本申请是申请号为03154948.9，申请日为1995年12月11日，发明名 称为“基因的鉴定”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及微生物适应环境有关的基因的鉴定方法，特别是决定病原微 生物毒力的基因的鉴定。
细菌病原体和其它病原体中的抗生素抗性显得日益重要。因而很重要的 是找到攻击病原微生物的新治疗途径。
病原微生物不得不避开宿主的防御机制，并且生长在营养不良的环境中 形成感染。为此需要很多微生物的毒力基因。
已用经典遗传学方法检测了毒力基因，并且已采用各种方法通过转座子 诱变鉴定细菌毒力基因。例如，已筛选具特定生理缺陷的突变体，如缺失铁 调节蛋白(Holland等，1992)，或者在测定中以研究上皮细胞的侵入(Finlay 等，1988)和巨噬细胞内的存活(Fields等，1989；Miller等，1989a；Groisman 等，1989)。也测定了转座子突变体在活体动物感染模型中的毒力改变(Miller 等，1989b)。这一方法的优点在于能够鉴定那些在不同感染阶段重要的基因， 但严重的局限在于需要单个试验大量的突变体的毒力变化。Miller等(1989b) 用8-10个一组的小鼠，用不同突变体口服感染95个独立的组，因而所用 小鼠数在760-950之间。由于需要极多量的动物，广泛筛选细菌基因组中 的毒力基因是不可行的。
最近有人描述了一个可靠筛选沙门氏菌(Salmonella)基因的遗传系统(体 外表达技术[IVET])，这些基因是在感染过程中被专门诱导的(Mahan等， 1993)。这一技术将能鉴定那些在感染过程的特殊阶段表达的基因。但这不 能鉴定那些转录后被调节的基因，更重要的是这一技术不能提供信息以表明 已鉴定的基因是感染过程中所实际需要的，还是有助于这一感染过程。
Lee和Falkow(1994)在“酶学方法”(Methods Enzymol.)236，531-545 中描述了通过分离超侵染性突变体，以鉴定那些影响沙门氏菌在体外侵入哺 乳动物细胞的因子的方法。
Walsh和Cepko(1992)在“科学”(Science)255，434-440中描述了在大 鼠大脑皮层发育过程中示踪大脑皮层祖细胞的空间位置的方法。Walsh和 Cepko的方法采用了含有一段单一核酸序列和lacZ基因的标记，但结果表明 他们的方法不能检测到有用的突变体或基因。
WO 94/26933和Smith等(1995)在“美国国家科学院院刊” (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，6479-6483中描述了用于确定一个已知基因的 功能区，或至少是一些序列已知的一个DNA分子的方法。
Groisman等(1993)在“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)90，1033-1037中描述了沙门氏菌特异序列的分子、功能和进化上 的分析。
病原微生物的有些毒力基因已为人知，这些微生物如大肠杆菌 (Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肉毒核菌(Clostridium botulinum)、鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和单核 细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，但总起来说只有全部中的相对 少数已被确定。
鼠伤寒沙门氏菌在小鼠中引起疾病提供了伤寒的一个很好实验模型 (Carter和Collins，1974)。目前已确定的影响沙门氏菌毒力的约有42个基因 (Groisman和Ochman，1994)这些基因大约占所预计的毒力基因总数的三分 之一(Groisman和Saierr，1990)。
本发明的目的是鉴定与微生物适应环境有关的基因，特别是更高效地鉴 定病原微生物中的毒力基因。还有一个目的是减少在鉴定毒力基因中所用的 实验动物数量。本发明的目的还在于提供疫苗，以及提供方法以筛选降低毒 力的药物。
本发明第一方面是提供一种方法，用于鉴定对特定环境的适应性下降的 微生物，这种方法包括以下步骤：
(1)将一种核酸导入各种不同的微生物，使其中每种微生物通过一个基 因插入失活而各自发生突变，其中的核酸包含一段单一标记序列，因而每一 突变体含有不同的标记序列，或所述微生物的克隆；
(2)单独提供由步骤(1)生长的每个突变体的保存样品，单独提供含有各 突变体单一标记序列的保存的核酸；
(3)将由步骤(1)产生的各种突变体导入所述的特定环境中，并使那些能 导入特定环境的微生物在所述环境中生长；
(4)从所述环境中取回微生物或取回所选择的其中一部分，并从取回的 微生物中分离核酸；
(5)将步骤(4)中分离的核酸中任何标记序列与步骤(2)中所保存的各突变 体的单一标记序列相比较；以及
(6)选择不含步骤(4)所分离的任何标记序列的单个突变体。
因此，本方法采用负选择以确定在环境中增殖能力下降的微生物。
一种微生物能够生活在很多不同的环境中，已知有特定的基因和它们的 产物使这些微生物适应于特定的环境。例如，为了使一种病原微生物，如病 原细菌或病原真菌在其宿主中存活，需要有一个或多个毒力基因的产物。因 此，在本发明的一个优选实施例中，使微生物适应于特定环境的一种微生物 基因为毒力基因。合适的特定环境是一个分化的多细胞生物，如一种植物或 一种动物。许多细菌和真菌已知能感染植物，它们能在植物内存活并引起疾 病，因为有毒力基因的存在及其表达。当特定的环境为一种植物中，合适的 微生物包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，它能形成肿瘤(菌瘿)， 特别是在葡萄中；解淀粉欧文氏杆菌(Erwinia amylovara)；引起很多植物枯萎 的茄假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)；引起豆类病害的豆科根瘤菌 (Rhizobium leguminosarum)；引起柑桔果实溃疡的田野黄单胞菌 (Xanthomonas campestris)P.V.柑桔黄单胞菌(X.Citri)；真菌中包括引起稻瘟病 的Magnaporthe grisea；引起各种植物病害的镰刀菌(Fusarium spp.)；Erisyphe spp.；盘长孢状毛盘孢(Colletotrichum gloeosporiodes)；在禾谷和草中引起根 和冠病害的Gaeumannomyces graminis；Glomus spp.，Laccaria spp.； Leptosphaeria maculans；Phoma tracheiphila；疫霉(Phytophthora spp.)，圆核 腔菌(Pyrenophora teres)；棉黄萎轮枝孢(Verticillium alboatrum)和大丽花轮枝 孢(V.dahliae)；以及Mycosphaerella musicola和M.fijiensis。如以下更详细的 描述中，当一种微生物是真菌时，需要其生活中的单倍体。
同样地，很多微生物，包括细菌、真菌、原生动物和锥虫已知能感染动 物，特别是哺乳动物，包括人。动物体内微生物的存活和这些微生物引起疾 病的能力，很大程度取决于毒力基因的存在和表达。合适的细菌包括博德特 氏杆菌(Bordetella spp)，特别是百日咳博德特氏杆菌(B.pertussis)；弯曲杆菌 (Campylobacter spp)特别是C.jejuni；梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)特别是肉 毒梭状芽孢杆菌(C.botulinum)；肠体菌(Enterococcus spp.)，特别是E.facecalis； 埃希氏杆菌(Escherichia spp.)特别是大肠杆菌(E.coli)；嗜血杆菌(Haemophilus spp.)特别是杜克氏嗜血杆菌(H.ducrevi)和流感嗜血杆菌(H.influenzae)； Helicobacter spp.特别是H.pylori；克雷白氏杆菌(Klebsiella spp.)特别是肺炎克 雷白氏杆菌(K.pneumoniae)；Legionella spp.特别是L.pheumophila；利斯特氏 菌(Listeria spp.)特别是单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；分枝杆 菌(Mycobacterium spp.)特别是耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)；奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)特别是淋病奈瑟氏球菌 (N.gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)；假单胞菌(Pseudomonas spp.)特别是铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)；沙门氏菌(Salmonella spp.)；志贺 氏菌(Shigella spp.)；葡萄球菌(Staphylococcus spp.)特别是金黄色萄葡球菌 (S.aureus)；链球菌(Streptococcus spp.)特别是化脓链球菌(S.pyogenes)和肺炎 链球菌(S.pneumoniae)；弧菌(Vibrio spp.)和耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)特别 是鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)。所有这些细菌引起人体疾病，同时还有这些疾 病的动物模型。因此当这些细菌应用于本发明的方法时，这一特定的环境为 细胞感染的动物，并且在动物中这些细菌会引起疾病。例如，当用鼠伤寒沙 门氏菌(Salmonella typhimurium)感染小鼠时，该小鼠患病，这种疾病即作为 人伤寒的模型。金黄色葡萄球菌在小鼠中引起菌血症和肾脓肿的形成(Albus 等(1991))“感染与免疫”(Infect.Immun)59，1008-1014)，在兔子中引起心内 膜炎(Perlman & Freedman)(1971)“耶鲁生物医学杂志”(Yale J.Biol.Med.)44， 206-213)。
需要一种真菌或高等真核寄生虫在其生活史的相关部分为单倍体(如生 长在这一环境中)。优选地可获得一个DNA介导的整合转化系统，并且当该 微生物是人体病原时，可方便地获得人体疾病的动物模型。对于人体合适的 真菌病原包括某些曲霉(Aspergillus spp.)(如烟曲霉(A.fumigatus))、新型隐球 酵母(Cryptococus neformans)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。显 然上述真菌有单倍体阶段，并且可获得它们的DNA介导整合转化系统。 Toxoplasma也可以应用，因它是在感染过程中为单倍体阶段的一种寄生虫。 细菌具单倍体基因组。
人体知病的动物模型常常可以从小鼠、大鼠兔子、狗或猴子中获得。优 选的动物为小鼠。采用本发明方法用人体疾病的动物模型检测的毒力基因， 显然很可能是那些在人体中决定微生物毒力的基因。
应用本发明的方法优选的微生物为：鼠伤寒沙门氏菌、金黄色萄葡球菌、 肺炎链球菌、Enterococcus faecalis、铜绿假单胞菌和烟曲霉。
现描述本发明的一个优选实施例。
含有一段单一标记序列的核酸如下制备。采用寡核苷酸合成和聚合酶链 反应(PCR)产生一个双链DNA序列标记的复合库。每个DNA“标记”有一 个约20-80bp的独特序列，优选为约40bp，旁侧为约15-30bp的“臂”， 优选为20bp，这些在所有“标记”都是存在的。单一序列中的碱基对数目足 以通过随机寡核苷酸合成而产生大量(如71010)的单一序列，但不要太大以免 形成二级结构而干扰PCR。同样地“臂”的长度应足够用于PCR中寡核苷 酸的有效引导。
众所周知寡核苷酸5′末端的序列不需要与所要扩增的靶序列匹配。
通常PCR引物相互之间不含长于2个碱基的互补结构，特别是在3′末 端，因为这一特征会促使被称为“引物二聚体”的人工产物的形成。当两个 引物的3′末端杂交时，它们形成了一个“引物模板”复合物，引物延伸形成 了短的双链体产物，称之为“引物二聚体”。
在引物中应避免内部二级结构。对于对称PCR，建议的两个引物常为 40-60％G+C含量，没有任何碱基的长序列。用经典的解链温度计算结合 DNA探针杂交研究常常预测出某一引物应在特定温度下退火，或者72℃的 延伸温度会提前解离引物/模板杂合体。在实际中，杂交体在PCR过程中比 通常按简单Tm计算预计的更为有效。
最佳退火温度可根据经验决定，可比预计的要高。Taq DNA聚合酶在 37-55℃范围内确定具有活性，因此引物延伸会在退火步骤中发生，杂交体 会稳定下来。在常规(对称)PCR中，引物的浓度通常在0.1-1μM范围内。
“标记”连入转座子或类似转座子的元件中以形成含一段单一标记序列 的核酸。方便的转座子装在自杀载体上，该载体在“辅助”生物中以质粒形 式存在，但在转至本发明方法的微生物中后会丢失。例如，该“辅助”生物 可以是一株大肠杆菌，本方法的微生物可以是沙门氏菌，转移是接合转移。 尽管转座子在转移后会失去，但在一部分细胞中该转座子经历转座作用，通 过转座作用转座子同单一标记一起随机整合入本方法所用的微生物基因组 中。最优选为该转座子或类似转座子的元件是可选择的。例如，对于沙门氏 菌，卡那霉素抗性基因可出现于转座子，并且接合后体可在含卡那霉素的培 养基上进行选择。也可能用含有单一标记的核酸中的功能基因互补受体细胞 中的营养缺陷型标记。当真菌用于本方法时，这一方法尤其方便。
优选的互补功能基因不是源自与受体微生物相同的种，不然的话可能会 出现非随机整合。
当在第一种给定条件下，如果转座子或类似转座子的元件装载于处于一 个载体上，而该载体在本发明第一方面的方法中的微生物体内处于附加体状 态(即不是染色体的部分)时，这也是特别方便的。然而当第一种给定条件转 至第二种给定条件时，该附加体不能维持以进行细胞的选择。在该细胞中转 座子或类似转座子的元件经历转座作用，通过这一作用转座子随同其单一标 记随机整合进本方法所用的微生物的基因组中。这一特别方便的实施例有着 优点，因为一旦获得了带有附加型载体的微生物，那么每当转座作用被选作 用于将微生物条件(或其克隆)从第一种给定条件改变至第二种给定条件，或 由这种转变所诱导时，转座子可以微生物基因组的不同位点整合。因此，一 旦建立了微生物标准收藏物，每一种微生物在附加型载体(在第一种给定条 件下)上所带的转座子或类似转座子元件中含有一段单一标记序列，每种微 生物可重复使用以产生随机插入突变体库，其中每一种突变体含有一个不同 标记序列(即库内的单一序列)。这一实施例特别有用，因为(a)它：减少了产 生本方法步骤(1)中大量独立突变微生物所需的操作数量和复杂性；(b)所需 的不同标记的数量只与本方法步骤(1)的大量微生物的数目相同。(a)使本方法 较容易应用于那些很难进行转座子诱变的生物(如金黄色葡萄球菌)，(b)意味 着可选择那些具特别好的杂交特性的标记序列，因而使得较易进行质控。如 下较详细的描述中，合适的“库”大小约为100至200独立突变的微生物， 因此微生物标准收藏物可方便地保存在1或2个96孔微量滴定板中。
在一个特别优选的实施例中，第一个给定的条件是第一个特定的温度或 温度范围，如25℃-32℃，最优选为约30℃，第二个给定的条件是第二个 特定的温度或温度范围，如35-45℃，最优选为42℃，在优选的实施例中， 第一个给定的条件是含有抗生素，如链霉素，第二个给定的条件是不含所述 的抗生素；或是第一个给定条件不含有抗生素而第二个给定条件含有所述抗 生素。
适合于整合入革兰氏阴性细菌基因组的转座子包括Tn5、Tn10和它们 的衍生物。适合于整合入革兰氏阳性细菌基因组的转座子包括Tn916和其衍 生物或类似物。特别适合于应用金黄色葡萄球菌的转座子包括 Tn917(Cheung(1992)“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89， 6462-6466)和Tn918(Albus等(1991)“感染与免疫”(Infect.Immun)59，1008 -1014)。
特别优选的转座子为具有Tn914衍生物特性，见Camilli等(1990)“细 菌学杂志”(J.Bacteriol.)172，3738-3744，并且由温度敏感的载体，如PE194Ts 携带(Villafane等(1987)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)169，4822-4829)。
人们会意识到尽管转座子对于插入失活一个基因是方便的，但也可采用 其它已知的方法，或将来发展的新方法。插入灭活一个基因，特别是在某些 细菌，如链球菌中的简便方法还包括用插入复制诱变法，如Morrison等在“细 菌学杂志”(J.Bacteriol.)159，870中就肺炎链球菌所作的描述。也可以对其他 微生物，特别是细菌应用普通的方法。
对于真菌，采用DNA的片段或带标记的质粒通过转化产生插入突变， 优选的可选择标记编码对潮霉素B或福来霉素的抗性(Smith等(1994)“感染 与免疫”(Infect.Immunol.)62，5247-5254)。已知用限制性酶介导的整合，可 将编码潮霉素B抗性的DNA片段随机单整合入丝状真菌的基因组(REMI； Schiestl & Petes(1991)；Lu等(1994)“美国国家科学院院刊” (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，12649-12653)。
一个用于真菌的简单的插入诱变技术见Schiestl & Petes(1994)的描述， 引入此文作为参考，它包括了例如用酵母的Ty元件和核酸体DNA。
转座子或其他DNA序列的随机整合可使大量独立突变的微生物得以分 离，其中不同的基因在各突变体中为插入失活，并且各突变体含有一个不同 的标记序列。
这一插入突变体库排列在带孔的微量滴定皿上，使每孔含有一个不同的 突变体微生物。保存含有单个突变体微生物的单一标记序列的DNA(可方便 地用来自克隆的总DNA)。方便地，可从微量滴定皿上取微生物样品，点样 于核酸杂交膜(如硝酸纤维素膜或尼龙膜)，在碱中裂解微生物并将核酸固定 于膜上。这样制成了带孔微量滴定皿内容的影印。
从带孔的微量滴定皿中制备微生物库，并提取DNA。所得DNA用作 PCR的靶片段，所用引物为与位于“标记”旁侧的普通“臂”相退火的引物， 并将扩增的DNA进行标记，如用32P。PCR产物用于探测各个突变体所保存 的DNA，为带孔微量滴定皿的影印提供参照杂交图。这是对每一微生物实 际上确实含有一段标记序列的检查，并且这一标记序列可有效扩增和标记。
制备转座子突变体库以导入特殊环境。方便的可采用96孔微量滴定皿， 这一库含有96个转座子突变体。然而，这一库的低限为2个突变体；库的 大小没有理论上的上限，如下所讨论的，上限可按照导入突变体的环境来确 定。
一旦微生物被导入所述的特定环境中，那些能被导入的微生物可以生长 在该环境中。微生物留在环境中的时间长短根据微生物和环境的特性决定。 经过适当时间，从环境中取回微生物，提取DNA并用作PCR模板，引物为 与标记旁侧臂退火的引物。标记PCR产物，如用32P标记，并用于检测来自 各突变体的保存的DNA，该突变体从带孔的微量滴定皿复制而来。鉴定那 些与探针杂交很弱或根本不发生杂交的保存的DNA，该探针来自环境中取 回的微生物中分离的DNA。这些非杂交DNA对应于那些突变体，这些突变 体对特定环境的适应性已由于转座子或其他DNA序列的插入而减弱。
在一个特别优选的实施例中，“臂”与“标记”相比没有或极少有标记。 例如，适合PCR引物设计为不含或含单个G残基，32P标记的核苷酸为dCTP， 在这种情况下，没有或仅一个放射性标记的C残基掺入每一“臂”，但在“标 记”中有大量放射性标记C残基掺入。可取的是“标记”中至少比“臂”中 有多于10倍的标记掺入；优选为20倍或更多；更优选的为50倍或更多。 方便的“臂”可采用一种适当的限制酶从“标记”中除去，这一位点可掺入 引物设计中。
如上所讨论，本发明一个特别优选的实施例是当微生物是一种病原微生 物，并且特定的环境是一个动物。在一实施例中，导入动物突变体库的大小 取决于(a)在动物体内可能存活的各突变体细胞数目(假定毒力基因尚未失活) 和(b)微生物总的接种量。如(a)中数量太低；那些会出现假阳性结果，而如果 (b)中数量太高，那些在足够突变体有机会以所要求方式生长之前，动物会死 亡。(a)中的细胞数目可确定所用的每种微生物，但优选的为多于50，更优 选的为超过100。
能够导入单个动物的不同突变体的数目优选为50-500，方便的可采用 约100。虽然接种量大小可以在106细胞之一数量上下变化，这取决于微生 物和这一动物，可行的接种总是不超过106细胞(优选为105细胞)。
特别方便的方法为对单个动物采用105的接种量，其中含100种不同突 变体，每种1000个细胞。可以看出在本方法中一个动物可用于筛选100种 突变体，而现有技术需要至少100个动物以筛选100突变体。
然而较合适的是用同样突变体库接种三个动物，这样至少有两个可以进 行测定(一个作为重复，以检查方法的可靠性)，而第三个可作为备份。但这 一方法在所用动物数量上仍然节省了30多倍。
将突变体库导入动物和将微生物收回的时间间隔可随微生物和所用动 物而不同。例如，当动物是小鼠而微生物是鼠伤寒沙门氏菌时，接种和回收 的时间间隔约为3天。
本发明的一个实施例中，将微生物从远离步骤(4)中导入位点的步骤(5) 的环境中取回，使被研究的毒力基因包括那些涉及两个位点之间微生物散布 的基因。
例如，在一株植物中，可将微生物导入茎的伤口或叶子上的一个位点， 可从已表现出疾病状态的叶子的另一位点上分离这一微物。
对于一个动物，微生物可以通过口服、腹膜内、静脉或鼻内途径导入， 并且一段时间后从内部器管，如脾中分离。比较通过口途径和腹膜内途径鉴 定的毒力基因是有用的，因为可能有些基因在通过某一种途径引起感染时是 需要的，但对另一种途径可能是不需要的。优选为将沙门氏菌通过腹膜内导 入。
其他优选的可用于鉴定毒力基因的环境为培养的动物细胞(特别是巨噬 细胞和上皮细胞)和植物细胞。虽然从其本身特点看培养的细胞是有用的， 视具体情况它也要以互补作为环境的整个动物或植物的使用。
优选的还有环境是动物体的一部分。在一个给定的宿主一寄主相互作用 中，可能有很多不同的环境，包括不同的器官和组织及其部分，如派伊尔结 (Peyer′s patch)。
从环境中分离的单个微生物(即细胞)的数量应为导入环境的不同突变 体数目的至少2倍，优选为至少10倍，更优选为至少100倍。例如，当用 100种不同的突变体接种一个动物时，应分离约10000个单个微生物，并提 取其标记DNA。
进一步优选实施例包括步骤：
(1A)在步骤(1)中产生的大量突变体中去掉营养缺陷型；或
(6A)测定步骤(6)所选的突变体是否为营养型缺陷；或同时进行(1A)和 (6A)。
需要区分一种营养缺陷型(即一种突变体微生物，它需要野生型或原养 型不需要的生长因子)和一种突变体微生物，其中能使该微生物适应于特殊 环境的一个基因处于失活状态。这可以方便地在步骤(1)和(2)之间，或步骤(6) 之后进行。
优选为当鉴定毒力基因时，不去掉营养缺陷型。
本发明的第二个方面提供了一种鉴定基因的方法，该基因可使微生物适 应于一个特殊环境，这一方法包括本发明第一方面的方法，接着是另外的步 骤：
(7)从步骤(6)选择的单个突变体中分离插入灭活的基因或其部分。
用于分离含一个单一标记基因的方法为分子生物学领域内所熟知。
进一步的优选实施例还包括另外的步骤：
(8)用步骤(7)分离的插入灭活基因或其部分作为探针，从野生型微生物 中分离相应的野生型基因。
用于基因探针的方法为分子生物学领域内所熟知。
实施本发明所用的适合的分子生物学方法公开于Sambrook等(1989)的 文献，引文此文作为参考。
当微生物是一种动物的微生物病原，基因是一个毒力基因以及转座子已 被用于插入灭活基因时，可通过用一种切于转座子外的限制酶消化来自步骤 (6)所选的单个突变体的基因组DNA，然后将含有转座子的大小分级的DNA 连接至质粒，并且根据由转座子产生的而不是由质粒产生的抗生素抗性筛选 质粒重组体，从而很方便地进行毒力基因的克隆。用与转座子末端区退火的 两个引物和与质粒多接头序列相近区退火的两个引物，测定靠近转座子的微 生物基因组DNA的序列。这一序列可通过DNA数据库检索，以确定该转 座子是否已间断了一个已知的毒力基因。因此可很方便地将这一方法所得的 序列与公共可获得的数据库，如EMBL和GenBank中存在的序列进行比较。 最后，如果这一间断的序列看起来象一个新的毒力基因，则将突变体转至一 个新的遗传背景下(如对于沙门氏菌通过噬菌体P22介导的转导)，测定突变 株的LD50，以证实这一减毒表型是由于转座作用，而非次级突变。
用于检测微生物中所有毒力基因所需筛选的单个突变体的数目取决于 该微生物基因组中的基因数目。例如，很可能需要筛选鼠伤寒沙门氏菌的 3000-5000个突变体以检测大多数毒力基因，而对于基因组比沙门氏菌大的 曲霉，需筛选20000个突变体。约有4％的非必需的鼠伤寒沙门氏菌基因被 认为对毒力是必需的(Grossman & Saier，1990)，如果是这样的话，鼠伤寒沙 门氏菌含有约150个毒力基因。然而本发明的方法提供了一种更快、更方便、 更可行的方法以鉴定毒力基因。
本发明的第三个方面是提供用本发明第一方面的方法所得的一种微生 物。
这样的微生物是有用的，因为它们具有不适应于特定环境中存活的特 性。
在一个优选的实施例中，一种病原性微生物不能适应于在宿主生物(环 境)中存活，并且当微生物对动物，特别是哺乳动物，更特殊的为对人有致 病性时，用本方法所得的突变体可用于疫苗。该突变体无毒性，因而预计适 用于病人，但预计它具抗原性并能产生保护性免疫反应。
在一个进一步的优选实施例中，对从本发明所得的、不适应于宿主生物 中存活的病原微生物进行修饰，优选为通过导入合适的DNA序列，以表达 来自另一病原体的抗原表位。这一修饰的微生物可用作其他病原体的疫苗。
本发明的第四方面是提供一种微生物，包括用本发明第二方面的方法鉴 定的基因中的突变。
因此，虽然本发明第三方面的微生物是有用的，但优选为突变特定地导 入鉴定了的基因。在一个优选的实施例中，特别当该微生物将用于疫苗时， 基因中的突变是缺失或移码突变或大致不能回复的其他突变。这样的基因特 异性突变可采用标准程序而获得，如将自主复制子(如质粒或病毒基因组)上 的突变基因的一个拷贝导入微生物中，并依靠同源重组将突变导入该微生物 基因组中该基因的拷贝中。
本发明的第五和第六方面提供了一种合适的微生物，以用于疫苗和包含 一种合适微生物和一种药学上可接受的载体上的疫苗。
合适微生物为前面提到的减毒突变体。
优选为病人的主动免疫。在这一方法中，在免疫原性的制剂中制备一种 或多种突变体微生物，该制剂含有合适的佐剂和载体，并以已知的方式应用 于患者。合适的佐剂包括弗罗因德氏完全或不完全佐剂，胞壁酰二肽， EP109942、EP180564和EP231039的“Iscoms”，氢氧化铝，皂苷，DEAE -葡聚糖，中性油(如miglyol)，植物油(如花生油)，脂质体，普卢兰尼克多 元醇或Ribi佐剂系统(如见GB-A-2189141)。“普卢兰尼克”是一个已注册 的商标。将要免疫的患者是需要保护使其不得由该微生物毒性形成所引起的 疾病的患者。
前面所提到的本发明的无毒性微生物或其制剂可通过任何常规方法应 用，包括口服和不经肠(如皮下或肌肉)注射。治疗可由一段时间内的单剂量 或多剂量组成。
虽然本发明无毒性的微生物有可能单独使用，但优选的是以药物制剂的 形式，与一种或多种可接受的载体一起使用。这些载体必须是“可接受的”， 即与本发明的无毒性微生物是可容的，并且对其受体没有毒性。典型地，这 些载体是无菌的和无热原的水或盐水。
人们会意识到本发明的疫苗，依据其微生物组成，可用于人体药物和兽 药领域。
由微生物引起的疾病在许多动物中是已知的，如家养动物。本发明的疫 苗，当含有一种合适的无毒性微生物，特别是无毒性细菌时，可用于人体中， 但也可以用于牛、羊、马狗、猫和家禽、如鸡、火鸡、鸭和鹅。
本发明的第七和第八方面提供了从本发明第二方面的方法所得的基因 和由该基因编码的多肽。
“基因”不仅包括编码多肽的DNA区域，也包括DNA的调节区，如 调节转录、翻译以及在某些微生物中调节RNA剪接的DNA区。因此，这一 基因包括启动子、转录终止子、核糖体结合序列，以及某些生物中的内含子 和剪接识别位点。
通常可获得步骤7所得的失活基因的序列资料。方便地可将靠近转座子 末端的序列用作测序引物的杂交位点。衍生的序列或靠近失活基因的DNA 限制性片段本身用于制备杂交探针，用该探针从野生型生物中鉴定和分离相 应的野生型基因。
优选为在严格条件下进行杂交探测，以保证获得该基因，而不是其相关 基因。“严格的”指当基因固定在膜上时，将基因与探针杂交，并且探针(在 此情况下＞200核苷酸长度)在溶液中固定的基因/杂交的探针在0.1×SSC中 65℃下洗10分钟。SSC为0.15MNaCl/0.015M柠檬酸钠。
克隆沙门氏菌毒力基因的优选探针示于图5和图6，描述于实施例2中。
在一个特别优选的实施例中，沙门氏菌毒力基因包括图5和图6所示的 序列，描述于实施例2中。
进一步优选的基因在其基因内含有图11和图12所示序列或至少含其中 一部分，并且经本发明第二方面的方法所鉴定。示于图11和图12的序列是 来自鼠伤寒沙门氏菌的基因簇的一部分，我称该基因簇为毒力基因簇 2(VGC2)。转座子插入位置示于序列内，这些转座子插入灭活了生物的毒力 决定簇。如下更详细讨论的，特别是在实施例4中，当本发明第二方面的方 法用于鉴定鼠伤寒沙门氏菌的毒力基因时，许多核酸插入(和因此鉴定的基 因)集中于基因组相对小的部件。这一区域即VGC2含有其他的毒力基因， 这些基因如下所述构成本发明的部分。
按本发明方法分离的基因可在合适的宿主细胞中表达。因此，这一基因 (DNA)可按已知的技术、经过按此处所转换的内容的适当修改，以构建一个 表达载体，然后这一载体用于转化一个适当的宿主细胞，而进行本发明多肽 的表达和产生。这些技术包括下列专利中所公开的技术：1984年4月3日颁 发给Rutter等美国专利4,440,859，1985年6月23日颁发给Weissman的 4,530,901，1986年4月15日颁发给Crowl的4,582,800，1987年6月30日 颁发给Mark等的4,677,063，1981年7月7日颁发给Goeddel的4,678,751， 1987年11月3日颁发给Itakura等的4,704,362，1987年12月1日颁发给 Murray的4,710,463，1988年7月12日颁发给Toole，Jr等的4,757,006，1988 年8月23日颁发给Goeddel等的4,766,075和1989年3月7日颁发给Stalker 的4,810,648。所有这些引入此文作为参考。
编码组成本发明化合物的多肽的DNA可与很多其他的DNA序列连起 来，用于导入一个合适的宿主。这一相伴的DNA取决于宿主的特性，DNA 导入宿主的方式以及需要附加型维持还是整合。
通常将DNA插入一个表达载体，如质粒，使之处于适当的定向和读框 中以用于表达。如果需要时可将DNA连接到被所需宿主识别的适当的转录 和翻译调节控制核苷酸序列上，尽管这种控制通常在表达载体是可得的。然 后将这一载体通过标准技术导入宿主。一般来说不是所有宿主会被这一载体 转化。因此，需要选择转化的宿主细胞。一种选择技术涉及到将一段DNA 序列，连同在转化细胞中编码一个可选择性状，如抗生素抗性的任何必要的 控制元件掺入表达载体中。或者，这种可选择性状的基因可在另一个载体上， 这一载体可用于共转化所需的宿主细胞。
通过本发明的重组DNA转化的宿主细胞然后培养足够的时间，并且在 本领域熟练技术人员所知的适当条件下，还考虑到此处所公开的内容，使之 进行多肽的表达，多肽可随后被分离。
已知有很多表达系统，包括细菌(如大肠杆菌和枯草杆菌)(Bacillus subtilis)、酵母(如啤酒糖酵母)，丝状真菌(如曲霉)，植物细胞、动物细胞和 昆虫细菌。
载体包括一个原核生物复制子，如ColElori，用于原核生物中的增殖， 即使该载体也用于在其他非原核生物的细胞类型中进行表达。这些载体也可 包括一个适当的启动子，如一个原核生物的的启动子，它能引导转化了基因 的细菌性宿主细胞，如大肠杆菌中的这些基因的表达(转录和翻译)。
一个启动子是由一段DNA序列形成的表达控制元件，该序列允许RNA 聚合酶结合和转录的发生。在含有方便的限制性位点以用于本发明DNA片 段插入的质粒载体中，通常提供与典型细菌宿主相容的启动子序列。
典型的原核生物载体质粒是从Biorad实验室(Richmond，CA，USA)可得 的pUC18，pUC19，pBR322和pBR329，以及从Pharmacia(Piscataway，NJ.USA) 可得的pTrc99A和pKK223-3。
典型的哺乳动物细胞载体质粒是可从Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)可 得的pSVL。这一载体用SV40晚期启动子驱动克隆的基因的表达，发现的 最高量的表达在产生T抗原的细胞中，如COS-1细胞。
可诱导的哺乳动物表达载体的一个例子是pMSG，它也可从Phamacia 可得。这一载体用小鼠乳腺肿瘤病毒的长末端重复序列的糖皮质激素可诱导 的启动子，以驱动克隆的基因的表达。
有用的酵母质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，它们通常可从 Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA中获得。质粒pRS403、 pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIps)，并且掺入酵母可选择 的标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质 粒(YCps)。
已研制各种方法通过互补粘性末端可切实地将DNA与载体连接起来。 例如，可将互补的同聚体片段加入将要插入载体DNA的DNA片段。载体 和DNA片段然后通过互补同聚体尾部之间的氢键连接起来，以形成重组 DNA分子。
含有一个或多个限制性位点的合成接头提供了另一种将DNA片段连接 载体的方法。如较早时所描述的，通过内切酶的限制性消化所产生的DNA 片段用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这两种酶用其 3′-5′核酸外切活性去掉突出的3′单端末端，并用其聚合活性补上凹陷的3′ 末端。
因此这些活性结合产生了平末端的DNA片段。这些平末端的片段在一 种能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶存在下，与大 摩尔数的过量连接头分子一起培养。因此反应的产物是在其末端带有聚合连 接头序列的DNA片段。这些DNA片段然后用适当的限制酶酶切，并连接 到一个表达载体上，该载体已经过能产生与那些DNA片段相容末端的酶的 酶切。
含有各种限制性内切酶位点的人工接头可从许多来源购得，包括 International Biotechnologies Inc.New Haven，CN，USA。
修饰编码本发明多肽的DNA的合乎需要的方法是使用如Saiki等(1988) 在“科学”(Science)239，487-491中所公开的聚合酶链反应。
在这一方法中，将要酶学扩增的DNA旁侧有两个特异的寡核苷酸引物， 引物本身掺入扩增的DNA中。所述特异性引物含有限制性内切酶识别位点， 这些位点可通过本领域所知的方法用于克隆入表达载体。
这些基因的变体也构成了本发明的部分。优选为变体与本发明方法所分 离的基因至少有70％序列相同，更优选为至少85％序列相同，最优选为至 少95％序列相同。当然置换、缺失和插入是耐受的。一个核酸序列和另一个 核酸序列之间的相似性程序可用威斯康星大学计算机组的GAP程序确定。
同样地还包括了由这些基因编码的蛋白质变体。
“变体”包括插入、缺失和替换，无论是保守性的或非保守性的，其中 的变化没有本质上改变该蛋白质的正常功能。
“保守性取代”指以下一组合，如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu； Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。
这些变体可用熟练的蛋白质工程和定点诱变的方法进行制备。
本发明的第九方面提供了鉴定一个化合物的方法，该化合降低微生物适 应一个特殊环境的能力，该方法包括挑选一种干扰以下二种物质功能的化合 物的步骤：(1)由本发明第二方面的方法所得的基因或(2)由这一基因编码的 多肽。
成对筛选那些化合物，使它们能影响野生型细胞，但不影响超量生产本 发明方法所分离的基因的细胞，这一筛选构成了本发明这一方面的部分。
例如，在一个实施例中，一种细胞是野生型细胞，第二种细胞是沙门氏 菌，它是被构建以超表达本发明方法所分离的基因。在所要测定的化合物存 在下，测定特殊环境中的每个细胞的生存力和/或生长，以确定哪种化合物降 低了野生型细胞的生存力和生长，但不降低超表达所述基因的细胞的这些特 性。
优选为这一基因是一个毒力基因。
例如，在一个实施例中，制备微生物(如鼠伤寒沙门氏菌)的超表达用本 发明第一方面的方法所鉴定的毒力基因。将(a)超表达的微生物和(b)相当的微 生物(不超表达该毒力基因)用于感染培养的细胞。通过测定所试化合物的量 确定这一特殊的试验化合物是否会选择性地抑制毒力基因的功能。该化合物 是防止宿主细胞被(a)超表达微生物和(b)相当的微生物感染所必需的(至少对 一些毒力基因产物来说，可以设想试验产物通过与毒力基因产物结合使这些 产物失活，同时其本身也失去活性。如果防止由(a)引起感染比防止由(b)引起 感染所需更多的该化合物，那么这就表明这一化合物是选择性的。优选为微 生物(如沙门氏菌)被一种温和的抗生素，如庆大霉素(它不渗透宿主细胞)胞 外杀灭，并且所试化合物对防止细胞被微生物感染的作用是通过裂解所述细 胞和测定有多少微生物存在来进行(如植板于琼脂上)。
成对筛选和其他筛选化合物的方法通常披露于Kirsch & DiDomenico(1993)的“具有治疗潜力的天然产物的发现”(The Discovery of Natural Products with a Therapeutic Potential)(V.P.Gallo编)第六章PP177- 221，Butterworths，V.K.(引文此文作为参考)。
成对筛选可以设计成很多相关形式，其中用两个遗传上相关的菌株比较 对一种化合物的相对敏感性。如果菌株的差别在单个位点上，那么特异于该 靶位点的化合物可通过比较每一菌株对抑制剂的敏感性而得到鉴定。例如， 对靶位点特异的抑制剂对起敏感试验菌株比其他方面同基因的“姐妹”菌株 更有活性。在琼脂扩散形式的试验中，这一活性的大小是通过测定药敏纸片 或带有化合物孔周围的抑制区大小来确定的。由于扩散作用，建立了化合物 连续浓度梯度，菌株对抑制剂的敏感性与纸片或孔到抑制区边缘的距离呈正 比。
普通的抗微生物剂，或作用方式不同于所需方式的微生物通常观察到具 相似的抗两种菌株的活性。
另一类型的分子遗传筛选，涉及菌株对，其中克隆的基因产物在一个菌 株中与对照菌株相比是超表达的。这类测定的基本原理是：含有增加量的靶 蛋白的菌株应比含正常靶蛋白量的同基因菌株对于特异于克隆的基因产物 的抑制剂更具抗性。在琼脂扩散试验中，超表达靶蛋白的菌株的特定化合物 周围的抑制区比其他方面相同的同基因菌株要小。
另外的或其他的选择一种化合物是通过如下步骤获得的：
1.采用本发明第一方面的方法所得的突变体微生物用作为对照(它有一 个给定的表型，如无毒性)。
2.要测试的化合的与野生型微生物相混合。
3.将野生型微生物导入环境(含有或不含试验的化合物)。
4.如果这一野生型微生物不能适应于这一环境(经化合物处理，或在化 合物存在下)，则这一化合物是一种降低微生物在特殊环境中适应能力或存 活能力的化合物。
当这一环境是动物体，并且这一微生物是一种病原微生物时，用这一方 法鉴定的化合物可用作药剂，以防止或减轻这一微生物的感染。
本发明的第十方面因而提供了一种可用第九方面方法鉴定的化合物。
人们会意识到第十方面的化合物的运用涉及到可鉴定该化合物的方法， 并且特别涉及病原微生物的宿主。例如，如果这个化合物通过用毒力基因或 其编码的多肽方法，在感染哺乳动物的细菌中是可鉴定的，那么这一化合物 可用于治疗由这一细菌引起的哺乳动物感染。
同样地，如果这个化合物通过用毒力基因或其编码的多肽方法，在感染 植物的真菌中是可鉴定的，那么这一化合物可用于治疗由这一真菌引起的植 物感染。
本发明第十一方面提供了一个分子，它有选择地与本发明第七方面的基 因或其核酸产物作用，并实质上抑制该基因或产物。
“其核酸产物”包括任何从该基因转录而来的RNA，特别是mRNA。
优选的选择性与所述基因或所述核酸产物作用，并且实质上抑制其功能 的分子为反义核酸或核酸衍生物。
更优选的是所述分子为反义寡核酸苷酸。
反义寡核苷酸为单链核酸，它能特异地结合到互补的核酸序列。通过与 适当的靶序列结合，形成了RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA双链 体。这些核酸常被称为“反义”，因为它们互补于这一基因的有义链或编码 链。最近，已证实在寡核苷酸结合于DNA双链体处可能形成三股螺旋。已 发现寡核苷酸能够识别DNA双螺旋主沟中的序列。因此形成一个三股螺旋。 这表明有可能合成序列特异性分子，这些分子通过识别主沟氢的结合位点特 异结合双链DNA。
显然，反义核酸或寡核苷酸的序列可很容易地通过参照该基因的核苷酸 序列而确定。例如，反义核酸或寡核苷酸可以设计成互补于图11或图12所 示序列的一部分，特别是形成毒力基因一部分的序列。
寡核苷酸易被细胞内源性核酸酶降解或灭活。为对付这一问题，有可能 采用修饰的寡核苷酸，如改变核苷酸之间的连接，其中用另一种连接替代天 然产生的磷酸二酯连接。例如，Agrawal等(1988)在“美国国家科学院院刊” (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85，7079-7083中表明用寡核苷酸氨基磷酸酯和硫 代磷酸酯可增强HIV-1组织培养的抑制。Sarin等(1988)在“美国国家科学 院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85，7448-7451中证明了用寡核苷酸甲基 膦酸酯可增强HIV-1的抑制。Agrawal等(1989)在“美国国家科学院院刊” (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，7790-7794中显示在早期感染和慢性感染的细 胞培养物中，用核苷酸序列特异的寡核苷酸硫代磷酸酯可抑制HIV-1复制。 Leither等(1990)在“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，3430 -3434中报告了用寡核苷酸硫代磷酸酯抑制流感病毒复制的组织培养物。
带有人工连接的寡核苷酸已显示出对体内降解具抗生。例如，Shaw等 (1991)在“核酸研究”(Nucleic Acids Res.)19，747-750中报道了当其他方面 未作修饰的寡核苷酸在3′末端被某些加帽结构阻遏时，这些核苷酸在体内对 核酸酶变得较有抗性，并且那些未加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯在体内不被降 解。
合成寡核苷酸硫代磷酸酯的H-膦酸酯方法的详细描述由Agrawal和 Tang在(1990)在“四面体快报”(Tetrahedron Letters)31，7541-7544中提供， 其所述内容引入此文作为参考。寡核苷酸甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷 酸酯、磷酸酯、桥连氨基磷酸酯和桥连硫代磷酸酯的合成是本领域已知的。 例如见Aggrawal和Goodchild(1987)的“四面体快报”(Tetrahedron Letters)28， 3539；Nielsen等(1988)的“四面体快报”(Tetrahedron Letters)29，2911；Jager 等(1988)“生物化学”(Biochemistry)27，7237；Uznanski等(1987)“四面体快 报”(Tetrahedron Letters)28，3401；Bannwarth(1988)“赫尔维齐化学条例” (Helv.Chim.Acta.)71，1517；Crosstick和Vyle(1989)“四面体快报”(Tetrahedron Letters)30，4693；Agrawal等(1990)“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci USA)87，1401-1405，其内容引入此文作为参考。用于合成或生产的其他方 法也是可能的。尽管核糖核酸(RAN)序列也可以合成和应用，但优选实施例 中的寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
本发明中有用的寡核苷酸优选是设计来抗内源性溶核酶的。寡核苷酸体 内降解产生长度变短的寡核苷酸降解产物。这种降解的产物更可能产生非特 异性杂交，相对于其全长的对应物来说可能不太有效。因此需要用能抗体内 降解的寡核苷酸，并且它们能够到达靶细胞。通过用一个可多个内部的人工 核苷酸间连接替代原来就存在的磷酸二酯连接，如在连接中用硫替代磷酸 酯，可以使这些寡核苷酸对体内降解产生更强抗性。可使用的连接的例子包 括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸酯、羰基、二硫代磷酸酯、各种氨基 磷酸酯、磷酸酯、桥连的二硫代磷酸酯和桥连的氨基磷酸酯。这些例子是用 于说明的而非用于限制，因为其他的核苷酸之连接是本领域所知的。例如， 见Cohen(1990)的“生物工程进展”(Trends in Biotechnology)。合成含有一个 或多个这种连接的寡核苷酸的方法为本领域所熟知，而这些连接是用于替代 磷酸二酯核苷酸间连接的。这一合成方法包括产生具有混合核苷酸间连接的 合成途径。
可用内源性酶通过“加帽”使寡核苷酸抗延伸，或在5′或3′末端核苷酸 中掺入相似的基团以达到这一目的。用于加帽的试剂是可购得，如Applied Biosystems Inc，Foster City，CA的Amino-LinkIITM。加帽的方法如见Shaw 等(1991)“核酸研究”(Nucleic Acis Res.)19，747-750和Agrawal等(1991)“美 国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci USA)88(17)，7595-7599，这些内容 引入此文作为参照。
使寡核苷酸抗核酸酶攻击的还有一个方法是使这些核苷酸“自我稳定”， 见Tang等(1993)在“核酸研究”(Nucl.Acids Res.)21，2729-2735中的描述， 引入此处作为参考。自我稳定的寡核苷酸在其3′端有发夹环结构，并显示出 对蛇毒液磷酸二酯酶，DNA聚合酶I和胎牛血清的降解的抗性增强。寡核苷 酸自我稳定区不影响与互补核酸的杂交，小鼠中的药物动力学和稳定性研究 表明自我稳定的寡核苷酸比其线性的对应物在体内的稳定性要高。
按照本发明，通过限制反义化合物对人体内倾向位点的可获得性，使较 低剂量被应用以及尽可能减小系统的影响，以增强碱基配对为特征的反义寡 核苷酸的固有结合特异性。因此，局部应用寡核苷酸以获得所需效果。在所 需位点的寡核苷酸浓度大大高于全身应用的寡核苷酸，并且可用显著低的总 量取得治疗效果。局部高浓度的寡核苷酸增强了靶细胞的渗透和有效地阻遏 了靶核苷酸序列的翻译。
寡核苷酸可通过任何适合于局部用药的方法送至该位点。例如，可将寡 核苷酸溶液直接注射至位点，或用一个灌注泵灌注传送。也可以将寡核苷酸 整入一个可植入的装置中，然后将该装置放于所需位点，使寡核苷酸释放至 周围。
寡核苷酸最优选的是通过水凝胶物质施用，水凝胶是非炎症性的和生物 可降解的。现在已知有许多这样的物质，包括那些从天然和合成聚合物所制 成的物质。在一个优选的实施例中，本方法应用了一种水凝胶，它在体温以 下处于液态，但在体温或接近体温时为凝胶，能形成一种保持形状的半固体 水凝胶。优选的水凝胶是以乙烯氧化物一丙烯氧化物为重复单元的聚合物。 聚合物的特性取决于聚合物的分子量和聚合物中聚乙烯氧化物和聚丙烯氧 化物的相对百分比。优选的水凝胶含有约10-80％重量的乙烯氧化物和约 20-90％重量的丙烯氧化物。特别优选的水凝胶含有约70％聚乙烯氧化物和 30％聚丙烯氧化物。可以使用的水凝胶例如可从BASF Corp Parsippany，NJ 获得，商品名为PluronicR。
在这一实施例中，冷却水凝胶至液态，并将寡核苷酸混入液体中至浓度 达到约每克水凝胶中1mg寡核苷酸。所得的混合物然后应用于要处理的表 面，例如可通过在手术过程中喷洒或涂布，或使用一个导管或内窥镜的方法。 随着聚合物变焦，它固体而形成凝胶，经过一段时间寡核苷酸扩散出凝胶而 进入周围细胞，这段时间取决定凝胶的确切组分。
寡核苷酸可通过可购得的或描述于科学文献的其他植入剂，包括脂质 体、微胶囊和可植入的装置的方法应用。例如，由可生物降解的物质组成的 植入剂，如聚酐、多正酯类、聚乳酸和多羟乙酸以及共聚物、胶原和蛋白质 聚合物，或者象乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、聚乙酸乙烯酯、乙烯乙酸乙醇和其 衍生物可用于局部释放寡核苷酸。在采用熔化或溶剂蒸发技术或与物质的机 械混合进行聚合化或固化时，可将寡核苷酸掺入这一物质中。在一个实施例 中，混入寡核苷酸或用于可植入装置，如葡聚糖包被的二氧化硅珠、展布剂 或导管的涂层上。
寡核苷酸的剂量取决于寡核苷酸的大小和应用它的目的。通常根据要治 疗的组织的表面积计算剂量范围。寡核苷酸的有效剂量多少取决于寡核苷酸 的长度和化学组分，但通常的范围为每平方厘米组织表面积中含30-3000 μg。
寡核苷酸可以全身性地用于患者，以作为治疗和预防的目的。可通过任 何有效方法用寡核苷酸，如通过注射(如静脉、皮下、肌肉)或通过口、鼻或 其他能使寡核苷酸到达患者血液并在血流中循环的方法。全身使用的寡核苷 酸优选为同局部使用的寡核苷酸一起应用，但在没有局部应用的情况下也有 功效。对一个成年人来说，通常每次0.1-10g范围的剂量对这一目的来说是 有效的。
人们会认识到本发明这一方面的分子可用于治疗或防止由一种微生物 或与其密切相关的微生物所引起的任何感染。从这种微生物中分离到所述基 因。因此，所述分子是一种抗生素。
因此，本发明的第十二方面提供了本发明第十一方面的一种分子，以用 于药物。
本发明的第十三方面提供了治疗宿主的一种方法，该宿主受到一种微生 物的感染或易被其感染，这一方法包括按照本发明第十一方面应用有效量的 一种分子，其中所述基因存在于所述微生物，或其紧密相关的微生物。
“有效的量”我们指能够实质上防止或减轻感染的量。“宿主”包括任 何能被微生物感染的动物或植物。
人们会认识到本发明的第十一方面的分子的药物制剂构成了本发明的 一部分。这种药物制剂包含所述分子以及一种或多种可接受载体。载体必须 是“可接受的”，即能与本发明所述的分子共容而对其受体无害。通常载体 为无菌和无热原的水或盐水。
如上所提到的，以及如同以下实施例4中更详细描述的，我发现某些毒 力基因聚于我称之为VGC2的沙门氏菌染色体的一个区域。DNA-DNA杂 交实验确定了与至少一部分VGC2同源的序列存在于很多种和沙门氏菌的 菌株中，但在所试的大肠杆菌和志贺氏菌菌株中没有出现(见实施例4)。这 些序列几乎肯定相关于保守基因，至少在沙门氏菌中，并且至少其中的一些 为毒力基因。人们认为在其他沙门氏菌中的相应基因，以及如果存在的其他 肠细菌或其他细菌的相应基因也是毒力基因。
很容易确定VGC2区内的基因是否是一个毒力基因。例如，经用本发明 第二方面的方法(当应用鼠伤寒沙门氏菌，和其中的环境是一个动物，如小 鼠时)鉴定的VGC2内的那些基因是毒力基因。毒力基因的鉴定也可以通过 在基因内构建一个突变(优选为非极性突变)和测定该突变株是否为无毒性进 行。在所选的基因中构建突变的方法为人所熟知，并描述如下。
本发明第十四方面提供了鼠伤寒沙门氏菌的VGC2 DNA或其部分，或 所述DNA的一个变体或其部分的一个变体。
鼠伤寒沙门氏菌的VGC2 DNA图示于图8，并且根据实施例4所提供 资料很容易从鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(可从美国典型培养物保藏中心， 12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA获得；也保藏于NCTC， Public Health Laboratory Service，Colindale，UK，编号NCTC 12021)中获得。 例如，来自图11和图12序列的探针可用于鉴定来自鼠伤寒沙门氏菌基因组 文库的入克隆。可用采标准的基因组行走方式获得所有的VGC2 DNA。示于 图8的限制性酶谱可用于鉴定和定位来自VGC2的DNA片段。
“鼠伤寒沙门氏菌的VGC2 DNA的部分”指任何的DNA序列，其中 包括VGC2中的至少10个核苷酸，优选为至少20个核苷酸，再优选的至少 50个核苷酸，更优选的为至少100个核苷酸，最优选为至少500个核苷酸。 VGC2 DNA的特别优选部分为示于图11的序列或其一部分。另一个特别优 选的VGC2 DNA的部分为示于图12的序列或其一部分。
有利的是VGC2 DNA的部分为一个基因或其部分。
用本技术领域所知的计算机程序通过统计分析开读框，可在VGC2区内 鉴定基因。如果开读框大于100个码密子，那么这可能是一个基因(虽然已 知有比这小的基因)。可通过实验测定一个开读框是否对应于基因的多肽编 码区。例如，对应于开读框的DNA的一部分可用作northern(RNA)印迹的探 针，以测定与所述DNA杂交的mRNA是否表达；替代或另外的方法是将突 变引入开读框，就能测定突变对微生物表型的影响。如该表型发生改变，那 么这一开读框对应于一个基因。在DNA序列内鉴定基因的方法为本领域所 知。
“所述DNA的变体或其部分的一个变体”包括了本发明第七方面的“变 体”一词所定义的任何变体。
因此，鼠伤寒沙门氏菌的VGC2 DNA的变体包括来自其他沙门氏菌， 如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的相 应的基因或其部分，以及来自其他细菌，如其他肠细菌的相应基因或其部分。
“相应的基因”包括那些功能上相同的基因和那些其中的突变导致相似 表型(如无毒性)的基因。人们会认识到在本发明之前，VGC2或其内所含的 基因尚未被鉴定，当然也没有涉及到毒力的测定。
因此，本发明还有的方面提供了一种突变细菌，其中如果这种细菌正常 情况下含有一个与VGC2中的基因相同或相应的基因，那么在所述突变细菌 中所述基因是突变的或不存在；构建一个突变细菌的方法，其中如果该细菌 正常情况下含有一个与VGC2中基因相同或相应的基因，那么在所述突变细 菌中所述基因是突变的或不存在。以下是灭活一个VGC2基因的优选的方 法。首先，用在杂交实验中作为一个探针的VGC2的一个片段，从沙门氏菌 λDNA文库或其他DNA文库中亚克隆DNA片段上的这个基因，对该基因 的限制酶位点作图，并在大肠杆菌中通过DNA片段上的这个基因，对该基 因的限制酶位点作图，并在大肠杆菌中通过DNA测序描述该基因。可能在 用限制酶删去克隆的基因的编码区一部分之后，用限制性酶然后将编码抗生 素(如卡那霉素)抗性的DNA的一个片段导入该基因的编码区。可采用一些 方法和含抗生素抗性标记的DNA构建体，以保证感兴趣基因的灭活优选为 非极性的，也就是说，不影响到感兴趣基因的下游基因的表达。基因的突变 体形成通过噬菌体P22转导作用从大肠杆菌转至鼠伤寒沙门氏菌中，并且转 导体通过Southern杂交检查突变基因同源重组入染色体的情况。
这一方法常用于沙门氏菌中(可用于伤寒沙门氏菌)，进一步的详细内容 可见于许多论文中，包括Galan(1992)174，4338-4349的文章。
还有的方面提供了所述突变体细菌在疫苗中的应用；含有所述细菌和药 学上可接受载体的药物组合物；由鼠伤寒沙门氏菌的VGC2 DNA或其部分 所编码的一个多肽，或其部分的一个变体；一种鉴定能使细菌在宿主体内感 染或导致疾病能力下降的化合物的方法；可用所述方法鉴定的一种化合物； 有选择性地与VGC2中的一个基因或其核酸产物作用，并能实质抑制其功能 的一种分子；医学上用途和其药物组合物。
VGC2 DNA含有已用本发明第一和第二方面的方法鉴定的基因，以及 通过其位置鉴定的基因(虽然可通过本发明第一和第二方面的方法鉴定)。本 发明还有一些方面密切相关于本发明的第四、五、六、七、八、九、十、十 一、十二和十三方面，因此，关于这些方面所给的资料和表达的优选直接与 这些方面有关。
优选为该基因来自VGC2或是来自沙门氏菌另一种，如伤寒沙门氏菌的 相应的基因。优选为突变体细菌是鼠伤寒沙门氏菌，或者是沙门氏菌另一个 种，如伤寒沙门氏菌的一个突变体。
据认为至少VGC2中有些基因传送细菌，如鼠伤寒沙门氏菌进入细胞的 能力。
本发明包括：
项1.一种鉴定对稳定环境适应性下降的微生物的方法，包括步骤：
(1)将一种核酸导入各种不同的微生物，其中的每种微生物通过一个基 因的插入失活而独立发生突变，其中的核酸含有一段单一标记序列，因而每 种突变体含有不同的标记序列，或所述微生物的克隆；
(2)提供由步骤(1)生成的每个突变体的单独保存样品，提供含有来自每 个单独突变体的单一标记序列的单独保存核酸；
(3)将由步骤(1)产生的各种突变体导入所述的特定环境中，并使那些能 导入特定环境的微生物在所述环境中生长；
(4)从所述环境中取回微生物或取回所选择的其中一部分微生物，并从 取回的微生物中分离核酸；
(5)将步骤(4)中分离的核酸的任何标记序列，与步骤(2)保存的每个单独 突变体的单一标记序列相比较；以及
(6)选择一个单独的突变体，使其不含步骤(4)所分离的任何标记序列。
项2.项1的一种方法，其中步骤(1)限定的微生物的种类由不同种类的 微生物，产生而来每一种微生物含有一种核酸，该核酸又包含着单一标记序 列，通过从第一种给定的条件改变第二种给定的条件而产生。其中(a)在第一 种给定条件下，含有一个单一标记的所述核酸以附加体形式维持，(b)在第二 种给定条件下，含有单一标记序列的所述核酸使一个基因插入失活。
项3.项1或2的一种方法，还包括步骤：
(1A)从步骤(1)产生的各种突变体中取出营养型缺陷；或
(6A)测定步骤(6)所选的突变体是否为营养缺陷型；或同时含有(1A)和 (6A)。
项4.一种鉴定使一种微生物适应于特定环境的基因的方法，该方法包 括项1-3中任一项的方法，接着的步骤为：
(7)从步骤(6)所选的单个突变体中分离插入灭活的基因。
项5.项4的一种方法，还包括步骤：
(8)用步骤(7)分离的插入灭活基因作为探针，从野生型微生物中分离相 应的野生型基因。
项6.如项1-5中任一项的一种方法，其中特定的环境是一个分化的多 细胞生物。
项7.项6的一种方法，其中的多细胞生物是植物。
项8.项6的一种方法，其中的多细胞生物是非人的动物。
项9.项8的一种方法，其中该动物是小鼠、大鼠、兔子、狗或猴子。
项10.项9的一种方法，其中的动物是小鼠。
项11.项6-10中任一项的方法，其中在步骤(4)中，微生物从远离步骤 (3)的导入位点的所述环境中取回。
项12.如项8-10中任一项的方法，其中在步骤(3)中，该微生物是以 口服或腹膜内途径导入。
项13.项12的一种方法，当依据项8或9时，其中步骤(4)的微生物取 自脾脏。
项14.上述项任一项中的方法，其中的微生物是一种细菌。
项15.项1-13中任一项的方法，其中的微生物是一种真菌。
项16.项7的方法，其中的微生物对植物是一种细菌性病原。
项17.项7的方法，其中的微生物对植物是一种真菌性病原。
项18.项8-10任一项中的方法，其中的微生物对动物是一种细菌性病 原。
项19.项8-10任一项中的方法，其中的微生物对动物是一种真菌性病 原。
项20.项18的一种方法，其中的细菌是以下任一种：百日咳博德特氏 杆菌(Bordetella pertussis)、Campylobacter jejuni、肉毒梭状芽孢杆菌 (Clostridium botulinum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、杜克氏嗜血杆菌 (Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、Helicobacter pylori、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、Legionella pneumophila、 利斯特氏菌(Listeria spp.)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈 瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、沙门氏菌 (Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、弧菌(Vibrio spp.)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
项21.项19的方法，其中该真菌是曲霉(Aspergillus spp.)、新型隐球菌 (Cryptococus neoformans)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的任一 种。
项22.如上述项任一项中的方法，其中步骤(1)的基因是通过转座子或 转座子相类似的元件或其他带有单一标记序列的DNA序列的插入灭活而得 到的。
项23.如上述项任一项中的方法，其中步骤(1)的各个不同的标记序列 两侧为各所述核酸中共同的序列。
项24.项23的一种方法，其中在步骤(2)中，含有单一标记的核酸是采 用DNA扩增技术和与所述的共同序列杂交的寡核苷酸的引物进行分离的。
项25.项23或24的方法，其中在步骤(4)中含有各种所述标记序列的 核酸是采用DNA扩增技术和与所述共同序列杂交的寡核苷酸引物进行分离 的。
项26.采用上述项任一项中的方法所得到的微生物。
项27.一种微生物，包含基因中的一个突变，该基因是通过项5的方法 鉴定的。
项28.项26所得的一种微生物，当根据项8或27以用于疫苗时。
项29.项26的含有一种微生物的疫苗，当根据项8或项27和一种药学 上可接受的载体。
项30.用项4或项5的方法所得的一个基因。
项31.项30的一个基因，它从鼠伤寒沙门氏菌基因组中分离，并在严 格条件下与图6所示序列杂交。
项33.由一个基因编码的一种多肽，该基因如项30-32中任一项所述。
项34.一种鉴定化合物的方法，该化合物能使微生物对特定环境的适应 能力下降，该方法包括筛选出干扰如项30-32中任一项中基因或如项33的 一种多肽的功能的一种化合物。
项35.可用项34的方法鉴定的一种化合物。
项36.项35的一种化合物，其中的特定环境为一个宿主生物体。
项37.项36的一种化合物，其中的宿主生物为一种值物。
项38.项36的一种化合物，其中的宿主生物是一种动物。
项39.使用如项36-38中任一项的化合物，用所述微生物治疗所述宿 主生物的感染。
项40.一种分子，它可以有选择地作用于如项30-32任一项中的一个 基因或其核酸产物，并且基本抑制该基因或其核酸产物的功能。
项41.项40的一种分子，它是一种反义核酸或核酸的衍生物。
项42.项40或41的一种分子，它是一种反义寡核苷酸。
项43.项40-42中任一项的一种分子，它用于药物。
项44.治疗微生物感染的宿主或对微生物易于感染的宿主的一种方法， 该方法包括应用有效量的如项36或40所述的分子或化合物，其中所述基因 存在于所述微生物，或所述微生物相似亲缘关系的生物中。
项45.一种药物组合物，它含有项38或40的一种分子或化合物，以及 一种药学上可接受的载体。
项46.鼠伤寒沙门氏菌VGC2 DNA，或其一部分，或者为所述DNA的 一种变体或其部分的变体。
项47.一种突变体细菌，其中当该细菌正常含有与VGC2中的一个基因 相同或相应的基因时，那么所述基因是一个突变体或在所述突变体细菌中不 存在。
项48.一种制备项47的细菌的方法。
项49.将项47的一种突变体细菌用于疫苗。
项50.一种药物组合物，其中含有项47的一种细菌和一种药物上可接 种的载体。
项51.由鼠伤寒沙门氏菌的VGC2 DNA编码的一种多肽，或其一部分， 或者是所述多肽的一个变体或其一部分的变体。
项52.鉴定一种化合物的一种方法，该化合物降低宿主中细菌感染或引 起疾病的能力，该方法包括选择一种化合物，使之干扰如项46的VGC2中 的一个基因或如项51的一种多肽的功能。
项58.可用项52的方法鉴定的化合物。
项54.一种分子，它可选择性地与鼠伤寒沙门氏菌的VGC2中一个基因 或其核酸产物作用，并且基本上抑制该基因或其核酸产物的功能。
项55.一种分子或化合物，如项53或54所述用于药物。
项56.公开于此的任何新颖的特征或特征的组合。
现参考以下的实施例和图说明本发明，其中：
图1为图示说明本发明一个特别优选的方法。
图2示来自几个鼠伤寒沙门氏菌接合后体的DNA经EcoRV消化后的 Southern杂交分析。滤膜用微型Tn5转座子的卡那霉素抗性基因探测。
图3示来自半个微量滴定皿(A1-H6)的48个鼠伤寒沙门氏菌接合后体 DNA的菌落印迹杂交分析。滤膜用一个含经标记的扩增标记物的一个探针 进行杂交，其中的标记物来自头24个菌落(A1-D6)的库中分离的DNA。
图4示一个微量滴定皿(A1-H11)的注入小鼠的95个鼠伤寒沙门氏菌接 合后体的DNA菌落印迹杂交分析。影印的滤膜与经标记的扩增的来自库(接 种物模式)标记物杂交，或与经过标记的扩增的、从10000多个集中的菌落 中分离的DNA来的标记物杂交，其中这些菌落从感染动物(脾脏模式)的脾 中分离。菌落B6、A11和C8在两套滤膜上都出现弱杂交信号。A3、C5、 G3(aroA)和F10的杂交信号出现于接种模式，而在脾脏模式中没有。
图5示用本发明方法分离的沙门氏菌基因的序列，和该序列与大肠杆菌 clp蛋白酶基因组的比较。
图6示用本发明方法分离的进一步的沙门氏菌基因的部分序列(序列8 -36)
图7示鼠伤寒沙门氏菌染色体上VGC2的作用。(A)来自VGC2五个区 域的DNA探针用于一套鼠伤寒沙门氏菌株裂解物的Southern杂交分析，这 些探针位于Mud-P22原噬菌体。图中显示了与7.5kb PstI片段(图8中探针 A)杂交的裂解物。其他两个所用的探针与同一个裂解物杂交。(B)示插入点 和噬菌体的包装方向以及详细的图谱位置(第八版，实施例4中的文献22)。 噬菌体的指代相应于下列菌株：18P，TT15242；18Q，15241；19P，TT15244； 19Q，TT15243；20P，TT15246和20Q，TT15245(实施例4中文献)，已作出图 的基因位置用水平线段表示，还标明了其他基因的大约位置。
图8示VGC2的物理和遗传图谱。(A)16个转座子插入位置示于线上方。 VGC2的范围以粗线表明。实施例4的正文中所述的ORFs转录的位置和方 向以线下方箭头，连同相似基因的名称表示，只有ORFs12和ORFs13是例 外，它们的产物分别相似于许多两个元件调节系统的传感物和调节元件。(B) 重叠克隆和来自Mud-P22原噬菌体的TT15244菌株的EcoRI/XbaI限制性 片段的位置以实心条表示。只有已作图的部分入克隆示于图中，并且克隆可 能会超出这些限定。(C)限制性位点的位置按如下标记：B，BamHI；E，EcoRI； V，EcoRV；H，HindIII；P，PstI和X，XbaI。在图7中作为探针的7.5kb的PstI 片段(探针A)和在图10中作为探针的2.2kb的PstI/HindIII片段(探针B)的位 置示于限制性图谱下方。序列1(描述于图11)和序列2(描述于图12)的位置用 细箭头表示(标记的序列1和序列2)。
图9示VGC2边界的作图。(A)位于大肠杆菌K12染色体上的37′-38′ 的作图基因位置与鼠伤寒沙门氏菌LT2染色体(30′-31′)的相应区域相比。 VGC2区的扩大图谱与11个鼠伤寒沙门氏菌(S.t.)的DNA片段一起显示，这 些片段用作探针(粗条)，用于产生这些片段的限制性位点有：B，BamHI；C， ClaI；H，HindII；K，KpnI；P，PstI；N，NsiI和S，SalI。与大肠杆菌(E.c.)基因 组DNA杂交的探针以“+”表示；不杂交的以“-”表示。
图10示VGC2在沙门氏菌中是保守的和特异的。沙门氏菌血清变型和 其他病原细菌的基因组DNA有PstI(A)，HindIII或EcoRV(B)进行限制，并 用入克隆7的2.2kbPstI/HindIII片段作为探针(图2的探针B)进行Southern 杂交分析。杂交滤膜并在严格(A)或非严格(B)条件下洗膜。
图11示VGC2从中心至左端的“序列1”的DNA序列(见图2中箭头 标记的序列1)。DNA翻译成总共6个读框和推断基因的起始和终止位置， 还表示了通过STM鉴定的各种突变体的转座子插入位置(序列37)。
通常以“*”表示一个终止密码子，需要时采用标准核苷酸多义密码子。
图12示VGC2(C簇)的“序列2”的DNA序列(见图2中箭头标示的序 列2)。DNA被译成总共6个读框和推断基因的起始和终止位置，还表示了 通过STM鉴定的各种突变体的转座子插入位置(序列38)。
通常以“*”表示一个终止密码子，需要时采用标准核苷酸多义密码子。
图7-12与实施例4最为相关。
实施例1：鉴定鼠伤寒沙门氏菌中的毒力基因
材料和方法
细菌菌株和质粒
鼠伤寒沙门氏菌菌株12023(相应于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的 菌株14028)来自国立典型培养物保藏中心(NCTC)(英国伦敦Calindale in Public Health Laboratory Service)。这一菌株的自发萘啶酮酸抗性突变体 (12023Nalr)由本实验室筛选。菌株12023的另一个衍生株-CL1509(aroA： Tn10)由Fred Heffron赠送。大肠杆菌菌株CC118λpir(Δ[ara-leu]，araD，Δ lacX74，galE，galK，phoA20，thi-11，rpsE，rpoB，argE(Am)recA1，λpir噬 菌体溶源体)和S17-1λpir(Tpr，Smr，recA，thi，pro，hsdR-M+，RP4：2 -Tc：Mu：Km Tn7，λpir)由Kenneth Timmis赠送。大肠杆菌DH5α用于 增殖含有鼠伤寒沙门氏菌DNA的pUC18(Gibco-BRL)和 Bluescript(Stratagene)质粒。质粒pUTmini-Tn5km2(de Lorenzo等，1990)由 Kenneth Timmis赠送。
半随机序列标记物的构建和连接
在寡核苷酸合成仪(AppliedBiosystems，型号380B)上合成寡核苷酸库 RT1(5′-CTAGGTACCTACAACCTCAAGCTT-[NK]20- AAGCTTGGTTAGAATGGGTACCATG-3′)(序列1)和引物P2(5′- TACCTACAACCTCAAGCT-3′)(序列2)，P3(5′-CATGGTACCCATTCTAAC -3′)(序列3)，P4(5′-TACCCATTCTAACCAAGC-3′)(序列4)和P5(5′- CTAGGTACCTACAACCTC-3′)(序列5)。双链DNA标记物从100μl体积的 PCR的RT1中制备，PCR中含1.5mMgCl2、50mMKCl和10mMTris-Cl(pH8.0)，用200pg RT1作为靶片段；各为250μM的dATP，dCTP，dGTP， dTTP；100PM的引物P3和P5；2.5U的Amplitaq(Perkin-Elmer Cetus)。热 循环的条件为95℃30s、50℃40s和72℃10s，循环30次。PCR产物用凝胶 纯化(Sambrook等，1989)，过elutipD柱(可从Schleicher和Schll获得)，用 KpnI消化然后连接到pUC18或pUTmini-Tn5km2中。用于连接的质粒用 KpnI消化，并用牛小肠碱性磷酸酶(Gibco-BRL)去磷酸化。连接前用凝胶 纯化线性化的质粒分子(Sambrook等，1989)，以去除消化中任何残留的未切 开的质粒DNA。连接反应中含质粒和双链标记物DNA各50ng，反应在含1 单位的T4DNA连接酶(Gibco-BRL)的体积为25μl的和酶一起提供的缓冲 液中进行。
连接反应在24℃下进行2小时。为测定来自质粒DNA自身连接或未切 开质粒NDA的细菌菌落所占的比例，进行了一个对照反应，其中连接反应 中省去双链标记DNA。在大肠杆菌CC118转化(Sambrook等，1989)后，不 产生氨苄青霉素抗性的细菌菌落，而在含双链标记DNA的连接反应中产生 185个菌落。
细菌的转化和交配
pUTmini-Tn5km2和双链标记DNA的几个连接产物同于转化大肠杆菌 CC118(Sambrook等，1989)。将约总共10,300个转化体积加在一起，并从中 提取质粒DNA以转化大肠杆菌S-17λpir(de Lorenzo和Timmis，1994)。 在交配实验中，将约40,000个氨苄青霉素抗性的大肠杆菌S-17λpir转化 体和鼠伤寒沙门氏菌12023Nalr分别进行培养，至光密度(OD)580达到1.0。 取每一培养物的子份(0.4ml)与5ml10mMMgSO4混合，并通过微孔滤膜(直径 0.45μm)。滤膜置于含M9盐(de Lorenzo和Timmis，1994)的琼脂表面上， 在37℃下培养16小时。细菌的分离是通过在液体LB培养基中37℃下振震 40分钟，并通过在含100μgml-1萘啶酮酸(以淘汰供体菌株)和50μgml-1卡 那霉素(以选择受体菌株)的LB培养基上涂布悬液以选择接合后体。通过将 萘啶酮酸抗性(nalr)和卡那霉素抗性(Kanr)菌落转至麦康凯乳糖指示培养基 (以区分大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)和含氨苄青霉素的LB培养基检查每一 接合后体。约有9％的nalr、kanr菌落对氨苄青霉素敏感，表明这些菌落来 自真正的转座作用(de Lorenzo和Timmis，1994)。将单个氨苄青霉素敏感的 接合后体保存在含LB培养基的96孔微量滴定皿。对于长期的保藏要在-80 ℃下，培养基中加入7％DMSO或15％的甘油。
突变体的表型特征
将突变体从微量滴定皿影印涂布于含有M9盐和0.4葡萄糖的固体培养 基(Sambrook等，1989)上，以鉴定营养缺陷型。通过低倍镜下镜检琼脂平板 上的菌落检测菌落粗糙型的突变体。
菌落印迹、DNA提取、PCR、DNA标记和杂交
对菌落印迹杂交，用48孔的金属复制器(Sigma)将接合后体从微量滴定 皿转至HybondN尼龙滤膜(Amersham，UK)上。该膜事先置于含50μgml-1卡 那霉素的LB琼脂表面。经37℃过夜培养，取支持细菌菌落的滤膜在室温下 干燥10分钟。按滤膜生产厂家的说明，用0.4N NaOH裂解细菌并用0.5N Tris-Cl pH7.0洗膜。通过用Stratalinker(Stratagene)的紫外线照射，将细菌DNA 固定至滤膜上。与32P标记的探针的杂交在如前所述的严格条件下进行 (Holden等，1989)。对于DNA提取，将鼠伤寒沙门氏菌转座子突变菌株生 长在微量滴定皿的液体LB培养基上，或生长在固体培养基上后重新悬浮于 LB培养基中。按照Ausubel等(1987)的溴化十六碳烷基三甲铵(CTAB)方法制 备总DNA。简单地说，将150-1000μl体积的细胞通过离心沉淀，并且重 新悬浮于576μl的TE。加入15μl的20％SDS和3μl20mgml-1的蛋白酶K。 经37℃下培养1小时，加入3M NaCl 166μl并充分混合，然后加入80μl 的10％(W/V)CTAB和0.7M NaCl。充分混合后，溶液培养在65℃下10分钟。 经过酚和酚-氯仿提取，加入异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗沉淀，并重 悬于TE中，使浓度为约1μg/μl。
DNA样品进行两轮PCR以产生标记的探针。第一个PCR在100μl反 应中进行，其中含20mM Tris-Cl pH8.3；50m MkCl；2mMMgCl2；0.01％ 吐温80；各200μM的dATP，dCTP，dGTP，dTTP；2.5单位的Amplitaq 聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)；P2和P4引物各770ng；和5μg靶DNA。经 过95℃4分钟的起始变性，热循环由20循环组成，每一循环为50℃45秒， 72℃10秒和95℃30秒。PCR产物用氯仿/异戊醇(24/1)提取并用乙醇沉淀。 将DNA重悬于10μl TE中，PCR产物通过1.6％Seaplague(FMC Bioproducts) 凝胶在TAE缓冲液中电泳纯化。切下含有约80bp片段的凝胶条，并用于第 二次PCR。这一反应总体积为20μl，其中含20mM Tris-Cl pH8.3；50mMkCl； 2mMMgCl2；0.01吐温80；各50μM的dATP，dTTP，dGTP；10μl32P- dCTP(3000Ci/mmol，Amersham)；P2和P4引物各150ng；约10ng靶DNA(1 -2μl的含第一轮PCR产物的1.6％ Seaplaque琼脂糖)；0.5单位的Amplitaq 聚合酶。反应物覆盖20μl矿物油，按上述方法进行热循环。放射性标记的 掺入以WhatmanDE81纸吸收进行定量(Sambrook等，1989)。
感染研究
将含有带标记的转座子的单个沙门氏菌接合后体，培养在微量滴定板的 培养基中，其中含2％胰化蛋白胨、1％酵母浸出膏、0.92％V/V甘油、0.5 ％Na2PO4、1％KNO3(TYGPN培养基)(Ausubel等，1987)，37℃过夜培养。 用一个金属复制器将少量的过夜培养物转至新鲜的微量滴定板，培养物在37 ℃下培养直至OD580值(用Titertek Multiscan微量滴定板读数仪测定)约为每 孔0.2。然后将各孔中的培养物合在一起，用分光光度计测定OD550。培养物 用灭菌盐水稀释至约5×105cfuml-1。再将稀释的液体涂布于含萘啶酮酸 (100mgml-1)和卡那霉素(50mgml-1)的TYGPN上，以证实接种物中出现的 cfu。
将三个一组的雌性BALB/c小鼠(20-25g)腹膜内注射0.2ml的细菌悬浮 液，其中含约1×105cfuml-1。接种后三天处死小鼠，取脾脏分离细菌。取每 个脾脏的一半在含1ml灭菌盐水的微量离心管中研磨。使细胞碎片沉淀，将 1ml在悬浮液中仍含有细菌的盐水置于一新管中，在微量离心机中离心2分 钟。取去上清液并将沉淀重新悬浮于1ml的灭菌蒸馏水中。用灭菌蒸馏水制 备稀释系列，将每种稀释液100μl涂布于含萘啶酮酸(100μgml-1)和卡那霉 素(50μgml-1)的TYGPN琼脂上。从含有1000-4000个菌落的平板上分离 细菌，将从每一个脾脏中分离的总共1000多个菌落加在一起，用于制备DNA 以用于PCR产生探针，筛选菌落印迹。
毒力基因克隆和DNA测序
从鼠伤寒沙门氏菌接合后体中分离总DNA，分别用SstI，SalI，PstI和 SphI消化。消化物通过琼脂糖凝胶分级，转至HybondN+膜(Amersham)，并 用pUTmini-TnSKm2的卡那霉素基因作为探针进行Southern杂交分析。探 针用地高辛配基(Boehringer-Mannheim)标记并按生产厂家的说明进行化学 荧光检测。杂交和洗膜条件如上所述。用产生3-5kb杂交片段的限制性酶 消化DNA，以用于制备性琼脂糖凝胶，将相应于杂交信号大小的DNA片段 从凝胶上切除，纯化和连接λpUC18。采用连接反应将大肠杆菌DH5α转化 成卡那霉素抗性菌株。抗卡那霉素转化体的质粒通过elutipD柱纯化，并用 限制性酶消化检验。采用双脱氧方法(Sanger等，1977)测定质粒插入序列的 部分，引用为-40引物和反向测序引物(美国生物化学公司)以及分别与Tn5 的I和O末端退火的P6引物(5′-CCTAGGCGGCCAGATCTGAT-3′)(序列 6)和P7引物(5′-GCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3′)(序列7)。用 Macvector3.5软件包在Macintosh SE/30计算机上运行将核苷酸序列和推断 的氨基酸序列汇编起来。在英国Harrow的人类基因组图谱项目资源中心用 UNIX/SUN计算机系统比较这些与序列与EMBL和Genbank DNA数据库。
结果
标记物设计
DNA标记物的结构示于图1a。每个标记由一个可变的中心区域组成， 其旁侧为不变的序列，即“臂”。设计中心区序列([NK]20)以防止常用的6bp 识别限制性酶位点的出现，但这中心区序列为足够可变，以保证在统计学上 相同序列只在2×1011分子中出现一次(12个随机选择的标记物DNA测序显 示，没有一个在可变区有50％以上的相同)。N指任何碱基(A、G、C或T)， 而K指G或T。臂含有靠近末端的kpnI位点，这有利于起始克隆步骤，紧 接着可变区的HindIII位点用于在杂交分析之前从臂中释放经放射性标记的 可变区。臂也设计成P2和P4各只含一个鸟嘌呤残基。因此，在采用这些引 物的PCR过程中，只有一个胞嘧啶掺入每个新合成的臂中，而在单一序列 中平均有10个。当放射性标记的dCTP加入PCR中时，单一序列中比每一 臂中平均多10倍标记。当它们从单一序列中通过HindIII消化而释放时，意 在尽可能减少臂的背景杂交信号。将双链标记物连接到装于质粒pUT(de Lorenzo和Timmis，1994)上的mini-Tn5转座子Kmz的kpnI焦点上。这一 质粒的复制依赖于pir基因的R6K一确定的无产物。它带有PR4质粒的oriT 序列，可使其转至各种细菌(Miller和Mekalanos，1988)中，它还带有mini -Tn5元件座作用所需的tnp基因。通过接合作用将标记的mini-Tn5转座 子转至鼠伤寒沙门氏菌，并将转座作用所得的288个接合后体保存于微量滴 定板的孔中。从其中12个孔中分离的总DNA用EcoRV消化，并用mini- Tn5转座子的抗卡那霉素基因作为探针进行Southern杂交分析。在所有情况 下，出现接合后体，结果转座子单整合入细菌基因组的不同位点(图2)。
特异性和灵敏性研究
我们下一步测定了PCR中DNA标记物扩增的效率和均一性，该PCR 涉及接合后体DNA库作为反应的靶物质。为尽可能减少PCR中标记物的不 等扩增，我们测定了可用于100μl反应中的最大量DNA靶物质和最少的 PCR循环数，以使产物通过琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色而显现(分别为5μ gDNA和20个循环)。
将微量滴定皿中已达稳定生长期的鼠伤寒沙门氏菌合在一起，用于提取 DNA。用引物P2和P4进行PCR。80bp的PCR产物用凝胶纯化并作为第二 次PCR的靶片段，所用引物相同位用32P-标记CTP。这导致掺入PCR产 物的放射性标记的dCTP超过60％。用HindIII消化放射性标记的产物，并 用于探测来自其相应微量滴定皿的菌落印迹的DNA。在用此法试验的1510 个突变体中，其中358个在经过菌落印迹过夜曝光后，在放射自显影图上不 产生清晰的信号。对此有三种可能的解释。首先，可能有一部分转座子不带 标记。然而，通过比较转座子存在或不存在标记下连接反应引起的转化频率， 似乎不能说明未标记的转座子占总量的约0.5多(见材料和方法)。更可能的 原因是在一些标记中可变序列被截短了，和/或序列的一部分形成了二级结 构，这两者可能造成了扩增的阻碍。不产生清晰信号的突变体没有进行进一 步的研究。通过从一个微量滴定板的24个菌落中制备一个探针，并用它检 测48个菌落的菌落印迹，这其中的24个用于制备该探针，以此证明可有效 扩增的标记的特异性。没有用于制备该探针的24个菌落中没有任何杂交信 号(图3)表明所采用的杂交条件足够严格，以防止标记的标记物之间出现交 叉杂交，并且表明每个接合后体在微量滴定皿内没有重复。
还需进一步考虑确定可用于动物实验接种物的最大集合体量。由于每一 转座子标记的标记物量反比于标记物集合的复合度，因此对于集合体量有一 个限制，在这量以上放射性自显影图曝光过夜后，杂交信号太弱而检测不出。 更重要的是，随着集合体复合度的增加，在一个感染动物脾脏的集合体中不 会出现足够数量毒性代表以制备足够数量探针可能性也一定增加。我们没有 测定我们使用的沙门氏菌病的鼠模型中集合体大小的上限，但在96时一定 为过量。
转座子突变体的毒力试验
测定总共1152个单一标记的插入突变体(来自两个微量滴定皿)12个集 合体在BALB/c小鼠中的毒力，每个集合体代表一个96孔微量滴定板。动 物体接受微量滴定板96个转座子突变体每种约103细胞的膜腹内注射(总共 105个生物体)。注射后三天处在小鼠，通过将脾脏匀浆涂布于实验室培养基 上分离细菌。收集从每个小鼠中分离的约10,000菌落，并提取DNA。扩增 这一DNA样品中的标记物并用PCR标记，检测菌落印迹，并与接种物扩增 的标记的杂交图(图37)进行比较。作为对照，将鼠伤寒沙门氏菌的aroA突 变体进行标记，并作为接种物中96个突变体之一。预计从脾脏中分离不到 这一菌株，因为其毒力已显著减弱(Buchmeier等，1993)。确定了有41突变 体，它们的DNA与接种物的经标记的标记物杂交，但不与从脾脏分离的细 菌的经标记的标记物杂交。重复这一实验，又确定了这相同的41个突变体。 如所预料的其中的两个为aroA突变体(每一集合体一个)。另一个是营养缺陷 型突变体(它不能生长在基础培养基上)，所有突变体菌落形态正常。
实施例2：克隆和转座子旁侧序列的部分特征
从实施例1(库1，F10)所述的一个突变体中提取DNA，用SstI消化， 根据卡那霉素抗性亚克隆。位于转座子一端的450bp的序列用P7引物测定。 这一序列与编码热调节蛋白酶的大肠杆菌clp(lon)基因有80％相同。据我们 所知，这一基因以前未涉及到毒力决定簇。
还有13个鼠伤寒沙门氏菌毒力基因的部分序列示于图6(序列A2-A9 和B1-B5)。推断的P2D6，S4C3，P3F4，P7G2和P9B7的氨基酸序列与分 泌相关蛋白的一族有相似性。这些蛋白从动物的细菌性病原体到植物的细菌 性病原体有保守性，这些蛋白在沙门氏菌中即为inv族。在鼠伤寒沙门氏菌 中，inv基因是细菌侵入肠道组织所需的。当inv突变体通过口服途径接种 时，其毒力减弱，但通过腹膜内注射时没有减弱。发现inv相关基因在腹膜 内接种时对毒力是必需的，表明了一种新的分泌器官可能对脾脏和其它器官 的非吞噬细胞的侵袭可能是需要的。这些新的基因的产物在治疗已经产生的 感染中可能成为比inv蛋白质更好的药物目标。
本实施例中鉴定的基因的进一步特征描述于实施例4。
实施例3：LD50测定和小鼠疫苗接种试验
用本发明方法鉴定的突变体弱化毒力。
将5个与毒力无关的基因突变，通过P22介导的转导作用转至萘啶酮酸 敏感的鼠伤寒沙门氏菌12028的亲本菌株中。转导体用限制性图谱检验，然 后通过腹膜内途径注射入BALB/c小鼠实验组中，以测定其50％致死剂量 (LD50)、突变体S4C3、P7G2、P3F4和P9B7的LD50值都比野生型菌株高几 个数量级。突变体P1F10所检测的LD50没有差别；然而在由相同比例的P1F10 菌株和野生型菌株组成的接种物注射的小鼠脾脏中，分离到的P1F10细胞的 比例有统计学上显然的下降。这表明这一突变体确实减弱了毒力，但到了不 能被LD50所检测的程度。
突变体P3F4和P9B7也通过口服途径，以107细胞/小鼠的接种量应用。 所有小鼠都没出现病症，表明这些突变体的口服LD50量至少比野生型菌株 高一个数量级。
在小鼠疫苗接种试验中，五个一组的质量为20-25g的BALB/C小鼠用 10倍系列稀释的鼠伤寒沙门氏菌突变株P3F4和P9B7，以口服(p.o)或腹膜内 注射(i.p.)途径初始接种。4周之后，小鼠再用500c.f.u的亲代野生型菌株接 种。四周中记录死亡情况。
将2个一组的，并且与接种突变体菌株的小鼠同样大小和同一批的小 鼠，用500c.f.u的野生型菌株腹膜内接种，作为正对照。两个未免疫的小鼠 如预计的那样在4周内死亡。
结果列表如下：
1)用突变体菌株P3F4口服初始接种 初始接种物 (c.f.u.) 第一次感染后存活的小鼠数目 野生型感染后存活的小鼠数目 5×109 5 2(40％) 5×108 5 2(40％) 5×107 5 0(0％)
2)用突变体菌株P3F4腹膜内初始接种 初始接种物 (c.f.u.) 第一次感染后存活的小鼠数目 野生型感染后存活的小鼠数目 5×106 3 3(100％) 5×105 5 4(80％) 5×104 6 5(83％) 5×103 5 4(80％)
3)用突变菌株P9B7口服初始接种 初始接种物 (c.f.u.) 第一次感染后存活的小鼠数目 野生型感染后存活的小鼠数目 5×109 5 0(0％)
4)用突变体P9B7腹膜内初始接种 初始接种物 (c.f.u.) 第一次感染后存活的小 鼠数目 野生型感染后存活的小 鼠数目 5×106 4 2(50％)
从这些实验中得出结论，突变体P3P4似乎能对随后的野生型感染产生 保护，这种保护似乎在腹膜内免疫的小鼠中作用更强。
实施例4：鉴定鼠伤寒沙门氏菌中编码第二种III型分泌系统的毒力焦 点
本实施例中所用的缩写为：VGC1，1簇毒力基因；VGC2，2簇毒力基 因。
描述的实验背景
鼠伤寒沙门氏菌是人胃肠炎的主要病原，它在作为人体伤寒模型的小鼠 中产生系统性疾病(1)。用鼠伤寒沙门氏菌通过口服接种小鼠后，细菌通过肠 细胞或派伊尔结小囊的M细胞(2)从小肠腔穿过肠粘膜。这些细菌随后侵入 巨噬细胞和中性白细胞，进入网状内皮系统并扩散至其他器官，包括脾和肝， 在那里进一步敏殖导致占优势和致命的菌血症(3)。为侵入宿主细胞，并在各 种生理胁迫的胞内和胞外环境中存活和复制，以及避开免疫系统的特异性抗 细菌活性，鼠伤寒沙门氏菌采用了一套完善的毒力因子系统(4)。
为更全面了解鼠伤寒沙门氏菌和其他病菌的毒力机理，在实施例1中描 述了转座子诱变系统，它简便地被称为“特征标记诱变”(STM)，它结合了 突变分析功能和同时跟踪大量不同突变体在一个动物体内最终结果的能力 (5和实施例1；文献5发表于本发明优先权数目之后)。用这一方法，我们从 总共筛选的1152个突变体中鉴定了43个毒力减弱的突变体。在5个这样的 突变体位于转座子插入位点旁侧的DNA核苷酸列表明了它们涉及到编码各 种细菌性病原体的III型分泌系统(6，7)。鼠伤寒沙门氏菌inv/spa基因簇产 物是形成III型分泌系统的蛋白质，该系统是介导进入上皮细胞(10)表面附属 部分的装配所需要的。因此在inv/spa簇中带有突变的菌株的毒力只有当接 种物是口服接种而非腹膜内接种时才减弱(8)。相反通过STM鉴定了5个突 变体在腹膜内接种后是无毒性的(5)。
在这一实施例中，表明了这5个突变体的转座子插入位点和通过STM 鉴定的另外11个突变体都画出了鼠伤寒沙门氏菌染色体的同一区域。这一 区域的进一步分析显示了另外一些基因，它们的推断产物与III型分泌系统 的其他组成有相似的序列。我们称之为毒力基因簇2(VGC2)的染色体该区域 在许多其他肠细菌中不出现，它代表了鼠伤寒沙门氏菌毒力的一个重要位 点。
材料和方法
细菌菌株、转导和生长培养基
肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型5791(阿伯丁沙门氏菌)、 423180(鸡沙门氏菌)、7101(古巴沙门氏菌)和12416(鼠伤寒沙门氏菌LT2)来 自国立典型培养物保藏中心(Pubbic Health Laboratory Service，UK)。伤寒沙门 氏菌BRD123基因组DNA由G.Dougan赠送，肠道病原性的大肠杆菌(EPEC)、 肠出血性大肠杆菌(EHEC)、霍乱弧菌E1Tor生物型、弗氏志贺氏菌血清型2 和金黄色葡萄球菌为临床分离株，来自英国皇家医学研究生院传染病和细菌 学系。鼠疫杆菌(Yersinia pestis)的基因组DNA由J.Heesemann赠送。然而基 因组DNA可采用标准方法分离。以前已描述了用于产生鼠伤寒沙门氏菌 NCTC12023株的特征标记的mini-Tn5转座子突变体的细菌菌株和方法(5， 11)。常规的增殖质粒是在大肠杆菌DH5α进行。将细菌培养于补加了适当 抗生素的LB肉汤(12)中。在测定单个突变体菌株毒力水平之前，首先通过 噬菌体P22介导的转导作用(12)将突变转至对萘啶酮酸敏感的鼠伤寒沙门氏 菌12023的亲代菌株中。转导体在用作接种物前用限制性酶消化和Southern 杂交进行分析。
λ文库筛选
覆盖VGC2的重叠插λDNA的入克隆通过标准方法(13)获得，它来自 鼠伤寒沙门氏菌LT2基因组DNA部分San3A消化物插入片段的入1059文 库(14)。该文库由K.Sanderson从加拿大Calgary的沙门氏菌遗传保藏中心 (SGSC)获得。
Mud-P22溶源体
将放射性标记的DNA探针与结合DNA的HybondN(Amersham)滤膜杂 交，该DNA从一套鼠伤寒沙门氏菌菌株的裂解物制备而来，这些菌株在鼠 伤寒沙门氏菌基因组已知位置含有Mud-P22原噬菌体。丝裂霉毒诱导的 Mud-P22裂解物的制备见描述(12，15)。这套Mud-P22原噬菌体最先由 Benson和Goldman(16)装配，从SGSC所得。
凝胶电泳和Southern杂交
凝胶电泳在1％或0.6％琼脂糖凝胶。0.5×TBE中进行。将凝胶分离的 DNA转至Hybond或N或N+膜(Amersham)，按Holden等所述进行严格杂 交和洗膜步骤(使核苷酸序列之间的杂交错配在10％或10％以下)。对于非严 格条件(使序列之间杂交的错配在50％)，将滤膜在10％甲酰胺/0.25M Na2HPO4/7％SDS中42℃下杂交过夜，最严格的杂交步骤是用 20mMNa2HPO4/1％SDS在42℃下进行。用作探针的DNA片段按生产厂家说 明用Radprime系统(Gibco-BRL)的[32P]dCTP或[地高辛配基-11]dUTP标 记，并用地高辛配基系统(Boehringer Mannheim)检测，只是杂交用的溶液与 放射性标记探针的溶液相同。如前述方法(13)制备基因组DNA的用于 Southern杂交。
分子克隆和核苷酸测序
限制性内切酶和T4DNA连接酶来自Gibco-BRL。一般的分子生物学 技术如Sambrook等所述(18)。用T7测序试剂盒(Pharmacia)通过双脱氧链终 止法(19)进行核苷酸测序。序列有Macvector3.5软件或AssemblyLLGN程序 包汇编。将核苷酸和其衍生的氨基酸序列与欧洲分子生物学实验室(EMBL) 和SwissProt数据库中资料比较，采用威斯康星大学的GCG程序包的BLAST 和FASTA程序，在英国Hinxton的人类基因组图谱项目资源中心的网络服务 处进行。
毒力试验
5个一组的雌性BALB/C小鼠(20-25g)用悬浮于生理盐水的细菌的10 倍稀释液口服或腹膜内接种。制备接种物时，将细菌摇床(50rpm)培养于LB 肉汤中，37℃过夜，然后用于接种新鲜培养基，经过不同时间至560nm处的 光密度达到0.4-0.6。将培养物通过离心浓缩和重悬于盐水使细胞密度达每 5×108菌落形成单位(cfu)或大于此浓度。通过在LB琼脂平板上上涂布接种 物稀释系列检查每ml中cfu浓度。小鼠用0.2ml体积的相同量腹膜内接种和 通过口腔的管饲法接种小鼠。经过28天，用Reed和Meunch(21)的方法计算 LD50的值。
结果
转座子插入的定位
前面已描述了鼠伤寒沙门氏菌微型Tn5转座子突变体库的制备和用于 鉴定43个减毒的突变体的筛选方法(5)。通过选择卡那霉素抗性或反向PCR， 从接合后体克隆转座子和旁侧的DNA区。在33个突变体中获得转座子旁侧 DNA的300-600bp的核苷酸序列。通过将这些序列与DNA和蛋白质数据 比较，结果表明14个突变体来自转座子插入以前已知的毒力基因，7个是由 于插入与肠细菌的已知基因相似的新基因，12个是由于插入与DNA和蛋白 质数据库记录没有相似性的序列(实施例1和本实施例中的文献5)。
有三方面的证据表明，进入新序列的19个转座子插入中有16个集中于 基因组的三个区域，最初定名为A、B和C。首先，将转座子插入点旁侧区 域的核苷酸序列之间相互比较和将这些序列与数据库比较，结果显示有些序 列相互重叠或与同一基因不同区域有很大的相似性。第二，通过用九种限制 性酶消化和用位于转座子插入点旁侧的限制性片段探测基因组DNA的 Southern杂交分析表明，有些转座子插入位于同样限制性片段上。第三，当 同样DNA探针与来自鼠伤寒沙门氏菌λDNA文库的的噬斑杂交时，发现前 面两个步骤已表明可能是相连的突变体探针与同样的λDNA克隆杂交。因 而两个突变体(P9B7和P12F5)被指定为A簇，五个突变体(P2D6，P9B6， P11C3，P11D10，P11和H10)为B簇而九个突变体(P3F4，P4F8，P7A3，P7B8， P7G2，P8G12，P9G4，P10E11和P11B9)C簇(图8)。
这三簇DNA探针与一套含有锁住的Mud-P22原噬菌体(15，16)的鼠 伤寒沙门氏菌杂交，表明了这三个基因座都位于30′至31′域(第八版，参考 文献22)(图7)，表明这三个基因座密切相连或构成了一个大的毒力位点。用 每个克隆末端区的DNA片段作为其他λ克隆的Southern杂交分析的探针， 以测定覆盖A、B和C簇的任何λ克隆是否含有重叠DNA插入片段。DNA 片段杂交显示有n个λ克隆重叠，并且A、B、C簇含有一个邻连区(图8)。 这一区末端的DNA片段然后用于探测λ文库，以进一步鉴定含有代表邻接 区的插入序列的克隆。确定没有一个λ克隆含有这一基因座的最右端，因此 这一区域是通过从Mud-P22原噬菌体菌株TT15244(16)的裂解液中克隆一 个6.5kb的EωRI/XbaI片段而获得。
然后采用限制性图谱和Southern杂交分析作出这一基因座的物理图谱 (图8)。为区分这一基因座和已被详细说明的位于63′的inv/spa基因簇(第八 版，参考22)(8，9，23，24，25，26)，我们把后者称为毒力基因簇1(VGC1)， 并定名新的毒力基因座为VGC2。图2示核苷酸序列(序列1和序列2)已被测 定的DNA的两个部位位置。核苷酸序列示于图11和图12。
对鼠伤寒沙门氏菌染色体上VGC2边界的作图
位于VGC2左侧的λ克隆7的核苷酸测序显示，有一个开读框(ORF)， 其推断的氨基酸序列与大肠杆菌ydhE≠基因的一个片段的衍生产物有90％ 以上的相同，对VGC2右侧的6.5kbEcoRI/XbaI克隆的片段测序表明，有一 个ORF存在，其推断的氨基酸序列与pykF基因编码的大肠杆菌的丙酮酸激 酶I有90％以上的相同(27)。在大肠杆菌染色体上，ydhE和pykF相互靠近， 位于37′-38′(28)。沿着VGC2长度分布的11个非重叠DNA片段作为探针， 用于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA的非严格Southern杂交分析。 DNA片段杂交显示包含VGC2的约40kb的区域在大肠杆菌基因组中不存 在，并且VGC2边界局限于1kb之内(图9)。将靠近VGC2(图8)右端的XbaI 位点的位置与染色体(22)30′区的已知XbaI位点的图谱比较，可推断出VGC2 的30.7′的图谱位置。
VGC2的结构
VGC2的部分核苷酸序列显示有19个ORF(图8)。VGC2内的约26kb 的核苷酸序列的G+C含量为44.6％，而VGC1(9)为47％，整个沙门氏菌基 因组(30)的G+C含量估计为51-53％。
ORF1-11的推断的完整的氨基酸序列与III型分泌系统(6，7)的蛋白质 序列相似，已知这对于各种植物和动物的细菌性病原体中毒力决定簇的输出 是必需的(7)。推断的ORF1-8(图8)的蛋白质在结构上和序列上与假结核耶 尔森氏菌(Yersinia psendotuberculosis)(31)yscN-U基因、鼠伤寒沙门氏菌 VGC1中inv/spa簇的invC/spaS和弗氏志贺氏菌(32，33，34，35)spa/mxi簇 的spa47/spa40的产物相似。例如，推断的ORF3(图8)的氨基酸序列与假结 核耶尔森氏菌(31)的YscS 50％相同，与弗氏志贺氏菌的Spa9有34％相同， 与鼠伤寒沙门氏菌(9)VGC1的SpaQ有37相同。预计的ORF9的蛋白质产物 与LcrD族蛋白质密切相关，它与小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(36) 的LcrD有43％相同，与弗氏志贺氏菌(32)的MxiA有39％相同，与VGC1(23) 的InvA有40％一致。示于图8的剩余的ORF的部分核苷酸序列表明了预计 的ORF10的蛋白质与小肠结肠炎耶尔森氏菌的YscJ(37)最相近，后者是位 于细菌外膜的脂蛋白，而ORF11则相似于鼠伤寒沙门氏菌的InvG，鼠伤寒 沙门氏菌的InvG是转位酶PulD族中的一个(38)。ORF12和ORF13与含有 两个组分调节系统(39)的各种蛋白质的传感和调节亚基分别有显著的相似 性。对位于ORF9和10、ORF10和11以及ORF19和VGC2的右侧末端之 间的其他的基因有很大的编码容量。
VGC2在沙门氏菌中具保守性和特异性
将位于VGC2中心(图8，B探针)、与DNA和蛋白质数据库的内容缺少 序列相似性的一段2.2kb的PstI/HindIII片段，作为沙门氏菌血清变型和其他 病原细菌基因组DNA Southern杂交分析的探针(图10A)。在非严格条件下的 DNA片段杂交显示VGC2出现于阿伯丁沙门氏菌、鸡沙门氏菌、古巴沙门 氏菌、伤寒沙门氏菌，而在EPEC、EHEC、鼠疫杆菌、弗氏志贺氏菌、霍 乱弧弧菌和金黄色葡萄球菌中不存在。因此，VGC2在沙门氏菌具保守性， 并且VGC2对沙门氏菌可能具特异性。
为确定在所试验的沙门氏菌血清变型中基因座的结构是否保守，用两种 另外的限制性酶消化基因组DNA而进行严格的Southern杂交。DNA片段杂 交显示：在鼠伤寒沙门氏菌LT2和鸡沙门氏菌、古巴沙门氏菌和伤寒沙门氏 菌之间存在着限制性位点安排的一定异质性(图10B)。而且，鸡沙门氏菌和 伤寒沙门氏菌含有与所测定的其他沙门氏菌中出现的片段相杂交的片段，这 表明VGC2的区域已在这些种中被复制了。
VGC2是小鼠中毒力所需的。
前面的实验表明，腹膜内接种转座子突变体P3F4、P7G2、P9B7和P11C3 和LD50值至少比野生型菌株大100倍(5)。为理解在感染过程中VGC2的重 要性，测定突变体P3F4和P9B7的口服腹膜内接种的LD50值(表1)。通过任 何一种途径接种的两个突变体与其亲代菌株相比，其毒力至少降低与个数量 级。通过这两种接种途径毒力的极大降低证明了在上皮细胞渗入BALB/C小 鼠后，VGC2对感染过程中的活动是需要的。
表1 鼠伤寒沙门氏菌菌株的LD50值 LD50(cfu) 菌株 i.p. p.o. 12023野生型 4.2 6.2×104 P3F4 1.5×106 75×109 P9B7 71.5×106 75×109
cfu，菌落形成单位
讨论
通过对一组减毒的特征标记转座子突变体的插入点进行作图已确定了 迄今未知的鼠伤寒沙门氏菌的一个毒力基因座，它位于染色体的30.7′处，约 40kb大小(5)。这一基因座被称为毒力基因簇2(VGC2)，以与63′(第八版，ref.22) 处的inv/spa毒力基因相区别，后者我们建议命名为VGC1。VGC1和VGC2 两者都编码III型分泌系统的组分。然而这些分泌系统功能上不同。
在插入新基因(ref.5和本实施例)形成的19个突变体中，其中16个标绘 于染色体的相同区域。可能mini-Tn5插入优先出现于VGC2中。或者由于 鉴定减毒(5)突变体的负选择非常严格(反映在VGC2突变体有高的LD50值)， 可能在以前未知的基因中，只有VGC2未知基因的突变导致在筛选中足以恢 复的减毒程度。以前寻找鉴定VGC2的鼠伤寒沙门氏菌毒力决定簇的失败可 能是由于依靠细胞培养试验，而不是用活的动物感染模型。鉴定沙门氏菌独 特的鼠伤寒沙门氏菌LT2染色体的区域的一项以前的研究(40)将一个这样的 区域(RF333)定位于30.5′32′。因此，RF333与VGC2相关，虽然还不知道 RF333与毒力决定有关。
比较由耶尔森氏菌和志贺氏菌毒力质粒编码的III型分泌系统，以及沙 门氏菌VGC1表明：VGC2编码分泌器官的基本结构组成。而且，VGC2中 的ORF1-8的顺序与同源的耶尔森氏菌、志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的 VGC1的基因顺序相同。与相应的耶尔森氏菌基因相比，VGC2分泌系统的 组织和结构与VGC1相比并不更为密切相关，连同VGC2的低G+C的含量 提示，如同VGC1(40，41，42)一样，VGC2是由鼠伤寒沙门氏菌通过水平 传播独立获得的。由ORF12和13编码的蛋白质与细菌性两个组分调节物(39) 之间有很强的相似性，并且这些蛋白质能够调节任何ORF1-11和/或这一系 统分泌的蛋白质。
VGC1中很多基因已显示出对于鼠伤寒沙门氏菌进入上皮细胞的重要 性。这一过程需要细菌的接触(2)，并产生细胞骨架的重排，而导致局部的膜 边缘波动(43，44)。VGC1的作用和它局限于感染的这一阶段表现在用VGC1 突变体口服接种的BALB/C小鼠中毒力减弱约50倍，以及表现为VGC1突 变体进行腹膜接种时没有毒力损失(8)。第二条观察的结果也解释了为什么在 我们的筛选中没有得到VGC1突变体(5)。相反，VGC2突变体在口服和腹膜 内接种后大大减毒。这一结果显示，与VGC1不同，VGC2在渗入上皮细胞 后对小鼠的毒力是需要的，但这些发现不排除在这一早期感染中VGC1的作 用。
因此，概括起来，鼠伤寒沙门氏菌染色体上10个特征标民转座子突变 体插入点的作用导致了在30.7′处一个40kb毒力基因簇的确定。这一基因座 在所有其他测定的沙门氏菌中是保守的，但在许多其他的病原菌或大肠杆菌 k12中不出现。这个基因座一部分核苷酸测序显示有11个开读框，其预计的 蛋白质编码III型分泌系统的组分。为区分这一系统和由inv/spa侵袭基因座 编码的III型分泌系统，我们将inv/spa基因座称为毒力基因簇1(VGC1)，而 新的基因座为VGC2。VGC2比沙门氏菌基因组的G+C含量要低，VGC2 的旁侧是那些产物与大肠杆菌ydhE和pykF基因产物有90％以上相同的基 因。因此，VGC2可能是通过插入一个区域水平获得，该区域相应于大肠杆 菌ydhE和pykF基因之间的区域。VGC2突变体的毒力研究已显示，在口服 或腹膜内接种后，突变体与野生型菌株相比毒力减弱至少5个数量级。
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实施例5：肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)毒力基因的鉴定
(a)诱变
在不含合适的转座子系统情况下，构建肺炎链球菌标记突变体最有效的 途径是用插入复制诱变(Morrison等(1984)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)159， 870)。通过基因组DNA用一种限制性酶消化或超生处理，然后用凝胶分离 并用T4DNA聚合酶进行DNA末端修补，从而产生随机的200-400bp长度 的肺炎链球菌DNA片段。将片段连接到质粒pJDC9(Pearce等(1993)“分子 微生物学”(Mol.Microbiol.)9，1037，该质粒在大肠杆菌和肺炎链球菌中带有 红霉素选择的erm基因)，该质粒事先用DNA序列标记插入其中一个多接头 克隆位点进行修饰。克隆的肺炎链球菌DNA的大小足以保证同源重组，并 且能减少在大肠杆菌中产生没有代表性的文库的可能性(肺炎链球菌蛋白质 的表达能对大肠杆菌产生毒性)。也可获得带有不同可选择标记的其他载体， 它们可代替pJDC9而应用。将带有DNA片段的标记的质粒导入一个适当的 肺炎链球菌菌株，该菌株的选择是根据血清型和肺炎球菌肺炎的鼠模型中的 毒力而定的。肺炎链球菌中遗传转化的感受态调节是由感受态因子所控制， 该因子是一个17个氨基酸的多肽，最近已由芝加哥伊利诺斯大学的Don Morrison小组阐述，描述于Havarstein Coomaraswamy和Morrison(1995)的“美 国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，11140-11144。在转化实验 中加入少量这种肽，导致一些胶囊化的肺炎链球菌的临床菌株出现非常有效 的转化频率。这克服了肺炎球菌分子遗传学中的一个主要障碍，这种肽的获 得大大有利于肺炎链球菌突变体库的构建以及使得能灵活选择要进行突变 的菌株。分析了一部分转化体以证实质粒序列的同源整合，并检验其稳定性。 通过使复制的区域较短(200-400bp)以使很低的回复量减少至最低，这一回 复与通过插入复制产生的突变体有关；然而如果回复的量为不可接受的高， 在培养物的转化体培养和动物体内培养过程中要维持抗生素筛选。
(b)动物模型
将肺炎链球菌库组成集合体接种于瑞士和/或C57B1/6小鼠。进行预实 验以测定集合体的最适复合度和最佳接种量。一个引人注目的模型是用 105cfu的接种量，通过口传至气管(Veber等(1993)“抗微生物化疗杂志” (J.Antimicrobial Chemotherapy)32，473)。瑞士小鼠在3-4天内发展成急性肺 炎，而C57B1/6小鼠在8-10天内出现亚急性肺炎。这些感染的肺模型在死 亡之时产生108cfu/肺(Veber等(1993)“抗微生物化疗杂志”(J.Antimicrobial Chemotherapy)。需要时，也可腹膜内注射小鼠，用于鉴定那些感染血液所需 的基因(Sullivan等(1993)“抗微生物剂和化疗”(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)37，234)。
(c)毒力基因的鉴定
一旦优化了感染模型的参数，对由几干个菌株组成的突变体库进行毒力 试验。采用来自“输入”和“分离”集合体的经标记的标记物作为探针，通 过杂交分析鉴定毒力减弱的突变体。如果肺炎链球菌DNA不能很方便地进 行菌落印迹，那么将染色体DNA通过化学或酶法释放至微量滴定板的孔中， 然后用点杂交装置转至尼龙膜上。位于整合的质粒旁侧的DNA通过大肠杆 菌中的质粒拯救进行克隆(Morrison等(1984)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)159， 870)，并进行测序。基因组DNA文库构建入维持大于大肠杆菌或一种革兰 氏阳性宿主菌株中的合适载体上，并且用位于整合的质粒旁侧的限制性片段 探测，以分离克隆的毒性基因，该基因然后进行全序列测定，并进行详细的 功能分析。
实施例6：Enterococcus faecalis中毒力基因的鉴定
(a)诱变
用质粒pAT112或为诱变而研制的一个衍生物进行E.faecalis诱变。 pAT112带有革兰氏阴性和阳性细菌中用于筛选的基因，以及Tn1545的att 位点。因此需要在宿主菌株中有用于转座的整合酶，并且如果宿主不含有一 个切除酶基因，那么可获得稳定的单拷贝插入(Trieu-Cuot等(1991)“基因” (Gene)106，21)。位于整合质粒旁侧的DNA的回收是通过将基因组DNA限 制性消化，分子内连接和大肠杆菌转化而进行的。PAT112及其衍生物中限 制性酶的单个位点的存在(Trieu-Cuot等(1991)“基因”(Gene)106，21)可使 DNA序列标记掺入，然后通过接合，电穿孔或转化法转至带有质粒 pAT145(以提供整合酶功能)的E.faecalis的毒力菌株(Trieu-Cuot等(1991)“基 因”(Gene)106，21；Wirth等(1986)“细菌学杂志”(J.Bacteriol.)165，831)。
(b)动物模型
通过从转化受体从分离DNA，限制性酶消化和Southern杂交分析大量 插入突变体的质粒随机整合。将单个突变体保存于微量滴定板的孔中，优化 混合接种物的复合度和多少，然后筛选突变体库。采用由E.faecalis引起的 两个不同的感染模型。第一个是完善的大鼠心内膜炎模型，它是通过尾静脉 向动物注射多达108cfu的E.faecalis，动物中有一导管插穿主动脉瓣(Whitman 等(1993)“抗微生物剂和化疗”(Autimicrobial Agents and Chemotherapy)37， 1069)。在接种后不同时间处死动物，切下动脉瓣上细菌生长的一部位，研 磨并涂布于培养基上，以分离细菌菌落。接种后不同时间从血液中也分离出 毒性细菌。第二个模型是小鼠的腹膜炎，是在腹膜内注射多达109cfu的 E.faecalis后形成的(Chenoweth等(1990)“抗微生物剂和化疗”34，1800)。如 同肺炎链球菌模型一样，进行预实验以建立混合的最适复合度和最适接种 量，然后筛选突变体库。
(c)毒力基因的鉴定
用大肠杆菌复制起始点分离位于pAT112整合位点旁侧的DNA，可通过 载体中多数常用的6bp识别限制性酶位点的缺少得到简化。因此，感兴趣菌 株的DNA用其中一种酶消化，自身连接，转化入大肠杆菌，并根据相邻于 质粒上att位点的序列用引物进行测序。E.faecalis的基因组DNA文库用感 兴趣序列进行检测，以鉴定毒力基因的完整拷贝，然后对该毒力基因进行测 序。
实施例7：铜绿假单胞菌毒力基因的鉴定
(a)诱变
由于转座子Tn5已被其他人用于诱变铜绿假单胞菌，并已有报道用于鉴 定鼠伤寒沙门氏菌毒力基因(实施例1)的mini-Tn5衍生物在革兰氏阴性细 菌，包括几种假单胞菌中有着广泛的应用(DeLorenzo和Timaris(1994)“酶学 方法”(Methods Enzymol.)264，386)，因此用我们已有的特征标记mini-Tn5 转座子通过将自杀载体接合转入一个或多个毒性(和可能的类粘蛋白)接受菌 株构建一个铜绿假单胞菌突变体库。专门设计用于铜绿假单胞菌诱变(Rella 等(1985)“基因”(Gene)33，293)的Tn5的其他衍生物或者也可以与miniTn5 转座子一起使用。
(b)动物模型和毒力基因鉴定
在大鼠慢性肺感染模型中筛选铜绿假单胞菌插入突变库的毒力减弱。用 气管切开术将铜绿假单孢菌细胞悬液引入气管，经过30天时间发病(Woods 等(1982)“感染与免疫”(Infect.Immun.)36，1223)。通过将肺匀浆涂布于实验 室培养基上分离细菌，这些细菌的序列标记用于检测用作接种物细菌的DNA 菌落印迹。也可能在小鼠的内源性菌血症(Hirakata等(1992)“抗微生物剂和 化疗”(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)36，1198)和囊性纤维化 (Davidson等(1995)“自然遗传学”(Nature Genetics)9，351)模型中进行突变体 库的毒力试验。转座子旁的DNA的克隆和测序接实施例1所述进行。按照 标准方法在实验室内构建基因组DNA文库，以进行基因完整拷贝的分离和 测序。
实施例8：烟曲霉素力基因的鉴定
(a)诱变
真菌中转座子诱变的功能等效于转化DNA的限制性酶介导的整合 (REMI)(Schiestl和Petes(1991)“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.)88， 7585)。这一过程中，用带有可选择标记的DNA片段在限制性作用下转化真 菌细胞，在不同的基因组位点出现单拷贝的整合，这取决于限制性酶的靶序 列。REM1已成功地用于分离旋孢霉(Lu等(1994)“美国国家科学院院刊” (Proc.Natl.Acad.Sci USA)91，12649)和黑粉菌(Bolker等(1995)“分子与普通遗 传学”(Mol.Gen.Genet.)248，547)的毒力基因，并且表明；用编码潮霉素抗性 的质粒结合有活性的限制性酶能使线性质粒单一地和明显随机地整入烟曲 霉的基因组中。将序列标记引入一个或两个载体的合适位点，以产生潮霉素 抗性，并用于转化烟曲霉的临床分离株。
(b)动物模型和毒力基因的鉴定
中性白细胞减少症小鼠中低剂量的曲毒病模型与人体中肺疾病的病程 尤为相符(Smith等(1994)“感染与免疫”(Infecr.Immun.)62，5247)。用多达 1,000,000分生孢子/小鼠的量鼻内接种小鼠，7-10天后通过将肺匀浆物接种 于液体培养基以分离有毒性的真菌突变体。经过数小时收集菌丝，从中提取 DNA，用于扩增和标记标记物，以检测包括接种物的转化体库DNA的菌落 印迹。通过用切除REMI载体的限制性酶消化转化体DNA，自身连接和转 化大肠杆菌克隆位于REMI插入点旁侧区的DNA。根据已知的质粒序列设 计的引物用于测定邻近的烟曲霉DNA序列。为证实载体的插入是引起减毒 表型的原因，将分离的质粒再用同种限制性酶切割，以用于克隆，并转回野 生型烟曲霉的亲代菌株中。由同源重组产生的转化体然后进行毒力试验。
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