技术领域
本发明属于基因治疗领域，具体而言，本发明涉及一套腺病毒载体系统及重组腺病毒构建方法。
背景技术
腺病毒是无胞膜的线性双链DNA病毒，目前腺病毒科分为5个属[1]，有多种型别的腺病毒已经被开发为基因转移载体，在基础科研、基因治疗和载体疫苗领域得到广泛应用[2-4]。
腺病毒的基因组长约26-46kb，这使得腺病毒载体的构建与常见质粒载体(一般长度小于10kb)不同。太长的基因组使得在腺病毒载体上富集一个多克隆位点非常困难。针对重组腺病毒的构建，开发了多种方法[5-7]。
腺病毒载体的构建经历了体外直接连接、包装细胞内重组、细菌内重组、位点特异性重组4个发展阶段，同时随着分子生物学技术的发展，改进的体外连接法又得到应用[5-7]。(1) 体外连接法。这种方法需要全长腺病毒基因组和一个含腺病毒基因组左末端序列的质粒，包括左端反向末端重复(Inverted terminal repeat,ITR)、包装信号和E1A的增强子序列。将目的基因克隆到质粒的病毒序列下游，ClaI酶切获得含目的基因的基因组左末端，连接到ClaI酶解的野生型腺病毒基因组(ClaI在病毒基因组仅有一个酶切位点，位于E1A基因内部)，将得到的含目的基因的的基因组DNA直接转染包装细胞293，产生重组病毒颗粒。这种方法需要培养野生型腺病毒以提取病毒基因组，能够使用的酶切位点仅有一个，连接效率低，而且仅删除了部分E1A基因，外源基因载量有限，所以现已淘汰不用。(2)真核细胞同源重组法。1994 年，Graham F建立了在293细胞同源重组产生重组腺病毒的方法。这个方法需要2个质粒：骨架质粒含有腺病毒绝大部分基因组序列，但不含有包装信号；穿梭质粒含有ITR、包装信号和目的基因克隆位点，以及两段与骨架质粒有重叠的序列。将目的基因克隆到穿梭质粒，与骨架质粒共转染293细胞，由于这两个质粒的部分序列有重叠，能够在细胞内发生同源重组，最终产生完整的载体基因组，并包装出重组病毒颗粒。该方法曾经被广泛使用，推动了腺病毒载体的发展。由于细胞内重组效率低，某些重组事件还可能产生可复制病毒(RCV)，必需经过噬斑纯化才能获得正确的克隆化的重组病毒，费时费力，正逐渐被其他方法替代。(3)细菌内同源重组法。这种方法使用的骨架质粒和穿梭质粒与细胞内重组法相似，目的基因克隆到穿梭质粒后，与骨架质粒共转化细菌细胞(如大肠杆菌BJ5183菌株)，这种菌种细胞内重组酶阳性，两质粒在细菌内发生重组，通过抗生素筛选得到重组质粒(含有腺病毒载体基因组)，扩增纯化后转染包装细胞，拯救出重组病毒颗粒。这种方法的代表是目前广泛使用的AdEasy 系统(美国stratagene公司)。由于细菌细胞内重组得到克隆化的腺病毒质粒，在包装细胞内拯救获得的是均一的种子病毒，无需进行耗时的噬斑纯化，可以直接用于重组病毒扩增。但细菌内重组效率较低，存在一些假阳性克隆，重组酶阳性细菌一般不能用于腺病毒质粒的大量扩增，获得的阳性腺病毒质粒克隆需要转化新的细菌细胞，以制备足量质粒用于病毒拯救；另外，带有重复序列或复杂高级结构的质粒在重组酶阳性细菌复制时，质粒基因组不稳定，可能发生部分序列丢失，产生变异的腺病毒质粒，造成无法拯救或拯救出错误的重组病毒。 (4)位点特异性重组法。这类方法使用来源于噬菌体的重组酶，这类重组酶能够识别特异性序列位点(长度数十碱基对至数百碱基对)并引发含有该位点的序列之间的重组；在腺病毒骨架和穿梭质粒中添加重组酶能够识别的特异性位点，在细胞内表达对应的噬菌体重组酶或体外使用重组酶，介导骨架质粒和穿梭质粒之间的位点特异性重组，将目的基因引入骨架质粒，形成带有重组腺病毒基因组的腺病毒质粒；转染包装细胞，进行病毒载体拯救[6,8]。该方法进一步简化了腺病毒质粒的制备过程，它的缺限是在腺病毒基因组的某些部位不可避免的残留了重组酶特异性识别位点。(5)利用归位内切酶(Homing Endonuclease)的直接连接法。归位内切酶识别的序列长度大于20bp，其中特异性序列至少9～11bp，这意味着这类内切酶的识别切割的序列非常少见，在长36kb的野生型腺病毒基因组中没有该酶的切割位点。这种方法也使用类似骨架质粒和穿梭质粒的2个质粒，但2者间不需要有序列重叠，目的基因克隆到穿梭质粒上，使用归位内切酶切割后连接到骨架质粒形成完整载体基因组，转染包装细胞，拯救出重组病毒。美国Clontech公司的Adeno-X系统采用该方法。另外，Clontech公司近年来开发了Adeno-X系统3，这个系统将带有目的基因的PCR产物利用In-Fusion技术直接插入到该公司提供的已经线性化pAdenoX载体中，即获得腺病毒质粒。该方法需要购买线性化的 pAdenoX载体，外源基因插入位点和重组病毒基因组其他部分已经确定，不能用于重组腺病毒的人工改造。
目前已有的腺病毒载体系统均存在缺陷，有些构建步骤繁琐，耗时较长，有些在重组病毒中引入了不必要的外源序列，有些不能用于重组腺病毒的反向遗传改造。近年来，新的生物特性不同的腺病毒不断被发现，因此，本领域对构建过程更加快捷简便的、人工改造更加方便灵活的腺病毒载体系统和重组病毒构建方法存在需求。
发明内容
为了满足本领域的需求，本发明的目的是提供新的腺病毒载体系统和重组病毒构建方法。
本发明人通过在腺病毒载体基因组引入单一酶切位点，借助DNA组装技术，建立了在腺病毒载体基因组直接无缝插入外源目的基因的载体系统和重组腺病毒构建方法。
在第一方面，本发明提供一套腺病毒载体系统，包括两个腺病毒质粒和一个穿梭质粒。
其中，腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP由本发明人设计并构建得到(实施例1-实施例4)。本发明人利用前期构建的pAdeasyf11p腺病毒骨架质粒(含有改造的fiber基因)[9]、pAd5GXP 腺病毒质粒(消除了HAdV-5基因组内部原有的PmeI限制性内切酶位点)[10]，构建了腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP。pKAd5f11p-EF1aP质粒含有E1/E3区缺失的HAdV-5基因组，原HAdV-5 fiber基因由HAdV-5、HAdV-11p的融合fiber基因(F5-11p)替代，基因组内部原有的PmeI限制性内切酶位点被消除；在原E1区位置添加有人EF1a启动子和SV40polyA加尾信号，并且在 EF1a启动子和SV40polyA加尾信号之间添加单一的PmeI酶切位点(全质粒唯一的PmeI位点)；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因。融合基因F5-11p由HAdV-5fiber的tail结构域与HAdV-11p fiber的shaft和knob结构域编码区构成。
能够利用后述的DNA组装方法直接在pKAd5f11p-EF1aP的PmeI位点引入外源目的基因，拯救重组病毒。腺病毒通过表达在病毒颗粒五邻体的fiber识别、结合细胞受体，进而感染靶细胞，HAdV-5的fiber蛋白结合细胞的受体是CAR分子，HAdV-11p的fiber识别结合的细胞受体是DSG2或CD46分子[11,12]。由腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP出发构建的重组病毒将带有融合的fiber蛋白，从而具有HAdV-11p病毒的嗜向性，能够通过结合DSG2或CD46分子感染细胞， DSG2或CD46分子在肿瘤细胞或造血细胞的表达丰度较CAR高，故重组病毒能够更高效地感染肿瘤细胞或造血细胞[9,13]。另外，EF1a是组成型表达的高效启动子，由其控制的目的基因能够在靶细胞高效表达[14]。
腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI是在构建pKAd5f11p-EF1aP基础上，进一步删除EF1a启动子而得到的(实施例7)，它迎合了使用者自行选择目的基因调控元件(主要是指启动子)或同时携带多个目的基因表达框的需求。pKAd5f11pES-PmeI质粒不含有EF1a启动子，其他成分与pKAd5f11p-EF1aP完全相同，单一酶切位点PmeI位点位于腺病毒包装信号(ES)之后。 pKAd5f11pES-PmeI可以单独使用，例如能够利用后述的DNA组装方法将多个基因元件直接引入pKAd5f11pES-PmeI质粒的PmeI位点(原E1区位置)，拯救重组病毒(实施例9和实施例10)；也可以与穿梭质粒pUC19-PM联合使用。当希望引入的基因元件太多或PCR方法不便使用时，可以采用先将基因元件克隆到穿梭质粒的策略(实施例12)。
穿梭质粒pUC19-PM是将人工合成的一段序列通过DNA组装克隆到pUC19质粒的多克隆位点部位形成的。其含有一个多克隆位点，由限制性内切酶EcoRI，SacI，KpnI，SmaI，BamHI， XbaI，EcoRV，SalI，PstI，SphI，HindIII，ClaI和EcoRV酶切位点依次组成；多克隆位点上游和下游分别含有一段与pKAd5f11pES-PmeI质粒的PmeI位点两侧序列一致的同源重叠区；同源重叠区外侧分别含有一个PacI酶切位点；同时还含有来源于pUC19质粒的在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322复制起点、氨苄青霉素抗性基因(图18)。当需要在腺病毒载体中引入多个基因元件、多个基因表达框或者PCR方法不便使用时(例如，片段存在二级结构或者产物太长造成扩增困难，或者担心PCR反应可能会造成突变)，可以采用酶切-连接法将这些片段依次克隆到穿梭质粒的多克隆位点，然后使用PacI将这些片段连同两端的同源重叠区一并切下，利用后述的DNA组装方法克隆到pKAd5f11pES-PmeI质粒的PmeI位点，得到携带目的基因的腺病毒质粒(实施例12)。
在第二方面，本发明提供利用第一方面的腺病毒载体系统制备携带外源目的基因的重组腺病毒的方法。
发明人提供了较目前方法手段更简便的重组腺病毒载体构建方法。该方法包括：使用限制性内切酶将腺病毒质粒自外源基因插入部位切开，回收线性化的腺病毒质粒DNA；PCR或者酶切得到线性含有目的基因的DNA；上述两段线性DNA混合，进行DNA组装反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因的腺病毒质粒。后续的由腺病毒质粒产生重组病毒的方法是前人已经建立的通用方法，包括：使用选定的限制性内切酶酶切含有目的基因的腺病毒质粒，释放出完整的重组病毒基因组，即切除质粒骨架(一般包括抗生素抗性基因和质粒复制起点)，回收DNA，转染包装细胞，拯救重组病毒；可以利用包装细胞继续扩增拯救得到的重组病毒。发明人提供的方法通过DNA组装反应和细菌转化实验即可实现了在腺病毒质粒中引入外源目的基因，较现有的方法更加方便和快捷。这个方法的使用需要2个前提条件：(1)需要在腺病毒质粒的外源基因插入部位引入一个(或多个)单一酶切位点。当使用对应限制性内切酶切割腺病毒质粒时，可以将质粒在外源目的基因克隆部位切开，形成一条线性化的DNA链，使得DNA组装能够进行，并保证了外源基因定向克隆。天然的腺病毒基因组一般不存在这样的单一酶切位点，所以必需在前期经过较繁杂的分子克隆操作对拟使用的腺病毒基因组进行改造，引入可使用的单一酶切位点，构建克隆外源基因用腺病毒质粒。含有这种单一酶切位点的腺病毒质粒一旦构建成功，后续的目的基因插入就会因为本方法的使用而变得简单。(2)在目的基因(或目的序列)的两端必需引入DNA组装所需的同源重叠区。同源重叠区一般长15-60bp，可以通过设计PCR引物，添加到引物的 5’端，利用PCR扩增直接添加到外源基因两侧(实施例5和实施例9)；也可以通过其他方法添加到外源基因两侧，例如预先构建一个穿梭质粒，该穿梭质粒的多克隆位点两侧含有同源重叠区，将目的基因克隆到多克隆位点后，能够通过限制性酶切将同源重叠区与目的基因一同切下，形成一条线性DNA链(实施例12)。DNA组装反应是指借用同源重叠区将线性DNA 片段融合在一起的技术，常见的是Gibson组装技术。在满足上述第一个前提条件的情况下(即已经制备含单一酶切位点的克隆外源基因用腺病毒质粒)，外源基因可以采用常规酶切-连接法直接克隆到该位点。但采用DNA组装方法具有优势：它的连接效率更高，转化感受态细菌后能产生更多的阳性菌落克隆；当采用一个单一酶切位点时，酶切-连接方法将产生正向和反向插入的两种阳性菌落，而DNA组装方法只产生定向克隆；使用酶切-连接法时，插入的目的片段受到该酶切位点的限制，即目的片段内部不能含有拟使用的限制性内切酶酶切位点，否则目的片段将被切成两条或多条片段，严重影响连接效率或无法成功连接，使用DNA组装法时目的片段不受酶切位点的限制。
在第三方面，本发明提供利用第一方面的腺病毒载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒。其中所述外源目的基因可以是欲提高表达量的目的蛋白基因，例如，但不限于，免疫调节因子或病毒结构蛋白基因等。利用该腺病毒载体系统制备的重组病毒为E1/E3区缺失的复制缺陷型病毒。与常见的基于HAdV-5基因组的重组病毒不同，该类病毒含有融合fiber 基因(F5-11p)，由HAdV-5fiber的tail编码区与HAdV-11p的shaft和knob编码区融合而成，其表达的融合蛋白F5-11p赋予重组病毒识别和结合细胞受体CD46和DSG-2的能力，从而对该类受体表达丰度高的细胞具有更强的外源基因转导能力。已有的研究表明CD46和DSG-2 在肿瘤细胞或造血细胞表达水平较高，所以构建的重组病毒对肿瘤细胞或造血细胞将有较高的感染效率[9,11,13]。
在第四方面，本发明提供利用第一方面的腺病毒载体系统或由该载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。基于本发明第一方面的腺病毒载体系统，结合本领域中相关的技术手段，本领域技术人员能够预计到本发明产生的携带外源目的基因的重组病毒在重组疫苗研究或基因治疗试剂盒中具有广阔的应用前景。优选地，所述重组疫苗可以为肿瘤疫苗，基因治疗试剂盒可以为溶瘤病毒。
相应地，本发明提供一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组腺病毒，其中所述携带外源目的基因的重组腺病毒利用本发明第一方面的腺病毒载体系统制备得到。具体制备方法可以为本发明第二方面提供的DNA组装法，也可以为酶切-连接法。
本发明还可以提供一种基因治疗试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面的腺病毒载体系统。取决于选择的外源目的基因，所得的基因治疗试剂盒可用于治疗相关疾病。例如，将腺病毒E1区基因插入腺病毒质粒，利用所述腺病毒载体系统制备所需要的条件复制型腺病毒 (溶瘤腺病毒)，可以用于治疗人类相关恶性肿瘤。
在第五方面，本发明提供一种预防或治疗疾病的方法，所述方法应用本发明的疫苗或基因治疗试剂盒进行。换言之，所述方法可以利用本发明的腺病毒载体系统进行。所述疾病可以是与利用本发明的腺病毒载体系统引入的外源目的基因相关的疾病，例如恶性肿瘤。当利用本发明获得的载体疫苗进行治疗时，适用的受试者是哺乳动物或者是人。
由此可见，本发明提供的腺病毒载体系统及重组病毒构建方法能够拯救得到相应的重组腺病毒。该腺病毒载体系统及重组病毒构建方法可以作为良好的构建重组疫苗和基因治疗试剂盒的工具，在腺病毒质粒中引入外源目的基因表达框，进而拯救得到携带外源目的基因的重组腺病毒，并且所得到的携带外源目的基因的重组腺病毒可以用于制备具有相应功能的重组疫苗或基因治疗试剂。显然，本发明的腺病毒载体系统及重组病毒构建方法具有现有技术中其他腺病毒载体系统所不具备的优点，应用更广。
综上所述，本发明提供下述技术方案：
1.一套腺病毒载体系统，其包括两个腺病毒质粒和一个穿梭质粒，其中所述的两个腺病毒质粒分别为pKAd5f11p-EF1aP和pKAd5f11pES-PmeI，并且所述穿梭质粒为pUC19-PM。
2.根据第1项所述的两个腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP和pKAd5f11pES-PmeI，其特征在于：含有E1/E3区缺失的人5型腺病毒(HAdV-5)基因组；原HAdV-5fiber基因由HAdV-5、 HAdV-11p的融合fiber基因(F5-11p)替代；HAdV-5基因组原有PmeI位点被突变去除；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322复制起点、卡那霉素抗性基因。
3.根据第1项和第2项所述的两个腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP和pKAd5f11pES-PmeI，其特征在于：含有的融合fiber基因(F5-11p)由HAdV-5fiber的tail结构域与HAdV-11p fiber的shaft 和knob结构域编码区融合得到。
4.根据第1项、第2项和第3项所述的腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP，其特征在于：在原 E1区位置添加有人EF1a启动子和SV40polyA加尾信号；并且在EF1a启动子和SV40polyA加尾信号之间含有一个单一的限制性内切酶PmeI酶切位点(GTTTAAAC)。
5.根据第1项、第2项和第3项所述的腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI，其特征在于：在原 E1区位置添加有一个单一的限制性内切酶PmeI酶切位点(GTTTAAAC)。
6.根据第1项所述的穿梭质粒pUC19-PM，其特征在于：含有一个多克隆位点，由限制性内切酶EcoRI、SacI、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、EcoRV、SalI、PstI、SphI、HindIII、ClaI 和EcoRV酶切位点依次组成；多克隆位点上游和下游分别含有一段与pKAd5f11pES-PmeI质粒的PmeI位点两侧序列一致的同源重叠区；同源重叠区外侧分别含有一个PacI酶切位点 TTAATTAA)；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322复制起点、氨苄青霉素抗性基因。
7.一种重组腺病毒的构建方法，该方法包括：使用限制性内切酶将腺病毒质粒自外源基因插入部位切开，回收线性化的腺病毒质粒DNA；PCR或者酶切得到线性含有目的基因的 DNA；上述两段线性DNA混合，进行DNA组装反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因的腺病毒质粒。
8.根据第7项所述的方法，其中所述的腺病毒质粒在外源基因插入部位含有一个或数个人工引入的限制性内切酶酶切位点，这类位点仅存在于外源基因插入部位，在该腺病毒质粒的其他部位不含有。
9.根据第7项所述的方法，其中所述的线性含有目的基因的DNA，其特征在于：该DNA 的两端分别含有一段与所述腺病毒质粒外源基因插入部位两侧序列一致的同源重叠区。
10.根据第9项所述的同源重叠区能够满足DNA组装反应的要求，一般长度15-60bp。
11.根据第9项和第10项中所述的同源重叠区可以通过设计引物进行PCR扩增直接添加到外源基因两侧；也可以通过其他方法添加到外源基因两侧，例如预先克隆到穿梭质粒的多克隆位点两侧。
12.第7项所述的DNA组装反应是指借用同源重叠区将线性DNA连接在一起的技术，常见的是Gibson组装技术。
13.一种腺病毒载体构建试剂盒，其包含第1项至第12项中任一项所述的腺病毒载体系统或重组腺病毒构建方法。
14.第1项至第12项中任一项所述的腺病毒载体系统或重组腺病毒构建方法在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。
15.一种基因治疗试剂盒，其包含第1项至第12项中任一项所述的腺病毒载体系统或重组腺病毒构建方法。
16.一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组腺病毒，其中所述携带外源目的基因的重组腺病毒利用第1项至第12项中任一项所述的腺病毒载体系统或重组腺病毒构建方法制备得到。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1是E1/E3缺失的含人EF1a启动子的腺病毒质粒pAd5f11p-EF1a构建示意图。先用重叠延伸PCR扩增得到含有HAdV-5包装信号、人EF1a启动子和多克隆位点的DNA片段 (ES-EF1ap-MCS)；借助酶切-连接法将ES-EF1ap-MCS片段克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV 的BsrGI/EcoRV位点，得到外源基因启动子被替换为EF1ap的穿梭质粒pSh5-EF1a；再使用 PmeI酶切线性化穿梭质粒，电转化大肠杆菌BJ5183菌株，与骨架质粒pAdEasyf11p进行同源重组(前期构建的腺病毒骨架质粒pAdEasyf11p含有HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因F5-11p)，得到腺病毒质粒pAd5f11p-EF1a。在pAd5f11p-EF1a质粒中，HAdV-5的E1/E3 区缺失，E1区被替换为EF1a启动子和SV40polyA加尾信号，HAdV-5的fiber基因被替换为 F5-11p。图中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框(ampicillin resistance ORF)；CMVp：人巨细胞病毒启动子；EF1ap：人EF1a启动子；ES：包装信号(encapsidation signal)；F5-11p： HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；ITR：反向末端重复(inverted terminal repeat)；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ori：pBR322复制起点(origin of replication)；pA：SV40polyA加尾信号；1411Sh5EF1aF1，1411Sh5EF1aR1，1411Sh5EF1aF2， 1411Sh5EF1aR2，1411Sh5EF1aF3和1411Sh5EF1aR3为用于重叠延伸PCR的6条引物。
图2是突变去除PmeI酶切位点的腺病毒质粒pAd5f11p-CGXP构建示意图。先利用BamHI 酶切从pAd5f11p-EF1a质粒分离得到含有F5-11p基因的10999bp片段；通过酶切-连接法，将改片段替换pAd5GXP质粒中的对应部分得到pAd5f11p-CGXP质粒(前期构建的腺病毒质粒pAd5GXP基因组中原有的PmeI位点已被突变去除)。pAd5f11p-CGXP腺病毒质粒中含有 F5-11p基因，同时原有的单一PmeI酶切位点被突变(即不含有PmeI位点)。图中，CMVp：人巨细胞病毒启动子；EF1ap：人EF1a启动子；F5-11p：HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；GFP：绿色荧光蛋白编码框；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)； ori：pBR322复制起点(origin of replication)。
图3是E1区多克隆位点被重新改造的小质粒pKAd5-EF1aBP构建示意图。先设计合成一对3’端能够互补配对的引物，其自身退火后利用DNA聚合酶进行延伸后得到109bp双链DNA 片段(EcoRI-PacI-BamHI)；BstZ17I酶切pAd5f11p-EF1a质粒，电泳后回收含有EF1a启动子和多克隆位点区域的7210bp片段，与上述109bp片段进行DNA组装，得到质粒 pKAd5-EF1aBstZ17I；KpnI/EcoRV双酶切pKAd5-EF1aBstZ17I质粒，去除多克隆位点，电泳后回收7233bp片段，与合成58nt单链寡核苷酸片段进行DNA组装，得到pKAd5-EF1aBP 质粒。pKAd5-EF1aBP质粒中，原有的多克隆位点被PmeI位点取代，在原BstZ17I位点处增加了便于DNA组装操作的两段同源重叠区。图中，EF1ap：人EF1a启动子；F5-11p：HAdV-5 与HAdV-11p fiber的融合基因；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)； ori：pBR322复制起点(origin of replication)；1805F11p-EF1PmeA1-1805F11p-EF1PmeA3为化学合成的单链寡核苷酸。
图4是外源基因克隆用腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP构建示意图。EcoRI酶切 pKAd5-EF1aBP，电泳回收7242bp线性化片段；BstZ17I/PacI双酶切pAd5f11p-CGXP质粒，电泳回收26781bp片段；合并上述2片段，进行DNA组装，得到pKAd5f11p-EF1aP。在 pKAd5f11p-EF1aP质粒中，HAdV-5的E1/E3区缺失，E1区被替换为EF1a启动子和SV40polyA 加尾信号，HAdV-5的fiber基因被替换为HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因(F5-11p)，外源基因编码区可以通过DNA组装直接克隆到其PmeI位点。pKAd5f11p-EF1aP质粒PmeI 单一酶切位点及两侧各40bp序列的详细信息显示在下方，可在PmeI两侧序列中选择设计用于DNA组装的同源重叠区。图中，CMVp：人巨细胞病毒启动子；EF1ap：人EF1a启动子； F5-11p：HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；GFP：绿色荧光蛋白编码框；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ori：pBR322复制起点(origin of replication)； pA：SV40polyA加尾信号。
图5是外源基因克隆用腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP使用EcoRV酶切鉴定的电泳图谱。 M1:Lambda/HindIII DNA标记；M2:DL2000 DNA分子量标记；P:EcoRV酶切 pKAd5f11p-EF1aP质粒(33964bp)，预计片段分子量为：1238,2052,2617,3075,4545,7637, 12800bp。
图6是将外源绿色荧光蛋白基因克隆到腺病毒质粒的构建示意图。PCR扩增得到两端带有重叠区的GFP片段；直接将PCR产物与PmeI线性化的pKAd5f11p-EF1aP进行DNA组装，得到携带GFP基因的腺病毒质粒pKAd5f11p-EPG。PCR产物两段的重叠区(约25bp)是通过合成在引物5’端的方式添加的。图中，CMVp：人巨细胞病毒启动子；EF1ap：人EF1a启动子；F5-11p：HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；GFP：绿色荧光蛋白编码框；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；OL1和OL2：上游重叠区和下游重叠区(overlap 1，overlap 2)；ori：pBR322复制起点(origin of replication)；pA：SV40 polyA 加尾信号；1805F11p-EF1PmeGFP1/1805F11p-EF1PmeGFP2为用于PCR扩增的一对引物。
图7是对腺病毒质粒pKAd5f11p-EPG克隆进行限制性内切酶分析筛选和鉴定的结果。以 pKAd5f11p-EF1aP质粒HindIII酶切结果为对照。M:Lambda/HindIII DNA标记；HindIII酶切 pKAd5f11p-EPG预计片段分子量为：75,2081,2993,4597,5209,5322,6421,8009bp；HindIII 酶切pKAd5f11p-EF1aP质粒预计片段分子量为：75,2081,4597,5209,5322,8009,8671bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明随机挑选的5个克隆均为 pKAd5f11p-EPG质粒。
图8显示HAdV5f11p-EPG重组病毒在293细胞中的拯救。使用PacI酶切线性化 pKAd5f11p-EPG腺病毒质粒后转染293细胞，培养5天后，荧光显微镜观察到单层细胞上 GFP阳性细胞形成荧光灶，这说明成功拯救了重组病毒HAdV5f11p-EPG。
图9是对重组腺病毒HAdV5f11p-EPG基因组DNA进行限制性内切酶分析鉴定的结果。 M1:Lambda/HindIII DNA标记；M2:DL2000DNA分子量标记；HindIII酶切预计片段分子量为：75,1008,2081,2429,2993,4597,5209,5322,8009bp；EcoRV酶切预计片段分子量为：1238, 2052,2181,2617,3075,4545,7637,8378bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明拯救的病毒确为HAdV5f11p-EPG。
图10是重组腺病毒HAdV5f11p-EPG感染A549细胞后荧光显微镜观察GFP的表达。重组病毒HAdV5f11p-EPG以200vp/cell的感染强度感染A549细胞；感染2天后荧光显微镜观察，结果显示超过90％的细胞表达GFP。
图11是外源基因表达框克隆用腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI构建示意图。先自 pKAd5-EF1aBstZ17I质粒删除EF1a启动子和多克隆位点：AatII/EcoRV双酶切 pKAd5-EF1aBstZ17I质粒，回收5892bp片段，与合成的单链寡核苷酸进行DNA组装，得到 pKAd5ES-BP质粒(5904bp)；再将pKAd5ES-BP质粒用EcoRI酶切线性化，与BstZ17I/PacI 双酶切pAd5f11p-CGXP质粒电泳回收的26781bp片段进行DNA组装，得到 pKAd5f11pES-PmeI质粒。在pKAd5f11pES-PmeI中，HAdV-5的E1/E3区缺失，原E1区添加了PmeI位点，HAdV-5的fiber基因被替换为HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因 (F5-11p)。pKAd5f11pES-PmeI质粒PmeI单一酶切位点及两侧40bp序列的详细信息也显示在图中，可在PmeI两侧序列中选择设计用于DNA组装的同源重叠区。图中，CMVp：人巨细胞病毒启动子；EF1ap：人EF1a启动子；ES：包装信号(encapsidation signal)；F5-11p： HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；GFP：绿色荧光蛋白编码框；ITR：反向末端重复 (inverted terminal repeat)；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ori： pBR322复制起点(origin of replication)；pA：SV40polyA加尾信号。
图12是外源基因表达框克隆用腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI使用EcoRV酶切鉴定的电泳图谱。M1:Lambda/HindIII DNA标记；EcoRV酶切pKAd5f11pES-PmeI质粒(32626bp)，预计片段分子量为：1238,2052,2617,3075,4545,5526,5936,7637bp。
图13是可诱导表达慢病毒载体质粒pLVX-TRE3G-TetGFP的构建示意图。先使用重叠延伸PCR将Tet-on 3G编码区与WPRE融合为一条片段，通过酶切-连接方法插入pLVX-TRE3G 质粒的两个PstI位点之间，得到的质粒命名为pLVX-TRE3G-Teton；再将PCR扩增获得的 GFP编码区通过酶切-连接方法克隆到pLVX-TRE3G-Teton的BamHI/EcoRI位点之间，得到 pLVX-TRE3G-TetGFP质粒。图中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框(ampicillin resistance ORF)；GFP：绿色荧光蛋白编码框；LTR：长末端重复；MCS：多克隆位点；ori：pBR322 复制起点(origin of replication)；pPGK：鼠磷酸甘油酸激酶启动子(Mouse phosphoglycerate kinase 1promoter)；pTR：TRE3GV启动子；Puro：嘌呤霉素抗性基因；Tet-On 3G：Tet-On 3G 转录激活蛋白；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)；1306TetonP1-1306TetonP4为用于重叠延伸PCR的4 条引物；1306TET-GFPF1和1306TET-GFPR1为用于扩增GFP编码区的一对引物。
图14是将PCR扩增得到的GFP表达调控元件克隆到腺病毒质粒的构建示意图。以 pLVX-TRE3G-TetGFP质粒为模板，PCR扩增得到两端带有重叠区的GFP表达调控元件 (TG-teton)；直接将PCR产物与PmeI线性化的pKAd5f11pES-PmeI质粒进行DNA组装，得到携带GFP表达调控元件的腺病毒质粒pKAd5f11p-TGFPT。PCR产物两段的重叠区(约 25bp)是通过合成在引物5’端的方式添加的。图中，GFP：绿色荧光蛋白编码框；ES：包装信号(encapsidation signal)；F5-11p：HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ori：pBR322复制起点(origin of replication)； pPGK：鼠磷酸甘油酸激酶启动子(Mouse phosphoglycerate kinase 1promoter)；pTR：TRE3GV 启动子；Tet-On 3G：Tet-On 3G转录激活蛋白；1805F11p-TGteton1和1805F11p-TGteton2为用于PCR扩增的一对引物。
图15是对腺病毒质粒pKAd5f11p-TGFPT克隆进行限制性内切酶分析筛选和鉴定的结果。 M1:Lambda/HindIII DNA标记；M2:DL2000DNA分子量标记；EcoRV酶切pKAd5f11p-TGFPT 预计片段分子量为：1238,2052,2617,3075,4545,5936,7637,7942bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明随机挑选的5个克隆均为pKAd5f11p-TGFPT质粒。
图16是对重组腺病毒HAdV5f11p-TGFPT基因组DNA进行限制性内切酶分析鉴定的结果。M:Lambda/HindIII DNA标记；BglII酶切预计片段分子量为：271,1268,1497,1551,2151, 5177,5533,6180,8430bp；EcoRV酶切预计片段分子量为：1238,2052,2181,2617,2777,3075, 4545,5936,7637bp；HindIII酶切预计片段分子量为：75,1008,1125,2081,4597,4632,5209, 5322,8009bp；NdeI酶切预计片段分子量为：539,4095,8901,18523bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明拯救的病毒确为HAdV5f11p-TGFPT。
图17是重组腺病毒HAdV5f11p-TGFPT感染A549细胞后荧光显微镜观察GFP的诱导表达。纯化的重组病毒以1000vp/cell的感染强度感染A549细胞，在培养基中不添加或添加终浓度为1μg/ml的强力霉素(Dox)；感染2天后荧光显微镜观察。不添加Dox，未见GFP+细胞；添加Dox，大于50％的细胞表达GFP。说明病毒感染后，Dox能够调控细胞的GFP表达。
图18是含同源重叠区的穿梭质粒pUC19-PM构建示意图。设计合成6条引物，通过重叠延伸PCR合成190bp的DNA片段，该片段中部为多克隆位点，多克隆位点外侧为两段与腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI的PmeI位点两侧序列一致的同源重叠区(约30bp，用于将来与腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI的DNA组装)，这个重叠区外侧各有一个PacI酶切位点， PacI位点外侧是与pUC19质粒多克隆位点两侧序列一致的同源重叠区(用于本次与线性化 pUC19质粒的DNA组装)；PCR产物直接与EcoRI/HindIII双酶切线性化的pUC19质粒进行 DNA组装，得到pUC19-PM质粒。pUC19-PM质粒两个PacI位点及其内侧序列的详细信息也显示在图的下方，与PacI位点相邻的以小写字母表示的是同源重叠区，中部为多克隆位点。图中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框(ampicillin resistance ORF)；MCS：多克隆位点； ori：pBR322复制起点(origin of replication)；1800PacI-MCS1-1800PacI-MCS6为用于重叠延伸PCR的6条引物。
图19是借助穿梭质粒pUC19-PM构建腺病毒质粒示意图。先用ClaI/KpnI双酶切 pLVX-TRE3G-TetGFP质粒，电泳回收3140bp片段，使用酶切-连接法将该片段(含GFP表达调控元件)克隆到pUC19-PM多克隆位点的ClaI/KpnI之间，得到含目的基因表达框的穿梭质粒pUC19-PTGFPW；PacI酶切pUC19-PTGFPW质粒，电泳回收3217bp片段(两侧含同源重叠区)，直接与PmeI线性化的pKAd5f11pES-PmeI质粒进行DNA组装，得到 pKAd5f11p-TGFPW腺病毒质粒。图中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框(ampicillin resistance ORF)；ES：包装信号(encapsidation signal)；F5-11p：HAdV-5与HAdV-11p fiber的融合基因；GFP：绿色荧光蛋白编码框；Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)； LTR：长末端重复；ori：pBR322复制起点(origin of replication)；pPGK：鼠磷酸甘油酸激酶启动子(Mouse phosphoglycerate kinase 1promoter)；pTR：TRE3GV启动子；Tet-On 3G：Tet-On 3G转录激活蛋白；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。
图20是对腺病毒质粒pKAd5f11p-TGFPW克隆进行限制性内切酶分析筛选和鉴定的结果。M:Lambda/HindIII DNA标记；HindIII酶切pKAd5f11p-TGFPW预计片段分子量为：75, 2081,4597,4631,5209,5322,5857,8009bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明随机挑选的5个克隆均为pKAd5f11p-TGFPW质粒。
图21是对重组腺病毒HAdV5f11p-TGFPW基因组DNA进行限制性内切酶分析鉴定的结果。M:Lambda/HindIII DNA标记；BglII酶切预计片段分子量为：271,1268,1497,1551,2151, 5177,5533,6180,9169bp；EcoRV酶切预计片段分子量为：1238,2052,2181,2617,3075,3516, 4545,5936,7637bp；HindIII酶切预计片段分子量为：75,1008,1865,2081,4597,4631,5209, 5322,8009bp；NdeI酶切预计片段分子量为：1279,4095,8901,18522bp。电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明拯救的病毒确为HAdV5f11p-TGFPW重组病毒。
图22是重组腺病毒HAdV5f11p-TGFPW感染A549细胞后荧光显微镜观察GFP的诱导表达。纯化的重组病毒HAdV5f11p-TGFPW以1000vp/cell的感染强度感染A549细胞，在培养基中不添加或添加终浓度为1μg/ml的强力霉素(Dox)；感染2天后荧光显微镜观察。不添加 Dox，未见GFP表达；添加Dox，大多数细胞表达GFP。说明病毒感染后，Dox能够调控靶细胞的GFP表达。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中所用的质粒pAdEasyf11p和pAd5GXP的构建过程已经公开发表。 pAdEasyf11p是对腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(Genbank accession No.AY370909)的fiber基因进行改造得到的[9]；pAd5GXP是一种删除原有PmeI位点的HAdV-5腺病毒质粒[10]。 pShuttle-CMV(https://www.addgene.org/16403/)、pShuttle(Genbank accession No.AF334399) 质粒和大肠杆菌BJ5183菌株购自美国Stratagene公司。pLVX-EF1a-Tet3G和pLVX-TRE3G 质粒购自美国Clontech公司。使用的PCR耐热DNA聚合酶(Q5高保真DNA聚合酶)、DNA 组装试剂(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix,Cat.E2621)、小牛碱性磷酸酶(CIP) 购自美国NEB公司；DNA连接试剂盒(Cat.6022Q)购自Takara Bio公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒(Cat.D4045)购自ZYMO RESEARCH公司；各种限制性内切酶购自NEB或Takara Bio公司；大肠杆菌TOP10感受态细胞和pUC19质粒(Genbank accession No.M77789)购自天根生化科技有限公司；PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；人类细胞系 293(Cat.CRL-1573)和A549(Cat.CCL-185)购自美国模式培养物保藏库(American type culture collection，ATCC)；质粒转染用脂质体lipofectamine 3000购自ThermoFisher Scientific公司。
实施例1、构建携带融合fiber基因(F5-11p)和人EF1a启动子的腺病毒质粒pAd5f11p-EF1a
利用携带F5-11p融合基因的骨架质粒pAdEasyf11p构建E1区含有人EF1a启动子的腺病毒质粒构建过程见图1。
先将pShuttle-CMV质粒的CMV启动子更换为人EF1a启动子。先以pShuttle质粒为模板，以1411Sh5EF1aF1：ccggtgtaca caggaagtga caat和1411Sh5EF1aR1：cttttgtatg aattactcga cgtcagtatt acgcgctatg agtaacacaa为引物，PCR扩增得到181bp产物，该产物自上游BsrGI位点起始，含有HAdV-5包装信号(ES)；再以pLVX-EF1a-Tet3G质粒为模板，1411Sh5EF1aF2： cgcgtaatac tgacgtcgag taattcatac aaaaggactc gc和1411Sh5EF1aR2：acggtacctc acgacacctg aaatggaaga a为引物，PCR扩增得到1360bp产物，该产物含有人EF1a启动子；再将 1411Sh5EF1aF3：ttccatttca ggtgtcgtga ggtaccgtcg acgcggccgc acgcgttcta和1411Sh5EF1aR3： ggccgatatc ttagctagca agcttaggtc tagaacgcgt gcggccgcgt寡核苷酸自身退火延伸得到80bp双链 DNA产物，该片段主要含有多种酶切位点(作为拟构建穿梭质粒的多克隆位点用)。将上述 181、1360和80bp产物混合，作为模板，以1411Sh5EF1aF1和1411Sh5EF1aR3为引物，重叠延伸PCR得到三者融合的产物1558bp，电泳回收，命名为ES-EF1ap-MCS。使用 BsrGI/EcoRV双酶切pShuttle-CMV质粒(产生6678bp和792bp片段)，电泳回收6678bp片段；使用BsrGI/EcoRV双酶切ES-EF1ap-MCS片段，电泳回收1546bp片段；2片段连接后，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布含卡那霉素LB平板，液体培养阳性菌落，提取质粒，获得的穿梭质粒命名为pSh5-EF1a。参照AdEasy腺病毒载体系统说明书(Clontech公司)，使用PacI线性化pSh5-EF1a，与骨架质粒pAdEasyf11p共同电转化大肠杆菌BJ5183菌株，筛选获得腺病毒质粒pAd5f11p-EF1a。pAd5f11p-EF1a为一个不带有目的基因的腺病毒质粒。
实施例2、去除pAd5f11p-EF1a腺病毒质粒原有的PmeI位点
将F5-11p融合基因和突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaat)整合到同一个腺病毒质粒的构建过程见图2。
在前期构建的腺病毒质粒pAd5GXP中[10]，HAdV-5基因组原有的PmeI位点(gtttaaac) 已被人为突变为gtttaaat，该突变为同义突变，不影响含有该位点的病毒基因编码的氨基酸序列。突变去除HAdV-5基因组原有的PmeI位点，目的是将该位点留作外源基因克隆用。BamHI 酶切pAd5f11p-EF1a质粒，回收含有F5-11p基因的10999bp片段；BamHI酶切pAd5GXP，小牛碱性磷酸酶(CIP)处理，去除5’P，电泳回收24594bp片段；上述2片段连接，鉴定产物质粒的正反向，获得正向连接的质粒pAd5f11p-CGXP。在腺病毒质粒pAd5f11p-CGXP中， F5-11p融合基因与突变的PmeI位点两个特性结合在一起。
实施例3、在腺病毒E1区外源基因克隆部位引入PmeI位点
对腺病毒E1区外源基因克隆部位的进一步改造见图3。为了便于进行定点突变等分子生物学操作，先自实施例1构建的pAd5f11p-EF1a腺病毒质粒分离出一个较小的质粒。
先使用BstZ17I酶切pAd5f11p-EF1a质粒，电泳回收含有外源基因克隆部位的7210bp 片段。为了便于后期将改造该片段进行复原，设计合成2条寡核苷酸引物，分别为 1805F11p-EF1PmeA1：gctgtccgtg tccccgtata cagacttgag aggcctgtcg aattcccaaa ataaggta和 1805F11p-EF1PmeA2：gccgcatagt taagccagta tacggatcct taattaacat catcaataat ataccttatt ttgggaattc gac，将这对引物自身退火后延伸得到109bp的双链DNA产物；再将上述7210bp和109bp 片段混合，进行DNA组装得到pKAd5-EF1aBstZ17I质粒(卡那霉素抗性)。最后使用 KpnI/EcoRV双酶得到的pKAd5-EF1aBstZ17I质粒，电泳后回收7233bp片段(去除原有的多克隆位点)；与合成的单链寡核苷酸1805F11p-EF1PmeA3：cttccatttc aggtgtcgtg aggtaccgtt taaacatccg atccaccgga tctagata(58nt)进行DNA组装，得到pKAd5-EF1aBP质粒。pKAd5-EF1aBP 含有外源基因克隆部位(原E1区位置)，在EF1a启动子下游引入了PmeI位点；并且在原 pAd5f11p-EF1a质粒BstZ17I酶切片段的两侧添加了两段同源重叠区，以便后续复原过程采用 DNA组装操作。
实施例4、克隆外源基因用腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP的构建
外源基因克隆用腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP构建过程见图4。
BstZ17I/PacI双酶切实施例2构建的pAd5f11p-CGXP，电泳后切胶回收26781bp片段； EcoRI酶切线性化实施例3构建的pKAd5-EF1aBP质粒，回收7242bp片段；上述两个片段混合，进行DNA组装，即获得腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP。PmeI位点两侧的序列与后述的重组病毒构建方法密切相关，是同源重叠区的主要选择范围，其两侧40bp具体序列情况见图 4。pKAd5f11p-EF1aP质粒的酶切鉴定图谱见图5，酶切后所得片段大小与预计的相同，说明 pKAd5f11p-EF1aP质粒构建成功。
经过实施例1-实施例4的分子生物学操作，得到的腺病毒质粒pKAd5f11p-EF1aP具有下列特点：(1)使用PacI对其线性化，可得到2个片段，一个片段含有质粒骨架，包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点，另一个片段含有E1/E3区缺失的HAdV-5基因组；(2)在基因组原E1区部位含有EF1a启动子和SV40polyA加尾信号，在这两者之间添加有1个PmeI 单一酶切位点(GTTTAAAC)；(3)原HAdV-5的fiber基因由F5-11p融合基因替代。
实施例5、以GFP为例将外源目的基因引入到pKAd5f11p-EF1aP腺病毒质粒的PmeI位点处
举例说明将外源基因克隆到pKAd5f11p-EF1aP腺病毒质粒的方法。将GFP基因克隆到腺病毒质粒的构建示意图见图6。
设计并合成2条引物，1805F11p-EF1PmeGFP1：aggtgtcgtg aggtaccgtt taaaccatgg tgagcaaggg cg和1805F11p-EF1PmeGFP2：atccggtgga tcggatgttt aaacaagctt tagagtccgg acttgtacag ct，该对引物的5’端(下划线标记部分)与pKAd5f11p-EF1aP质粒PmeI两端序列一致(参见图4)，称为同源重叠区，3’端能够与待扩增的模板结合。以携带GFP基因的pAd5GXP质粒为模板，上述引物扩增得到GFP CDS片段(长784bp)；PmeI酶切pKAd5f11p-EF1aP质粒，回收线性化的33964bp片段；上述2片段混合，进行DNA组装反应，即可得到腺病毒质粒 pKAd5f11p-EPG。随机挑选5个质粒克隆使用HindIII酶切鉴定(图7)，酶切图谱与预期一致，说明这5个质粒均为GFP正确插入的阳性质粒克隆。在pKAd5f11p-EPG质粒中，GFP 编码区被引入到EF1a启动子和SV40polyA之间，成为可表达的目的基因。在本实施例中，保留了GFP编码区两侧的PmeI位点，在实际构建操作中该位点也可以去除，或变更为其他序列。在不保留PmeI位点的情况下，为了保证DNA组装反应的效率，可以在设计合成引物时将引物的同源重叠区向两侧延伸数个碱基，以使得同源重叠区的解链温度(Tm值)满足 DNA组装的要求。
实施例6、重组病毒HAdV5f11p-EPG的拯救和鉴定
PacI酶切实施例5得到的pKAd5f11p-EPG质粒，乙醇沉淀回收DNA，使用脂质体转染 293细胞，37℃培养3-7天，第5天可见GFP阳性细胞形成荧光灶(图8)，第7天可见拯救的病毒在单层细胞形成噬斑，荧光显微镜下可见GFP的高效表达。上述结果说明重组腺病毒 (命名为：HAdV5f11p-EPG)得到成功拯救。将出现多处噬斑后的细胞连同培养液冻融3次，低速离心，收集上清(约5ml)分装冻存于-80℃冰箱，作为种子病毒HAdV5f11p-EPG。种子病毒在293细胞扩大培养后，使用通用的氯化铯超速离心法纯化，得到纯化的病毒。使用 Hirt法提取病毒基因组DNA，再选择HindIII和EcoRV对基因组DNA进行酶切鉴定(图9)，酶切片段的大小与预计的一致，结果说明得到的重组病毒即为HAdV5f11p-EPG。将纯化的 HAdV5f11p-EPG以200vp/cell(200viral particle per cell)的感染强度感染A549细胞；培养 2天后，荧光显微镜观察，大于90％的细胞高表达GFP蛋白(图10)，说明HAdV5f11p-EPG 重组病毒有较高的基因转移效率。
实施例7、克隆外源基因用腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI的构建
pKAd5f11p-EF1aP可用于克隆单个目的基因、制备EF1a启动子控制单个目的基因表达的重组腺病毒。当希望选用其他启动子或同时携带多个基因表达框时，pKAd5f11p-EF1aP的 EF1a启动子反而成为多余的元件，故有必要构建了不含有预置启动子的克隆外源基因用腺病毒质粒。图11是符合这类需求的腺病毒质粒pKAd5f11pES-PmeI构建示意图。
对实施例3构建的pKAd5-EF1aBstZ17I质粒进行进一步改造。AatII/EcoRV双酶切质粒 pKAd5-EF1aBstZ17I，回收5892bp片段(去除了EF1a启动子和多克隆位点)，与合成的单链寡核苷酸1805F11p-ESPmeA：tgttactcat agcgcgtaat actgacgtcg tttaaacgat atccgatcca ccggatctag ata进行DNA组装，得到质粒pKAd5ES-BP。该质粒不含有EF1a启动子和多克隆位点，并且在腺病毒包装信号(ES)下游添加了PmeI位点(GTTTAAAC)。再用EcoRI酶切pKAd5ES-BP 质粒，回收5904bp条带；BstZ17I/PacI双酶切pAd5f11p-CGXP质粒，电泳回收含有F5-11p 基因的26781bp片段；上述2片段混合，进行DNA组装，得到pKAd5f11pES-PmeI。由于 PmeI位点两侧的序列与后述的重组病毒构建方法密切相关，是同源重叠区主要选择范围，其两侧40bp具体序列情况也进一步显示在图11。获得的pKAd5f11pES-PmeI质粒EcoRV的酶切鉴定图谱见图12，酶切片段与预期一致说明质粒构建成功。除了不含有EF1a启动子， pKAd5f11pES-PmeI质粒的其它特征与pKAd5f11p-EF1aP相同。
实施例8、含有多个基因表达框的质粒pLVX-TRE3G-TetGFP的构建
为示例说明pKAd5f11pES-PmeI质粒可以用于携带多个基因表达框，发明者先行构建了一个携带2个基因表达框的质粒。这两个表达框功能的耦合，将使得目的蛋白GFP的表达可以人为调控，这便于验证两个表达框均能正常工作。图13是携带双基因表达框质粒 pLVX-TRE3G-TetGFP构建示意图。
Tet-on 3G是常用的诱导调控表达系统，它需要在靶细胞中表达一个外源转录因子Tet-on 3G，同时靶细胞中含有由TRE3G启动子控制的目的基因表达框；当向培养基中添加强力霉素(doxycycline,Dox)时，进入靶细胞的Dox与Tet-on 3G蛋白的结合，使得Tet-on 3G转变为TRE3G启动子的转录激活因子，启动目的基因的转录和表达，这样通过添加Dox或不添加Dox就可以调控目的蛋白表达。Tet-on 3G和目的蛋白常使用两个逆转录病毒载体分别表达，在本发明的示例中，将它们结合在一起由一个腺病毒载体携带。为此先构建携带双基因表达框质粒pLVX-TRE3G-TetGFP。
以pLVX-EF1a-Tet3G质粒为模板，以1306TetonP1：ggccctgcag cccaagctta ccatgtctag actggacaag agc和1306TetonP2：gattgttcca gacgcgcccc gttatccagg gagcatgtca aggtc为引物，PCR 扩增790bp含有Tet-on 3G编码区的片段；以pLVX-EF1a-Tet3G质粒为模板，以1306TetonP3： gaccttgaca tgctccctgg ataacggggc gcgtctggaa caatc和1306TetonP4：ggccctgcag aattaattcc aggcgggg 为引物，PCR扩增652bp含有WPRE元件的片段；上述两产物混合，以1306TetonP1和 1306TetonP4为引物，重叠延伸PCR扩增获得1397bp的片段TET-WRPE。PstI酶切PCR产物，回收1383bp片段；PstI酶切pLVX-TRE3G质粒，CIP处理，电泳回收6583bp片段；上述2片段连接得到质粒pLVX-TRE3G-Teton。以pAd5GXP质粒为模板，以1306TET-GFPF1：ggccggatcc gccaccatgg tgagcaaggg和1306TET-GFPR1：ggccgaattc ttagagtccg gacttgtaca gctc为引物，PCR扩增获得755bp含GFP编码框的tet-GFP片段；将tet-GFP片段使用BamHI/EcoRI 双酶切，克隆到pLVX-TRE3G-Teton的BamHI/EcoRI位点，得到pLVX-TRE3G-TetGFP质粒。在pLVX-TRE3G-TetGFP质粒中，同时含有TRE3G启动子控制的GFP表达框和PGK启动子控制的Tet-on 3G表达框(图13)。
实施例9、使用PCR方法将外源基因克隆到pKAd5f11pES-PmeI质粒
使用实施例5类似的方法，可以将多个外源基因一并克隆到pKAd5f11pES-PmeI质粒。图14是借助PCR扩增将GFP及其表达调控元件一并克隆到腺病毒质粒的构建示意图。
设计并合成2条引物，1805F11p-TGteton1：tcatagcgcg taatactgac gtcgtttaaa cttccagacg cgccccgtta t和1805F11p-TGteton2：tctagatccg gtggatcgga tatcgtttaa acgatgaggc cctttcgtct tcact，与实施例5类似，下划线部分为同源重叠区(参见图11)。先以pLVX-TRE3G-TetGFP质粒为模板，以1805F11p-TGteton1和1805F11p-TGteton2为引物，PCR扩增得到2471bp的TG-teton 片段，该片段同时含有GFP和Tet-on 3G表达框。PmeI酶切pKAd5f11pES-PmeI腺病毒质粒，回收32626bp片段，与PCR产物混合，进行DNA组装，即得到同时含有GFP和Tet-on 3G 表达框的腺病毒质粒pKAd5f11p-TGFPT。随机挑选5个质粒克隆进行酶切鉴定，酶切片段与预期一致，结果说明所得质粒均为TG-teton正确插入的pKAd5f11p-TGFPT质粒(图15)。
实施例10、重组病毒HAdV5f11p-TGFPT的拯救和鉴定
PacI酶切实施例9得到的pKAd5f11p-TGFPT质粒，乙醇沉淀回收DNA，使用脂质体转染293细胞，37℃培养7天，第7天可见拯救的病毒在单层细胞形成噬斑。上述结果说明重组腺病毒HAdV5f11p-TGFPT得到成功拯救。将出现多处噬斑后的细胞连同培养液冻融3次，低速离心，收集上清(约5ml)分装冻存于-80℃冰箱，作为种子病毒。种子病毒在293细胞扩大培养后，使用通用的氯化铯超速离心法纯化，得到纯化的病毒。使用Hirt法提取病毒基因组DNA，使用BglII、EcoRV、HindIII和NdeI对基因组DNA进行酶切鉴定(图16)，酶切片段的大小与预计的一致，结果说明得到的重组病毒即为HAdV5f11p-TGFPT。将纯化的 HAdV5f11p-TGFPT以1000vp/cell的感染强度感染A549细胞，在培养基中添加1μg/ml Dox 或者不添加；培养2天后，荧光显微镜观察，添加Dox的培养体系中超过50％的细胞高表达 GFP蛋白，未添加Dox的培养体系中未见GFP阳性细胞(图17)。结果说明HAdV5f11p-TGFPT 感染后，通过添加Dox可以调控目的基因GFP的表达，即HAdV5f11p-TGFPT重组病毒具有预定的功能。
实施例11、穿梭质粒pUC19-PM的构建
pKAd5f11pES-PmeI质粒可用于多个目的基因和调控序列的插入，当单独使用PCR难以将这些序列一并引入时，如果有一个具有中间过渡功能的穿梭质粒将是非常有益的：这样就可以采取先将各片段依次克隆到穿梭质粒，然后再一次性转移到腺病毒质粒。发明人为了满足这类需求，设计并构建了能够与pKAd5f11pES-PmeI质粒配套使用的穿梭质粒pUC19-PM。图18是其构建示意图，同源重叠区及多克隆位点显示在该图的下方。
先设计合成6条单链寡核苷酸，
1800PacI-MCS1：cgttgtaaaa cgacggccag tgaattttaa ttaatcatag c，
1800PacI-MCS2：ctcgaattca aacgacgtca gtattacgcg ctatgattaa ttaaaattca ctggc，
1800PacI-MCS3：ctgacgtcgt ttgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagatat cgtcg，
1800PacI-MCS4：atcgtttatc gataagcttg catgcctgca ggtcgacgat atctctagag gatcc，
1800PacI-MCS5：atgcaagctt atcgataaac gatatccgat ccaccggatc tagttaatta acttg，1800PacI-MCS6： cagctatgac catgattacg ccaagttaat taactagatc cggtgg；
将它们混合在一起，使用重叠延伸PCR的方法拼接为190bp长度的DNA片段；EcoRI/HindIII 双酶切pUC19质粒，回收2635bp片段，与190bp PCR产物进行DNA组装，得到pUC19-PM。该质粒2个PacI位点之间的序列显示在图18下方，包括两端与pKAd5f11pES-PmeI质粒匹配的同源重叠区和多克隆位点。
实施例12、借助穿梭质粒将外源基因克隆到pKAd5f11pES-PmeI质粒
先将多个外源基因片段克隆到穿梭质粒的多克隆位点，再利用穿梭质粒多克隆位点两侧已有的同源重叠区，使用DNA组装方法，将多个外源基因一并克隆到腺病毒质粒。图19是借助pUC19-PM穿梭质粒，将两个外源基因表达框一并引入pKAd5f11pES-PmeI质粒的构建示意图。
先使用ClaI/KpnI双酶切实施例8构建的pLVX-TRE3G-TetGFP质粒，将GFP和Tet-on 3G 表达框(3140bp)切下，电泳回收片段；通过酶切-连接法将该片段克隆到穿梭质粒的ClaI/KpnI 位点，得到携带目的基因的穿梭质粒pUC19-PTGFPW。在本实施例中，发明人将2个表达框通过一次酶切-连接克隆到穿梭质粒；但是本领域技术人员应该理解，也可以选择将多个目的基因或调控元件依次克隆于穿梭质粒的多克隆位点。PacI酶切pUC19-PTGFPW质粒，电泳后将含有外源基因的片段(3217bp)回收；PmeI酶切线性化pKAd5f11pES-PmeI质粒，回收 32626bp片段，与3217bp片段进行DNA组装，得到携带外源基因的腺病毒质粒 pKAd5f11p-TGFPW。随机挑选的5个质粒克隆进行酶切鉴定，所得片段与预期一致，结果说明所得质粒均为外源基因正确插入的pKAd5f11p-TGFPW质粒(图20)。pKAd5f11p-TGFPW 与实施例9构建的腺病毒质粒pKAd5f11p-TGFPT的区别仅在于：pKAd5f11p-TGFPW在Tet-on 3G编码区下游增加了WPRE元件。
实施例13、重组病毒HAdV5f11p-TGFPW的拯救和鉴定
PacI酶切实施例12得到的pKAd5f11p-TGFPW质粒，乙醇沉淀回收DNA，使用脂质体转染293细胞，37℃培养7天，第7天可见拯救的病毒在单层细胞形成噬斑。上述结果说明重组腺病毒(命名为HAdV5f11p-TGFPW)得到成功拯救。将出现多处噬斑后的细胞连同培养液冻融3次，低速离心，收集上清(约5ml)分装冻存于-80℃冰箱，作为种子病毒。种子病毒在293细胞扩大培养后，使用通用的氯化铯超速离心法纯化，得到纯化的病毒。使用Hirt 法提取病毒基因组DNA，使用BglII、EcoRV、HindIII和NdeI对基因组DNA进行酶切鉴定 (图21)，酶切片段的大小与预计的一致，结果说明得到的重组病毒即为HAdV5f11p-TGFPW。将纯化的HAdV5f11p-TGFPW以1000vp/cell的感染强度感染A549细胞，在培养基中添加 1μg/ml Dox或者不添加；培养2天后，荧光显微镜观察，添加Dox的培养体系中大于50％的细胞高表达GFP蛋白，未添加Dox的培养体系中未见GFP阳性细胞(图22)。结果说明 HAdV5f11p-TGFPW感染后，通过添加Dox可以调控目的基因GFP的表达，即 HAdV5f11p-TGFPW重组病毒具有预定的功能。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
参考文献：
[1]King AM Q,Adams M J,Carstens E B,Lefkowitz E J.Virus taxonomy.Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.2011,Elsevier Academic Press,San Diego,CA.
[2]Khare R,Chen CY,Weaver EA,Barry MA.Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.Curr Gene Ther,2011,11(4):241-258.[pubmed:21453281]
[3]Crystal RG.Adenovirus:the first effective in vivo gene delivery vector.Hum Gene Ther, 2014,25(1):3-11.[pubmed:24444179]
[4]Fougeroux C,Holst PJ.Future Prospects for the Development of Cost-Effective Adenovirus Vaccines.Int J Mol Sci,2017,18(4).[pubmed:28420073]
[5]Mizuguchi H,Kay MA,Hayakawa T.Approaches for generating recombinant adenovirus vectors.Adv Drug Deliv Rev,2001,52(3):165-176.[pubmed:11718941]
[6]Choi EW,Seen DS,Song YB,Son HS,Jung NC,Huh WK,Hahn JS,Kim K,Jeong JY,Lee TG.AdHTS:a high-throughput system for generating recombinant adenoviruses.J Biotechnol, 2012,162(2-3):246-252.[pubmed:23063969]
[7]Zou XH,Bi ZX,Guo XJ,Zhang Z,Zhao Y,Wang M,Zhu YL,Jie HY,Yu Y,Hung T,Lu ZZ. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus.J Virol Methods,2018,257:85-92.[pubmed:29703616]
[8]Tashiro F,Niwa H,Miyazaki J.Constructing adenoviral vectors by using the circular form of the adenoviral genome cloned in a cosmid and the Cre-loxP recombination system.Hum Gene Ther, 1999,10(11):1845-1852.[pubmed:10446924]
[9]Lu ZZ,Ni F,Hu ZB,Wang L,Wang H,Zhang QW,Huang WR,Wu CT,Wang LS.Efficient gene transfer into hematopoietic cells by a retargeting adenoviral vector system with a chimeric fiber of adenovirus serotype 5and 11p.Exp Hematol,2006,34(9):1171-1182.[pubmed:16939810]
[10]李萌,刘淑慧,邹小辉,张尊,牛国宇,鲁茁壮.Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造.病毒学报,2018,34(5):497-503.
[11]Arnberg N.Adenovirus receptors:implications for targeting of viral vectors.Trends Pharmacol Sci,2012,33(8):442-448.[pubmed:22621975]
[12]Wang H,Li ZY,Liu Y,Persson J,Beyer I,Moller T,Koyuncu D,Drescher MR,Strauss R, Zhang XB,Wahl JK,3rd,Urban N,Drescher C,Hemminki A,Fender P,Lieber A.Desmoglein 2is a receptor for adenovirus serotypes 3,7,11and 14.Nat Med,2011,17(1):96-104. [pubmed:21151137]
[13]Stepanenko AA,Chekhonin VP.Tropism and transduction of oncolytic adenovirus 5vectors in cancer therapy:Focus on fiber chimerism and mosaicism,hexon and pIX.Virus Res, 2018,257:40-51.[pubmed:30125593]
[14]Wakabayashi-Ito N,Nagata S.Characterization of the regulatory elements in the promoter of the human elongation factor-1 alpha gene.J Biol Chem,1994,269(47):29831-29837. [pubmed:7961976]。