燥脱脂的泡叶藻粉末； （2） 向步骤 （1） 得到的。
31、泡叶藻粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粉末与蒸馏水重量比为1: 30， 浸泡1h， 800W微波辐照2min， 冷却后， 重复辐照3次， 提取结束后， 进行过滤， 将滤渣重 复上述步骤进行3次提取， 将获得的滤液混合后进行浓缩至原体积的1/3， 加入4倍体积步骤 （1） 所回收乙醇， 10静置沉淀10h， 3000rpm离心20min收集沉淀物； 沉淀物真空冷冻干 燥后粉碎， 得到泡叶藻粗岩藻多糖粉末； 离心后上清液经旋转蒸发去回收乙醇， 上清浓缩后 保存备用； （3） 向步骤 （2） 所得泡叶藻粗岩藻多糖粉末中加入蒸馏水， 其中泡叶藻粗岩藻多糖粉末 与蒸馏水重量比为1:20， 进行搅拌复溶， 。
32、用三氯乙酸法除蛋白8次得多糖提取液； （4） AB-8树脂经活化后湿法装入1.660cm层析柱中， 蒸馏水平衡， 以1.0mL/min的流 速连续通过步骤 （3） 多糖提取液， 分管收集， 重复处理5次后得多糖精提液； （5） 步骤 （4） 的多糖精提液经截留分子量14000规格透析袋透析得截留液， 截留液在60 及转速为40r/min条件下旋转蒸发， 浓缩至膏状并真空冷冻干燥， 得到泡叶藻精岩藻多 糖粉末； （6） 将步骤 （5） 中所得泡叶藻精岩藻多糖粉末用蒸馏水溶解， 质量浓度为10%， 利用800 W微波辐照3min， 冷却后， 重复辐照2次， 调节pH为7.8， 加入硫酸酯酶后置于4。
33、0， 速度为90 r/min水浴摇床中酶解1.0h后取出， 沸水加热10min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心 10min取上清液； （7） 将步骤 （6） 离心所得上清液调节pH为6.0， 加入岩藻多糖酶后置于50， 速度为90 r/min水浴摇床中酶解1.2h后取出， 沸水加热10min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心 10min取上清液； （8） 将步骤 （7） 离心所得上清液调节pH为5.0， 加入纤维素酶后置于60， 速度为90r/ min水浴摇床中酶解1h后取出， 沸水加热15min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心10 min取上清液； （9） 。
34、将步骤 （8） 离心所得上清液调节pH为4.5， 加入果胶酶后置于50， 速度为90r/min 水浴摇床中酶解20min后取出， 沸水加热15min以灭酶活， 冷却至室温， 3000rpm离心10 min取上清液备用； 说明书 5/7 页 8 CN 105861593 A 8 （10） 向步骤 （9） 中上清液加入等体积的浓度95%乙醇沉降去除蛋白， 8静置沉淀2.0 h后， 离心收集上清并在50及转速为25r/min条件下旋转蒸发除去乙醇； （11） 向步骤 （10） 除乙醇后的上清液中加入体积比1:4的体积浓度95%乙醇沉降除去未 充分降解岩藻多糖及添加的酶制剂， 10静置沉淀6h后， 离。
35、心收集上清并在50及转速为 25r/min条件下旋转蒸发回收乙醇， 即得泡叶藻寡糖粗品溶液； （12） 将步骤 （2） 中上清液和步骤 （11） 中泡叶藻寡糖粗品溶液混合， 通过3000D超滤膜， 滤出液再通过500D的分子筛， 将截留物进行冷冻干燥， 制备得泡叶藻寡糖。 0022 所述果胶酶、 纤维素酶、 岩藻多糖酶和硫酸酯酶与步骤 （6） 泡叶藻精岩藻多糖粉末 质量比分别为1:60、 1:130、 1:62、 1:350。 0023 一种泡叶藻寡糖的制备方法制得的泡叶藻寡糖。 0024 泡叶藻寡糖在制备降血糖药物中的应用。 0025 泡叶藻活性寡糖体外抑制 -葡萄糖苷酶的试验 利用 -葡萄。
36、糖苷酶， 以4-硝基苯- -D-吡喃葡萄糖苷 （PNPG） 为底物， 缓冲液为0.1mol/ L磷酸盐缓冲液， 以阿卡波糖为阳性药物， 抑制率计算公式为： 抑制率= （1-A00/A01） *100%， A00=A3-A4， A01=A1-A2（式中A1、 A2、 A3、 A4分别为405nm处空白管、 空白对照管、 抑制剂管和背景 对照管的吸光值） 。 反应体系如表1。 0026 表1 -葡萄糖苷酶活性抑制反应体系 结果见图1， 以阿卡波糖为阳性对照， 泡叶藻活性寡糖对 -葡萄糖苷酶活性具有较好的 抑制作用， 其IC50值为4.82mg/mL， 且抑制活性呈现一定的剂量依赖性。 泡叶藻活性寡。
37、糖对胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢影响试验 将HepG2细胞置于含10%磷酸盐的DMEM高糖培养基中， 在37和5%CO2饱和湿度条件下 培养。 待细胞长满后， 用0.25%胰酶消化液消化细胞， 进行种板， 尽量使细胞散落均匀， 每天 记录细胞状态， 隔天换液。 使用1 mol/L地塞米松作用24h诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗 模型， 建模成功后将测试分成5组： 正常对照组、 模型组、 泡叶藻寡糖组 （0.01、 0.02、 0.1mg/ mL） 。 样品组加入不含血清的含泡叶藻寡糖培养基， 正常对照组及模型组则加入不含血清的 培养基， 于37和5%CO2培养箱中培养24h后， 用葡萄糖。
38、临床试剂盒检测培养基中的葡萄 糖含量。 葡萄糖含量计算公式： 说明书 6/7 页 9 CN 105861593 A 9 试验结果发现， 与模型对照组相比， 0.10mg/mL泡叶藻活性寡糖处理的HepG2细胞， 其葡 萄糖消耗量为3.02mmol/L， 相对于模型组葡萄糖消耗量增加了45.2%。 说明本发明制备的 泡叶藻活性寡糖对胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢具有显著的改善作用。 0027 表2泡叶藻寡糖对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢的影响 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 7/7 页 10 CN 105861593 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 105861593 A 11 。