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1、(10)授权公告号 CN 1912100 B (45)授权公告日 2011.11.16 CN 1912100 B *CN1912100B* (21)申请号 200510028589.7 (22)申请日 2005.08.08 C12N 1/14(2006.01) C08B 37/00(2006.01) (73)专利权人 上海瑞丰农业科技公司 地址 201106 上海市北翟路 2901 号 (72)发明人 崔星明 龚胜萍 严培兰 戴群华 杨志元 (74)专利代理机构 上海世贸专利代理有限责任 公司 31128 代理人 李浩东 CN 1403565 A,2003.03.19, 全文， 具体参见 权利。
2、要求 9、 实施例 4. 廖昌国 . 峡渝 01 蜜环菌的发现与培育 . 食用菌 2.2004,(2),17. 邢晓科 郭顺星 . 猪苓、 伴生菌及蜜环菌共培养的形态学研 究 . 菌物系统 22 4.2003,22(4),653-660. 王秋颖 徐锦堂 . 假单胞杆菌、 灵芝等几种菌的发酵液 对猪苓菌生长的影响 . 中国药学杂志 32 8.1997,32(8),459-462, 具体参见对比文件 1 摘 要、 第459页右栏最后一行、 第460页左栏第1段、 第1.2节、 2.1.1节、 2.1.2节、 第2.1.3节第1行. (54) 发明名称 猪苓的发酵方法和猪苓多糖的生产方法 (57)。
3、 摘要 本发明公开了一种猪苓的发酵方法和猪苓多 糖的生产方法。本发明的方法， 生产周期短， 生产 量大， 容易实现大规模工厂化生产， 不需要价格昂 贵的发酵室和发酵设备， 所获得的发酵产物， 多糖 水平高， 不仅生产成本较低， 而且重金属含量不超 标， 便于工业化实施。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 丁海 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 1912100 B1/1 页 2 1. 一种猪苓多糖的生产方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 将干燥的固体发酵菌丝体， 加812倍重量的水， 并用碱性物质将pH调整为10。
4、13， 煮沸， 维持 0.5 2 小时， 收集提取液， 重复提取 2 5 次 ； 所述干燥的固体发酵菌丝体的制 备方法， 包括如下步骤 ： (1) 将发酵料用密环菌或其它草腐类食用菌采用常规的方法进行预发酵 ； 所说的发酵料的组分包括主料、 辅料和水 ； 发酵料重量份数为 ： 主料 ： 甘蔗渣或玉米芯 60 90 份 ； 以麸皮、 玉米粉、 石灰和食糖的混合物为辅料时， 辅料的重量份数为 ： 麸皮 5 20 份， 玉米粉 1 5 份， 蔗糖 0.5 5 份， 石膏粉 0.3 3 份， 加水量为干发 酵料的 80 150 份 ； 所说的其它草腐类食用菌选自杏鲍菇 Pleurotus eryngi。
5、i(DC.ex Fr.)Quel.SAGC 00116 ； (2) 将经过预发酵的培养料， 装入塑料袋中灭菌 ； (3) 将猪苓种子接种于包括 (2) 的灭菌产物 ； (4) 接种后的培养料放在塑料棚中发酵， 发酵温度为 18 32， 发酵时间为 5 7 个 月， 收取菌丝， 晒干， 获得干燥的固体发酵菌丝体 ； 然后将提取液先通过 180 220 万分子量的滤膜过滤， 收集滤液， 再用 0.8 1.2 万分 子量的超滤膜， 获得浓缩液 ； 将浓缩液， 在 60 80的温度下喷雾干燥， 或在 55 65下烘干， 即得猪苓多糖。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所说的碱性物质。
6、选自 NaOH、 KOH、 Na2CO3或 Ca(OH)2。 权 利 要 求 书 CN 1912100 B1/4 页 3 猪苓的发酵方法和猪苓多糖的生产方法 技术领域 0001 本发明涉及猪苓的固体发酵方法和猪苓多糖的提取方法。 0002 背景技术 0003 猪苓 polyporus umbellatus(Pers)Fr.， 别名豕零 ( 庄子 )、 豨苓 ( 韩昌黎集 )、 地 乌桃 ( 本草图经 )， 野猪食 ( 东北药植志 ) 猪屎苓 ( 四川中药志 ) 为多孔菌科真菌， 天然状 态下与蜜环菌共生。 0004 野生猪苓生长在树根部， 春、 秋二季采挖， 除去泥沙， 干燥， 就可使用。猪苓。
7、的干燥 菌核是一种常用的中药， 自古以来， 猪苓就用以治疗肿瘤等疾病， 具有 2000 多年的药用历 史。 主治急性肾炎、 肝炎、 急性尿道感染、 暑热水泻和小便不利等。 猪苓作为一种治疗肿瘤的 中药， 越来越受到人们的重视。猪苓的水煎提取物为目前治疗慢性病毒性肝炎及抗肿瘤的 主要成分。七十年代 T.Miyazaki 和 N.oikawa 首次从猪苓菌该中提取出猪苓多糖， 经临床 证明具有免疫刺激作用， 能提高人体的免疫功能。临床上猪苓多糖用于原发性肺癌、 肝癌、 子宫颈癌、 鼻咽癌、 食道癌和白血病等放化疗的辅助治疗。 0005 最近研究还表明 ： 猪苓多糖能帮助机体对应激适应， 还能抑制癌。
8、细胞的生长和杀 死艾滋病病毒。此外， 它还能促使防治艾滋病病毒的主要免疫细胞 CD4繁殖生长。 0006 日本专利 JP55159796 和文献 “Duction of Antitumor Glucans byPolyporus Umbellatus Culture” Jpn.Kokai Tokyo Koho 81 76， 401， 1981 公开了一种从猪苓中提取 抗癌物质和提取抗肿瘤葡聚糖的方法。 0007 目前， 获取猪苓包括 ： 0008 野生采挖。由于野生猪苓生长缓慢， 因此采挖困难， 资源紧缺 ； 0009 人工栽培。 猪苓采用半野生栽培， 因猪苓与密环菌营共生生活， 所以找密环菌。
9、能够 生长的林木进行栽培， 以上两种方法都存在猪苓内重金属易超标的可能， 且产量有限， 远远 不能满足日益增长的国内外市场对猪苓的需求 ； 0010 人工发酵生产。如中国药学杂志 1993(8)466468 报道的 “蜜环菌发酵液在猪苓 发酵过程中的应用” 中公开的技术。 0011 然而目前常规的固体发酵多为开放式发酵， 用猪苓子实体或液体深层发酵菌丝 体， 然后用水提醇沉提取多糖， 需要高质量的洁净发酵室和培养架盘等， 生产周期长， 生产 量小， 不容易实现大规模工厂化生产， 需要价格昂贵的发酵室和发酵设备， 所获得的发酵产 物不仅成本较高， 而且重金属含量超标。 发明内容 0012 本发明。
10、需要解决的技术问题是公开一种猪苓的发酵方法和猪苓多糖的生产方法， 以克服现有技术存在的缺陷。 0013 本发明的猪苓的固体发酵方法包括如下步骤 ： 0014 (1) 将发酵料用密环菌或其它草腐类食用菌采用塑料袋密闭发酵的方法进行预发 酵 ； 说 明 书 CN 1912100 B2/4 页 4 0015 所说的密环菌的拉丁学名为 Armillariella mella(Vahl.ex.Fr.)karst， 保藏号 ： SEFI 0086 ； 0016 所说的它草腐类食用菌选自双孢菇 Agaricus bisporus(Lange)Sing.SAGC 00037、 姬松茸Agaricus blaz。
11、ei Murrill SAGC 00253、 草菇Volvariella volvacea(Bull. ex Fr.)Sing.SAGC 00077、 金 针 菇 FIammulina velutipes(Fr.)Sing.SEFI 0178、 鸡 腿 菇 Coprinuscomatus(Mull.Ex Fr.)Gray SAGC 00230、 杏鲍菇 Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.)Quel.SAGC 00116、白 灵 菇 Pleurotus ferulae var.nebradensisLenzi SAGC 00109、 平菇 Pleurotus ostrea。
12、tus(Jacq.ex Fr.)Quel.SEFI0510 或大球盖菇 Stropharia rugoso-annulata Farlow SEFI 1298 中的一种。 0017 所说的发酵料的组分包括主料、 辅料和水 ； 0018 所说的主料为甘蔗渣或玉米芯 60-90 份 ； 0019 以麸皮、 玉米粉、 石灰和食糖的混合物为辅料时， 辅料的重量份数为 ： 0020 麸皮 5-20 份， 玉米粉 1-5 份， 蔗糖 0.5-5 份， 石膏粉 0.3-3 份， 加水量为干发酵料 的 80-150 份 ； 0021 (2) 将经过预发酵的培养料， 装入塑料袋中， 在 2.1710-3的 Kp。
13、a 压力下高压灭菌 2.5 小时或常压灭菌 12 小时 ； 0022 (3) 将猪苓种子接种于包括 (2) 的灭菌产物， 最好在超净工作台上进行接种 ； 0023 所说的猪苓菌种从中国农业微生物保藏中心上海市分中心购买， 保藏号为 SEFI 0208。 0024 (4) 接种后的培养料放在塑料棚中发酵， 发酵温度为 18 32， 发酵时间为 5 7 个月， 收取菌丝， 晒干， 获得干燥的固体发酵菌丝体 ； 0025 (5) 将干燥的固体发酵菌丝体， 加 8 12 倍重量的水， 并用碱性物质将 pH 调整为 10 13， 煮沸， 维持 0.5 2 小时， 收集提取液， 重复提取 2 5 次 ； 。
14、0026 所说的碱性物质选自 NaOH、 KOH、 Na2CO3或 Ca(OH)2： 0027 (6) 将提取液先通过 180 220 万分子量的滤膜过滤， 收集滤液， 再用 0.8 1.2 万分子量的超滤膜， 除去小分子杂质， 使提取液中 1-200 万分子量的产物， 得以浓缩， 获得 浓缩液 ； 0028 (7)将步骤(6)所获得的浓缩液， 在7080的温度下喷雾干燥， 或在5565 烘箱烘干， 即得猪苓多糖。 0029 以干燥的固体发酵的重量计， 得率为 7.5以上。 0030 采用苯酚硫酸法和 DNS 法进行检测， 产物中猪苓多糖的重量含量为 15。 ， 用原 子吸收光谱检测重金属中铅。
15、含量小于 1.5ppm ； 砷小于 1ppm ； 用测汞仪测定， 汞含量小于 0.3ppm。均达到国家强制性标准。 0031 由上述公开的技术方案可见， 本发明的方法， 生产周期短， 生产量大， 容易实现大 规模工厂化生产， 不需要价格昂贵的发酵室和发酵设备， 所获得的发酵产物， 多糖水平高， 不仅生产成本较低， 而且重金属含量不超标， 便于工业化实施。 具体实施方式 0032 实施例 1 说 明 书 CN 1912100 B3/4 页 5 0033 发酵在普通塑料大棚中进行， 大棚建在地势高， 周边有排水条件的地方。 大棚地面 最好做成水泥地面， 上面最少要覆盖一层黑色薄膜。 大棚下部要有便。
16、于通风部分， 便于夏天 通风。冬天又有能保温的覆盖物。大棚宽度为 6 米， 放 4 排， 两边各 1 排， 中间 2 排， 两边各 留过道 ； 0034 发酵料的组分和重量份数为 ： 0035 甘蔗渣 75 份 ； 0036 麸皮 20 份， 玉米粉 3.5 份， 石灰 1 份， 食糖 0.5 份 ； 加水 120 份。充分拌匀， 用鸡腿 菇菌种用塑料袋封闭式预发酵。 0037 (2) 将经过预发酵的培养料适当补充水份， 装入塑料袋中， 在 2.17*10-3的 Kpa 压 力下高压灭菌 2.5 小时 ； 0038 (3) 将猪苓种子接种于包括 (2) 的灭菌产物 (4) 接种后的培养料放在塑。
17、料棚中发 酵， 发酵温度为 20， 发酵时间为 6 个月， 收取菌丝， 晒干， 获得干燥的固体发酵菌丝体 ； 0039 (5) 将干燥的固体发酵菌丝体， 加 10 倍重量的水， 并用 NaCO3将 pH 调整为 11， 煮 沸， 维持 2 小时， 收集提取液， 重复提取 3 次 ； 0040 (6)将提取液先通过200万分子量的超滤膜， 收集滤液， 再用1万分子量的超滤膜， 除去小分子杂质， 使提取液中 1-200 万分子量的产物， 得以浓缩， 获得浓缩液 ； 0041 (7) 将步骤 (6) 所获得的浓缩液， 在 75的温度下喷雾干燥， 即得猪苓多糖。 0042 以干燥固体发酵菌丝体的重量计。
18、， 得率为 8.5以上。 0043 采用苯酚硫酸法和 DNS 法进行检测， 产物中猪苓多糖的重量含量为 15。 ， 用原 子吸收光谱检测重金属中铅含量小于 1.5ppm ； 砷小于 1ppm ； 用测汞仪测定， 汞含量小于 0.3ppm。 0044 实施例 2 0045 发酵在普通塑料大棚中进行， 大棚建在地势高， 周边有排水条件的地方。 大棚地面 最好做成水泥地面， 上面最少要覆盖一层黑色薄膜。 大棚下部要有便于通风部分， 便于夏天 通风。冬天又有能保温的覆盖物。大棚宽度为 8 米， 放 6 排， 两边各 2 排， 中间 3 排， 两边各 留过道 ； 0046 发酵料的组分和重量份数为 ： 。
19、0047 粗粉碎玉米芯 85 份 ； 0048 麸皮 12 份， 玉米粉 1.5 份， 石灰 1 份， 食糖 0.5 份 ； 将发酵料用密环菌采用塑料袋 封闭式发酵的方法进行预发酵 ； 0049 (2) 将经过预发酵的培养料， 装入塑料袋中， 在常压灭菌 12 小时 ； 0050 (3)将猪苓菌种接种于包括(2)的灭菌产物， (4)接种后的培养料放在塑料棚中发 酵， 发酵温度为 30， 发酵时间为 6 个月， 收取菌丝， 晒干， 获得干燥的固体发酵菌丝体 ； 0051 (5) 将干燥的固体发酵菌丝体， 加 10 倍重量的水， 并用 KOH 将 pH 调整为 11， 煮沸， 维持 2 小时， 收。
20、集提取液， 重复提取 4 次 ； 0052 (6) 将提取液先通过 200 万分子量的滤膜过滤， 收集滤液， 再用 1 万分子量的超滤 膜， 除去小分子杂质， 使提取液中 1-200 万分子量的产物， 得以浓缩， 获得浓缩液 ； 0053 (7) 将步骤 (6) 所获得的浓缩液， 在 75的温度下喷雾干燥， 即得猪苓多糖。 0054 以干燥固体发酵菌丝体的重量计， 得率为 8.5以上。 说 明 书 CN 1912100 B4/4 页 6 0055 采用苯酚硫酸法和 DNS 法进行检测， 产物中猪苓多糖的重量含量为 15.8。 ， 用 原子吸收光谱检测重金属中铅含量小于 1.5ppm ； 砷小于 1ppm ； 用测汞仪测定， 汞含量小于 0.3ppm。 说 明 书 。