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1、(10)授权公告号 CN 101671743 B (45)授权公告日 2012.01.04 CN 101671743 B *CN101671743B* (21)申请号 200910236418.1 (22)申请日 2009.10.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材 街 59 号 (72)发明人 李文滨 韩英鹏 滕卫丽 孙德生 杜玉平 张忠臣 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 杨喆等 .大豆高蛋白基因分子标记及其在 。
2、大豆育种中的应用 .大豆科学 .2008, 第 27 卷 ( 第 2 期 ),186 189. 孙德生等 .大豆株高 QTL 发育动态分 析 . 作物学报 .2006,第32卷(第4期),509 514. 孙德生等 .大豆株高 QTL 发育动态分 析 . 作物学报 .2006,第32卷(第4期),509 514. (54) 发明名称 辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及 其专用引物 (57) 摘要 本发明公开了一种辅助筛选具有较低株高大 豆的方法及其专用引物。本发明的方法包括如下 步骤 ： 以待测大豆的基因组 DNA 为模板， 分别用引 物对甲、 乙进行 PCR 扩增， 得到待测大豆的扩增产。
3、 物 ； 以 Charleston 的基因组 DNA 为模板， 分别用 引物对甲、 乙进行 PCR 扩增， 得到 Charleston 的 扩增产物 ； 将待测大豆和 Charleston 的扩增产 物进行电泳， 如呈现同样的带型， 待测大豆为候选 的具有较低株高性状的大豆 ； 引物对甲由序列表 的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸组成 ； 引 物对乙由序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示 核苷酸组成。本发明还提供了大豆株高的数量性 状基因位点， 定位于 L 连锁群， 位于 SSR 引物位点 Sat_099 和 Sat_113 之间。应用本发明的方法可 通过大豆品种资源或杂交后代的。
4、 DNA 测定， 判断 是否含有该数量遗传位点 (QTL)-htL_1， 从而预 测大豆株高水平， 加快和提高对大豆株高的选育 速度。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 田园 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 CN 101671743 B1/1 页 2 1. 辅助筛选以 Charleston 为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的方法， 包 括如下步骤 ： 以待测大豆的基因组 DNA 为模板， 分别用引物对甲和引物对乙进行 PCR 扩增， 得到待测大豆的扩增产物 ； 以 Charleston 的基因组 。
5、DNA 为模板， 分别用引物对甲和引物对 乙进行PCR扩增， 得到Charleston的扩增产物 ； 将待测大豆的扩增产物和Charleston的扩 增产物进行电泳， 如果待测大豆的扩增产物和 Charleston 的扩增产物呈现同样的带型， 待 测大豆为候选的具有较低株高性状的大豆 ； 所述较低株高性状为成株株高小于 80cm 的性 状 ； 所述引物对甲由序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸组成 ； 所述引物对乙由 序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸组成。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述待测大豆为东农 594 与 Charleston 杂 。
6、交的子代。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述待测大豆为东农 594 与 Charleston 的 杂交后代 F1 的自交 12 代和自交 13 代。 4. 引物对甲和引物对乙在制备辅助筛选以 Charleston 为亲本衍生的大豆中具有较低 株高性状的大豆的试剂盒中的应用 ； 所述较低株高性状为成株株高小于 80cm 的性状 ； 所述引物对甲由序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸组成 ； 所述引物对乙由 序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸组成。 5. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述待测大豆为东农 594 与 Charlest。
7、on 杂 交的子代。 权 利 要 求 书 CN 101671743 B1/7 页 3 辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物 技术领域 0001 本发明涉及一种辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物。 背景技术 0002 大豆株高对产量的形成有重要的影响， 研究它的发育遗传规律有助于了解产量形 成的机制。大豆株高是多基因控制的数量性状， 人们曾以传统的统计分析方法对它的遗传 规律进行了大量研究。王连铮等总结了前人的研究结果， 认为株高的遗传力在 45 -75 之间。陈恒鹤指出， 大豆高矮秆杂交后代符合一或两对基因控制的分离比例， 但大多数杂 交后代都呈现多基因控制的连续分布。
8、。杨庆凯等认为株高的加性基因效应比非加性效应 更重要， 显性效应比上位性效应重要， 株高与产量的相关系数一般认为在 0.3-0.45 之间。 Wilcox 等认为株高对产量的影响较大。Luis 等用 2 组杂交材料的研究结果表明， 株高的广 义遗传力高达 80， 而狭义遗传力只有 38， 与产量呈极显著正相关。 0003 用常规方法进行育种， 具有准确性差、 育种效率低的局限性。近些年来， 随着分子 标记辅助育种技术的发展， 有效地解决了这一问题。例如该方法在水稻上辅助选育新品种 已有成功的先例， 且在提高育种速度和加快育种进程方面优势明显。彭应财等利用分子标 记辅助选择技术把白叶枯病抗性基因。
9、Xa21导入到强优恢复系辐恢838中， 选育出抗白叶枯 病恢复系中恢 218， 组配出强优势杂交中晚稻新组合协优 218， 该组合具有产量较高、 抗白 叶枯病、 易制种等特性， 于 2002 年 2 月通过江西省品种审定。曹立勇等利用分子标记辅助 选择育种技术育成带有抗白叶枯病基因 Xa21 的恢复系中恢 8006， 再与印水型胞质不育系 中 9A 组配的中晚兼用杂交稻新组合。并于 2004 年 3 月通过江西省品种审定， 2004 年 10 月 通过国家审定， 定名为国稻 1 号。 0004 大豆株高受生态环境影响极大， 年际间波动极大， 因此通过常规方法对大豆株高 性状进行选择非常困难。 。
10、发明内容 0005 本发明的目的是提供一种辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引 物。 0006 本发明提供的辅助筛选以 Charleston 为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的 大豆的方法， 包括如下步骤 ： 以待测大豆的基因组 DNA 为模板， 分别用引物对甲和引物对乙 进行 PCR 扩增， 得到待测大豆的扩增产物 ； 以 Charleston 的基因组 DNA 为模板， 分别用引 物对甲和引物对乙进行 PCR 扩增， 得到 Charleston 的扩增产物 ； 将待测大豆的扩增产物和 Charleston 的扩增产物进行电泳， 如果待测大豆的扩增产物和 Charleston 的。
11、扩增产物呈 现同样的带型， 待测大豆为候选的具有较低株高性状的大豆 ； 所述较低株高性状为成株株 高小于 80cm 的性状 ； 所述引物对甲由序列表的序列 1 和序列表的序列 2 所示核苷酸组成 ； 所述引物对乙由序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸组成。 0007 所述待测大豆可为东农 594 与 Charleston 杂交的子代。所述待测大豆具体可为 说 明 书 CN 101671743 B2/7 页 4 东农 594 与 Charleston 的杂交后代 F1 的自交 12 代和自交 13 代。 0008 本发明还保护辅助筛选以 Charleston 为亲本衍生的大豆中具有较。
12、低株高性状的 大豆的专用引物， 由引物对甲和引物对乙组成 ； 所述引物对甲由序列表的序列 1 和序列表 的序列 2 所示核苷酸组成 ； 所述引物对乙由序列表的序列 3 和序列表的序列 4 所示核苷酸 组成 ； 所述较低株高性状为成株株高小于 80cm 的性状。 0009 所 述 大 豆 可 为 东 农 594 与 Charleston 杂 交 的 子 代， 具 体 可 为 东 农 594 与 Charleston 的杂交后代 F1 的自交 12 代和自交 13 代。 0010 所述专用引物在制备辅助筛选以 Charleston 为亲本衍生的大豆中具有较低株高 性状的大豆的试剂盒中的应用也属于本。
13、发明的保护范围 ； 所述较低株高性状为成株株高小 于 80cm 的性状。 0011 所 述 大 豆 可 为 东 农 594 与 Charleston 杂 交 的 子 代， 具 体 可 为 东 农 594 与 Charleston 的杂交后代 F1 的自交 12 代和自交 13 代。 0012 本发明还保护一种辅助筛选 Charleston 为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状 的大豆的试剂盒， 包括所述专用引物 ； 所述较低株高性状为成株株高小于 80cm 的性状。 0013 所 述 大 豆 可 为 东 农 594 与 Charleston 杂 交 的 子 代， 具 体 可 为 东 农 594 。
14、与 Charleston 的杂交后代 F1 的自交 12 代和自交 13 代。 0014 本发明还保护一个大豆株高的数量性状基因位点， 定位于L连锁群， 位于SSR引物 位点 Sat_099 和 Sat_113 之间。 0015 本发明能够克服大豆株高受环境影响大， 且只能在成熟期进行评定的缺点， 在苗 期就能够通过分子标记对大豆品种和品系的株高水平进行预测和筛选， 对理想株高进行有 效选择， 减少人力和物力的浪费， 提高育种效率。 附图说明 0016 图 1 为与大豆株高相关的位点 -htL_1。 0017 图 2 为实施例 2 中的部分 PCR 产物电泳结果。 具体实施方式 0018 以下。
15、的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0019 东农 594 和 Charleston( 孙德生等， 大豆株高 QTL 发育动态分析大豆株高 QTL 发 育动态分析， 作物学报， 2006 ： 32(4)( 东北农业大学 )。东农 594 为东北农业大学大豆研究 所培育的稳定品系(1997年底)， 保存在东北农业大学大豆种质资源库中 ； Charleston为引 进美国栽培大豆品种(1997年底)， 保存在东北农业大学大豆种质资源库中(由于。
16、获自东北 农业大学大豆种质资源库， 原始来源不清 )。 0020 实施例 1、 与大豆株高紧密连锁的数量性状遗传位点 (htL_1) 的获得 0021 一、 Charleston 重组自交系的构建及成熟期株高的鉴定 0022 1、 Charleston 重组自交系的构建 0023 用中国大豆栽培品种东农 594( ) 和要测试的美国栽培品种 Charleston( ) 说 明 书 CN 101671743 B3/7 页 5 进行杂交， 得到杂种 F1； 由杂种 F1 代自花授粉获得子代， 通过子代单粒传法 (SingleSeed Descent， SSD)(Brim， C.A.1966.Amo。
17、dified pedigree method of selectionin soybeans. CropSci.6 ： 220.) 获得 143 个 F12代重组自交系。 0024 2、 Charleston 重组自交系成熟期株高的鉴定 0025 在呼兰、 绥化、 哈尔滨三地分别种植 143 个 F12代重组自交系。按 3 米行长， 6cm 株 距播种， 每行 51 株， 每个株系重复三次 ( 即三行 ) ； 随机区组。大豆完全成熟时， 在各地的 每个家系随机抽取 10 株单株， 测三次重复。 0026 二、 遗传图谱构建及 QTL 分析 0027 选取在父母本间具有扩增多态性的 SSR 引物。
18、对 143 个家系进行分析， 根据 SSR 条 带在群体中的分离情况， 将有母本类型条带的个体记为 “A” ， 有父本类型条带的个体记为 “B” ， 杂合的和缺失不清的记为 “-” 。 0028 利用Mapmaker/EXP3.0作图软件， 构建分子标记连锁图谱。 应用Group命令进行连 锁分析和分组 (LOD 5.0)， 连锁标记少于 8 个的用 Compare 命令进行优化排序， 多于 8 个 的用Ripple命令排序， 错误检测水平设为1， 利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距 (cM)。根据已由 Cregan 等定位的 SSR 标记作为锚定标记以确定相应的连锁。将 LOD 2。
19、.0 作为 QTL 存在的阙值， 用 WinQTLCartograph V2.0 进行 QTL 定位。在 L 连锁群上由 SSR 标 记 sat_099 和 sat_113 定位的与大豆株高紧密连锁的数量性状遗传位点 htL_1( 见图 1) 在 7 个环境下连续 4 年被检测到。 0029 表 1 控制大豆株高的数量遗传位点 (QTL)-htL_1 信息 0030 说 明 书 CN 101671743 B4/7 页 6 QTL 标记区间 (LOD， A， R2) LOD A R2 LOD A R2 2005( 哈尔滨 ) 2005( 绥化 ) 2005( 呼兰 ) htL_1 sat_099。
20、-sat_1 13 11.95， -13.46， 21.33 10.05， -15.55， 24.17 - 2006( 哈尔滨 ) 2006( 绥化 ) 2006( 呼兰 ) htL_1 sat_099-sat_1 1 3 8.20， -13.42， 17.98 - 7.68， -9.95， 16.94 2007( 哈尔滨 ) 2007( 绥化 ) 2007( 呼兰 ) htL_1 sat_099-sat_1 13 7.98， 12.9， 13.25 3.52， 9.77， 8.46 4.62， 12.71， 13.41 0031 LOD、 A、 R2为三个指标， 分别代表极大似然比、 加性效。
21、应值和遗传贡献率。 0032 实施例 2、 控制大豆株高的数量遗传位点 htL_1 的验证 说 明 书 CN 101671743 B5/7 页 7 0033 用实施例 1 得到的 143 个 F13重组自交系中的植株进行株高预测和株高测定。 0034 一、 株高预测 0035 先从待测植株的叶片中分离基因组 DNA， 然后在不同的 PCR 体系中， 分别利用分子 标记 Sat_099 和 Sat_113 进行 PCR 扩增， 通过检测是否存在数量遗传位点 (QTL) 来预测这 些家系所能达到的株高水平。 0036 Sat_099 ： 上游引物 ： 5 -GCGAAAATGGCAGAGATAA-。
22、3 ； 0037 下游引物 ： 5 -AATGCTAAAAGAGGAATGAAATAA-3。 0038 Sat_1 13 ： 上游引物 ： 5 -GGAGCATACAGCCTTAAGAGAT-3 ； 0039 下游引物 ： 5 -TGGGCATCAAAACTAAGAAAA-3。 0040 PCR 产物在 6聚丙烯酰胺凝胶 (PA) 测序胶上分离， 在 100 W 恒功率下电泳约 2 小时， 银染检测。 0041 部分结果见图 2。图 2 中， A 为 charleston 的带型， B 为东农 594 的带型。与东农 594 带型相同的待测植株应具有高杆性状， 反之， 与 charleston。
23、 带型相同的待测植株应具 有矮杆性状。 0042 二、 株高测定 0043 在呼兰、 绥化、 哈尔滨三地种植143个F13重组自交系。 按3米行长， 6cm株距播种， 每行 51 株， 每个株系重复三次 ( 即三行 ) ； 随机区组。大豆完全成熟时， 在各地的每个家系 随机抽取 10 株单株测成熟期株高。并与预测结果进行对比 ( 表 2， 表 3)。预测结果与实际 结果非常吻合， 基因型与表现型非常吻合。 0044 表 2 与大豆株高主效 QTL 相关的分子标记及应用 (1) 0045 家系 Q024 Q028 Q032 Q062 Q118 Q005 Q017 Q026 Q030 Q031 准。
24、确 性 哈尔滨 株高 (cm) 143.10 118.20 136.28 145.68 130.60 52.70 62.90 62.90 62.90 62.90 绥化株 高 (cm) 117.75 107.00 125.00 126.90 117.60 54.40 51.85 51.85 51.85 51.85 呼兰株 高 (cm) 126.70 110.70 105.90 120.40 123.10 53.43 53.88 53.88 53.88 53.88 Sat 099 B B B B B A A A A A 100 Sat 113 B B B B B A A A A A 100 004。
25、6 表 3 与大豆株高主效 QTL 相关的分子标记及应用 (2) 0047 说 明 书 CN 101671743 B6/7 页 8 家系 Q037 Q040 Q063 Q071 Q118 Q027 Q052 Q055 Q125 Q123 准确 性 哈尔滨 株高 (cm) 138.50 132.50 141.50 140.80 130.60 52.80 62.60 63.70 47.20 43.60 绥化株 高 (cm) 113.30 113.83 119.60 123.70 117.60 49.00 56.50 59.40 51.28 37.80 呼兰株 高 (cm) 114.70 111.2。
26、0 132.40 110.20 123.10 56.33 56.50 67.25 63.70 60.30 Sat_099 B B B B B A A A A A 100 Sat_113 B B B B B A A A A A 100 0048 序列表 0049 东北农业大学 0050 辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物 0051 CGGNARY92613 0052 1 0053 19 0054 DNA 0055 人工序列 0056 0057 0058 1 0059 gcgaaaatgg cagagataa 19 0060 2 0061 24 0062 DNA 0063 人工序列 0064 0065 0066 2 0067 aatgctaaaa gaggaatgaa ataa 24 0068 3 0069 22 0070 DNA 0071 人工序列 说 明 书 CN 101671743 B7/7 页 9 0072 0073 0074 3 0075 ggagcataca gccttaagag at 22 0076 4 0077 21 0078 DNA 0079 人工序列 0080 0081 0082 4 0083 tgggcatcaa aactaagaaa a 21 说 明 书 CN 101671743 B1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 。