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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610279944.6 (22)申请日 2016.04.29 (71)申请人 首都医科大学附属北京友谊医院 地址 100050 北京市西城区永安路95号 (72)发明人 黄坚徐安健吕婷霞 (74)专利代理机构 北京正理专利代理有限公司 11257 代理人 赵晓丹张文祎 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种肝豆状核变性A。
2、TP7B多位 点突变检测试剂盒， 该试剂盒包括分别针对 ATP7B的三个突变位点p .R778L ,p .P992L和 p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物对及 探针， 以及标准品。 本发明所述试剂盒操作简单， 可快速、 灵敏、 准确的检测待测血液样品中ATP7B 基因中p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个位点的 突变情况。 权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图3页 CN 105821134 A 2016.08.03 CN 105821134 A 1.一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括分别 针对ATP7B的三个突变。
3、位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物 对及探针， 以及标准品； 其中， 序列表中序列SEQIDNO： 1至SEQIDNO： 2所示的引物对和序 列SEQIDNO： 3所示的探针用于检测突变位点p.R778L； 序列SEQIDNO： 4至SEQIDNO： 5所 示的引物对和序列SEQIDNO： 6所示的探针用于检测突变位点p.P992L； 序列SEQIDNO： 7 至SEQIDNO： 8所示的引物对和序列SEQIDNO： 9所示的探针用于检测突变位点p.V1106I。 2.根据权利要求1所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒， 其特征。
4、在 于， 所述探针的3 端为氨基修饰。 3.根据权利要求1所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒， 其特征在 于， 所述标准品为分别包含三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I的野生型基因序列 的质粒载体和分别包含所述三个突变位点的突变型基因序列的质粒载体。 4.根据权利要求3所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒， 其特征在 于， 所述三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I的野生型基因序列分别为序列表中所 示的SEQIDNO： 10、 SEQIDNO： 11和SEQIDNO： 12； 所述三个突变位点的突变型基因序列 分别。
5、为序列表中所示的SEQIDNO： 13、 SEQIDNO： 14和SEQIDNO： 15。 5.根据权利要求1-4任一所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒进一步包括完成HRM检测所需的试剂和酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105821134 A 2 肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种检测肝豆状核变性(Wilson病)ATP7B热点突变位点的新方法， 即 应用非标记探针高分辨溶解曲线(HRM)技术检测ATP7B多位点突变， 属于医学检验检测领 域。 背景技术 0002 Wilson病(WD)是一种单。
6、基因常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病， 世界范围发病 率约为1/10,000-30,000， 其中中国是高发区。 该病是由于ATP7B基因突变导致铜转运P型 ATP酶缺失， 从而引起血浆铜蓝蛋白降低及铜在体内器官的沉积等一系列临床表现。 WD是目 前少数可治疗的遗传性疾病， 患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治 疗， 大多预后良好， 反之病情逐渐加重甚至危及生命。 因此， 早期诊断及时治疗是改善本病 预后的关键。 由于本病的遗传特性， 早期进行基因诊断对于该病的及早治疗起着决定性的 作用。 0003 目前， 国内外已报道的检测WD突变的方法有： 直接测序法， 聚合酶链反应限制性片。
7、 段长度多态性技术(PCR-SSCP)， 聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)， 高 效液相色谱(DHPLC)技术等， 这些技术有的操作步骤繁琐， 检测周期长， 灵敏度低， 有的易于 造成交叉污染， 出现假阳性结果。 HRM技术是今年来兴起的一种检测基因突变、 进行基因分 型和SNP检测的新工具， 可迅速检测出核酸片段中的单碱基的突变。 目前已有将HRM方法应 用于肝豆状核变性ATP7B部分突变位点检测的报道， 但分辨率和重复性还有待进一步探讨， 因此， 还难以应用于临床检测。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒。 该试剂盒。
8、 操作简便， 分辨率且重复性好， 可以快速检测肝豆状核变性ATP7B多位点突变。 0005 本发明的另一个目的是提供该检测试剂盒的使用方法。 0006 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0007 本发明提供了一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒， 该试剂盒包括分 别针对ATP7B的三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引 物对及探针， 以及标准品。 其中p.R778L位于ATP7B基因外显子8上， 是中国人群突变频率最 多的位点， 在Wilson患者中高达25左右， 其次外显子13上的p.P992L突变频率占15， 也 是热。
9、点突变位点之一。 根据我们实验室对中国人群Wilson患者ATP7B基因基因突变谱的最 新研究显示， 除了上述两个已知的热点突变位点， 外显子15上的p.V1106I的突变频率高达 7.5(以前有报道， 非热点突变)， 可能是一个新的热点突变位点(数据未发表)， 因此 p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个位点的联合检测可覆盖近50的患者。 所述引物对及探 针序列具体如表1所示： 0008 表1引物及探针序列 说明书 1/6 页 3 CN 105821134 A 3 0009 0010 上表中所示的探针序列的3 端为氨基修饰(AmMo)。 0011 所述标准品为分别包含上述三个突。
10、变位点的野生型基因序列的质粒载体和分别 包含上述三个突变位点的突变型基因序列的质粒载体。 其中， 三个突变位点的野生型基因 序列分别为序列表中所示的SEQIDNO： 10、 SEQIDNO： 11和SEQIDNO： 12； 所述三个突变 位点的突变型基因序列分别为序列表中所示的SEQIDNO： 13、 SEQIDNO： 14和SEQIDNO： 15。 上述三个突变位点的野生型基因序列和突变型基因序列可以采用全基因合成方法获 得， 然后分别连接到质粒载体上， 本发明对质粒载体不做限定， 例如本领域常用的T载体。 0012 进一步地， 本发明所述检测试剂盒还包括完成HRM检测所需的试剂和酶， 例如。
11、使用 商业化购买的试剂2HRMmastermix、 25mMMgCl2和ddH2O， 均购自Roche公司。 0013 本发明还提供了一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒的使用方法， 该 方法包括如下步骤： 0014 (1)提取血液总DNA， 可以使用DNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)， 也可以使用现有 技术中已知的提取DNA的方法进行提取； 0015 (2)进行HRM反应， 其反应体系如表2所示； 0016 表2反应体系 说明书 2/6 页 4 CN 105821134 A 4 0017 名称加样量 L 2HRMmastermix10 MgCl2(25mM)2 正义引物(1.。
12、25mM)0.8 反义引物(2.5mM)4 探针(10mM)1 DNA/标准品2 用ddH2O补足反应体积20 0018 反应条件： 9515min然后95for15sec,6020sec， 7230sec， 共65个循环， 并 且以4.8/s的升温速度升高到95， 以2.5/s的降温速度降低到46， 以4.8/s的升温 速度升高到72； 然后721min； 然后以4.8/s的升温速度升温到95， 然后以2.5/s的 降温速度降低到55。 溶解曲线通过在以4.8/s的升温速度从55升高到95的过程中， 每摄氏度获取25次荧光信号获得。 0019 (3)结果判定， 对于不同位点的野生型和突变型以。
13、及杂合型， 有不同的探针溶解曲 线Tm值， 见表3。 0020 表3不同基因型的探针Tm值 0021 0022 0023 本发明具有如下优点： 本发明针对多个突变位点设计引物及非标记探针， p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个位点的联合检测可覆盖近50的患者。 此外， 非标记探针 由于减少了结合的碱基数目， 因此， 放大了野生型和突变型的Tm值差异(Tm值为4以 上)， 从而弥补了单纯HRM方法分辨率和重复性不佳的缺点， 而同时兼备了传统HRM方法速度 快、 操作简便， 且对样品无污染等优点， 使得本方法在应用于临床检测方面更具优势。 附图说明 0024 图1为用于检测ATP7。
14、B778位点的标准品的非标记探针HRM结果图。 说明书 3/6 页 5 CN 105821134 A 5 0025 图2为用于检测ATP7B992位点的标准品的非标记探针HRM结果图。 0026 图3为用于检测ATP7B1106位点的标准品的非标记探针HRM结果图。 0027 图4为检测临床样本ATP7B778位点的非标记探针HRM结果图。 0028 图5为检测临床样本ATP7B992位点的非标记探针HRM结果图。 0029 图6为检测临床样本ATP7B1106位点的非标记探针HRM结果图。 具体实施方式 0030 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验 方。
15、法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0031 实施例1检测ATP7B基因p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位点的引物和非标 记探针的设计 0032 从GenBank获得ATP7B基因的序列， 利用NCBI引物在线设计软件Primer-BLAST设计 特异性扩增引物。 所述引物扩增的产物必须包含各个拟检测的突变位点， 并且突变位点应 稍靠近扩增产物的5 端。 探针为涵盖拟检测突变位点碱基的30个左右核苷酸的核酸序列， 所述核。
16、酸序列的GC含量应尽量低于45， 并将序列的3 端进行氨基修饰， 以避免延伸。 按此 原则， 通过筛选、 检验最终确定了可以有效检测ATP7B的p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个 突变位点的三组引物对和非标记探针， 其序列如表1所示。 所有引物和探针由梓熙生物技术 公司合成。 0033 实施例2检测ATP7B基因p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位点的的非标记探 针HRM检测试剂盒的组成 0034 检测试剂盒包括实施例1设计的分别针对ATP7B的三个突变位点p.R778L,p.P992L 和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针， 以及。
17、标准品。 具体地， 引物和探针 如表1所示。 所述标准品为分别包含上述三个突变位点的野生型基因序列的质粒载体和分 别包含上述三个突变位点的突变型基因序列的质粒载体。 其中， 三个突变位点的野生型基 因序列分别为序列表中所示的SEQIDNO： 10、 SEQIDNO： 11、 SEQIDNO： 12； 所述三个突变 位点的突变型基因序列分别为序列表中所示的SEQIDNO： 13、 SEQIDNO： 14、 SEQIDNO： 15。 上述引物和探针分装， 标准品也分装。 0035 所述检测试剂盒还包括还包括完成HRM反应所需的试剂和酶， 例如使用商业化购 买的试剂2HRMmastermix、 25。
18、mMMgCl2和ddH2O， 均购自Roche公司。 0036 实施例3非标记探针HRM检测ATP7B基因p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位 点的重复性实验 0037 具体过程包括以下步骤： 0038 一、 实验样品 0039 构建的标准品 0040 二、 重复性检测试验 0041 1.组内重复性 0042 按照前述实验体系和实验步骤， 在一次实验中重复进行三次检测， 不同基因型的 说明书 4/6 页 6 CN 105821134 A 6 Tm值和Tm值见下表。 0043 2.组间重复性 0044 按照前述实验体系和实验步骤， 连续进行五次检测， 不同基因型的Tm值和T。
19、m值 见表4。 0045 表4非标记探针HRM检测的重复性 0046 0047 0048 实施例4临床样本检测 0049 按照前述实验体系和实验步骤， 进行了临床样本的验证性实验， 并与金标准测序 结果进行了对比， 结果见下表5： 0050 表5 说明书 5/6 页 7 CN 105821134 A 7 0051 说明书 6/6 页 8 CN 105821134 A 8 0001 序列表 1/5 页 9 CN 105821134 A 9 0002 序列表 2/5 页 10 CN 105821134 A 10 0003 序列表 3/5 页 11 CN 105821134 A 11 0004 序列表 4/5 页 12 CN 105821134 A 12 0005 序列表 5/5 页 13 CN 105821134 A 13 图1 图2 说明书附图 1/3 页 14 CN 105821134 A 14 图3 图4 说明书附图 2/3 页 15 CN 105821134 A 15 图5 图6 说明书附图 3/3 页 16 CN 105821134 A 16 。