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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811045242.7 (22)申请日 2018.09.07 (83)生物保藏信息 CGMCC NO： 16092 2018.08.03 (71)申请人 山东省科学院生物研究所 地址 250103 山东省济南市历城区彩石镇 经十东路28789号 (72)发明人 王丙莲马耀宏孟庆军杨艳 公维丽郑岚杨俊慧刘庆艾 (74)专利代理机构 北京慕达星云知识产权代理 事 务 所( 特 殊 普 通 合 伙 ) 11465 代理人 李冉 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006。
2、.01) A01H 15/00(2006.01) G01N 27/48(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器 (57)摘要 一种桑黄菌体， 能够在饱和吸附培养基的亲 水性微孔滤膜表面直接生长， 形成桑黄菌膜； 桑 黄菌膜形成一种基于固定化桑黄菌体的生物传 感器； 生物传感器包括金电极、 多孔层、 桑黄菌 膜、 微孔滤膜、 橡胶O型圈和弹性电极卡套； 多孔 层、 桑黄菌膜和微孔滤膜由内到外依次设置在金 电极一端表面； 弹性电极卡套为中空圆柱形结 构； 弹性电极卡套套固在金电极外部， 将覆盖桑 黄菌膜的微孔滤膜的外缘压固在金。
3、电极表面； 橡 胶O型圈嵌入弹性电极卡套内， 设置在微孔滤膜 外， 对微孔滤膜进行再次紧固。 本发明公开的一 种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 用于检测 废水中氯酚类物质， 以提高氯酚测定的抗干扰能 力和降低检测成本。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 109294923 A 2019.02.01 CN 109294923 A 1.一种桑黄菌体， 其特征在于， 所述桑黄菌体在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的保藏编号为CGMCCNO： 16092。 2.根据权利要求1所述的一种桑黄菌体， 其特征在于， 所述桑黄菌体能够在饱和吸附培 养基的亲水性微孔滤膜表面直接生长， 形。
4、成桑黄菌膜； 且所述桑黄菌膜发酵生成桑黄菌膜 漆酶。 3.根据权利要求2所述的一种桑黄菌体， 其特征在于， 所述桑黄菌膜漆酶的活性为20U/ cm2； 其中， 1U/cm2为每分钟产生1 mol产物所需要的酶量。 4.一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 其特征在于， 所述生物传感器包括金电极、 多孔层、 所述桑黄菌膜、 微孔滤膜、 橡胶O型圈和弹性电极卡套； 所述多孔层、 所述桑黄菌膜 和所述微孔滤膜由内到外依次设置在所述金电极一端表面； 所述弹性电极卡套为中空圆柱 形结构； 所述弹性电极卡套套固在所述金电极外部， 将覆盖所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜 的外缘压固在所述金电极表面； 所述橡胶O型。
5、圈嵌入所述弹性电极卡套内， 设置在所述微孔 滤膜外， 对所述微孔滤膜进行再次紧固。 5.根据权利要求4所述的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器的制备方法， 其特征 在于， 包括以下步骤 (1)所述桑黄菌体活化及种子的制备 将所述桑黄菌体转接到PDA培养基上， 25-30条件下培养， 直至菌丝长满使得所述桑 黄菌体活化； 并将活化后的所述桑黄菌体接入种子培养基中， 25-30条件下培养3d， 得到 所述桑黄菌体的种子液； (2)所述微孔滤膜的设置 无菌条件下， 将直径与所述金电极横面直径相同的所述微孔滤膜灭菌后， 置于盛有发 酵培养液的培养皿内设置的支架上， 保证所述微孔滤膜能够吸取所述发酵培养。
6、液的营养物 质， 又能悬浮于所述发酵培养液的液面之上； (3)桑黄菌膜的形成 吸取步骤(1)中的所述种子液， 均匀涂布于步骤(2)中的所述微孔滤膜上， 并将所述培 养皿置于25-30条件下培养3d， 后在所述培养皿中加入2mmol/L的愈创木酚和60mmol/L的 琥珀酸再培养2d， 并将长满所述桑黄菌体形成所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜取出； (4)所述多孔层的形成 将所述金电极抛光至镜面后， 分别用无水乙醇、 1:1硝酸、 二次蒸馏水各超声清洗4- 10min， 晾干； 后用0.4的三维氧化石墨烯溶胶滴涂在所述金电极表面， 形成所述多孔层， 并晾干； (5)所述生物传感器的形成 将步骤(3)中。
7、的长满所述桑黄菌体形成所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜， 放置在所述多 孔层上， 使所述桑黄菌膜紧贴所述多孔层； 利用所述弹性电极卡套套固在所述金电极外部， 将覆盖所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜的外缘压固在所述金电极表面； 将所述橡胶O型圈嵌 入所述弹性电极卡套内， 设置在所述微孔滤膜外， 对所述微孔滤膜进行再次紧固， 制成所述 生物传感器。 6.根据权利要求5所述的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器的制备方法， 其特征 在于， 所述多孔层为具有独特三维空间结构的导电多孔层。 权利要求书 1/2 页 2 CN 109294923 A 2 7.根据权利要求5所述的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器的制备方。
8、法， 其特征 在于， 所述微孔滤膜为亲水性微孔滤膜； 所述微孔滤膜的孔径为0.22 m。 8.根据权利要求4所述的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 检测废水中氯酚类 物质的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)通过三电极系统分别对2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚进行定性检测和标定， 确定所 述2,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的氧化峰电位； 并按照所述2,4-二氯苯酚和所述2,6- 二氯苯酚浓度与电流的变化， 分别建立其线性回归方程； 其中所述三电极系统包括以Ag/ AgCl电极为参比电极； 以铂盘电极为对电极； 以所述生物传感器为工作电极； (2)采用循环伏安法， 在所述2。
9、,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的氧化峰电位下， 观察 废水样品中的出峰情况； (3)根据所述2,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的线性回归方程， 计算出所述废水样 品中所述2,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的含量。 9.根据权利要求8所述的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 检测废水中氯酚类 物质的方法， 其特征在于， 所述生物传感器对2,4-二氯苯酚的氧化峰电流电位为0.057V； 在 该峰电位下， 所述2,4-二氯苯酚含量与电流变化的线性回归方程为： y0.2258x+0.9466 其中， y是2,4-二氯苯酚峰电位下响应电流值 A， x是加入2,4-二氯苯酚浓度 M； 其中。
10、2, 4-二氯苯酚的线性范围为110-7-210-4M， 检测下限达到210-10M， r20.9957。 10.根据权利要求8所述的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 检测废水中氯酚类 物质的方法， 其特征在于， 所述生物传感器对2,6-二氯苯酚的氧化峰电流电位为0.065V， 在 该峰电位下所述2,6-二氯苯酚含量与电流变化的线性回归方程为： y0.2571x+1.5518 y是2,6-二氯苯酚峰电位下响应电流值 A， x是2,6-二氯苯酚浓度 M。 2,6-二氯苯酚的 线性范围为110-7-1.510-4M， 检测下限达到1.510-10M， r20.9932。 权利要求书 2/2 页。
11、 3 CN 109294923 A 3 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器 技术领域 0001 本发明涉及生物工程领域， 特别是涉及一种基于固定化桑黄菌体的生物 传感器。 背景技术 0002 氯酚类化合物(CPs)是一类毒性较大、 污染严重的异生物质， 广泛存在 于制药、 印 染、 纺织、 石油化工、 农药等工业生产中。 进入水体后， 易在生 物体内富集和累积， 产生较强 的毒性。 2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚作为主要 的氯酚类化合物， 是当前水体污染的重要 污染物， 给自然环境造成极大的危 害， 现已被许多国家列为环境优先监测的污染物之一。 因此， 监测和掌控废 水中的2,4-二氯苯。
12、酚、 2,6-二氯苯酚， 防止其对人类的危害具有重大 的现实意 义。 0003 目前， 对于氯酚类的测定方法， 工厂和企业大都采用比色法、 生物传感 器法等。 比 色法条件要求较为苛刻， 在实际工作中， 情况比较复杂， 实验空 白值难以达到要求(A 0.1)， 很多具体的因素， 比如样品颜色、 浑浊度以及光 干扰物质都干扰和影响该方法的灵 敏度， 也直接影响分析结果的精密度、 准 确度和测定范围。 生物传感器法主要指漆酶传感 器， 采用漆酶传感器检测酚 类时， 首先需要提纯漆酶， 提纯过程复杂， 成本高昂。 此外， 漆酶 在固定化 过程中， 漆酶容易泄露、 解吸， 活性损失严重且不稳定， 因此。
13、漆酶传感器用 于分 析检测酚类物质时， 不仅成本高、 寿命短， 且测定的稳定性和准确性都 很低。 纺织废水污染 成分复杂， 产量大， 氯酚类检测工程巨大。 因此， 研究 一种成本低、 操作简单、 准确、 快速、 实 时检测的废水中氯酚含量的方法是 亟待解决的问题。 0004 真菌细胞具有多种酶系， 广义认为它自身就是一种天然的固定化酶反应 器， 利用 真菌细胞作为漆酶酶源， 催化一系列的反应， 在实践应用上非常有 意义。 桑黄(Phellinus igniarius)属真菌界、 担子菌纲、 锈革孔菌科、 层孔菌 属。 漆酶是胞外酶， 是桑黄分解木质 素的主要酶源之一， 桑黄子实体和发酵 菌体都。
14、含有漆酶， 并利用漆酶可催化溶液中氯酚类 物质。 但是尽管分泌漆酶 的桑黄类真菌较多， 但真正具有较高漆酶产量， 不需要进行浓缩、 粗提就能 直接利用发酵液漆酶、 或菌体漆酶催化反应的桑黄菌体很少。 0005 因此， 提供一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 在不需要破壁菌体 的情况 下， 利用桑黄菌分泌的桑黄菌膜漆酶直接用于检测废水中氯酚类物质， 以提高氯酚测定的 抗干扰能力和降低检测成本是本领域技术人员亟需解决的 问题。 发明内容 0006 本发明提供一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 其中生物传感器中 的桑黄 菌膜能够直接在微孔滤膜表面进行生长， 不需要破壁菌体， 其所产生 的桑黄菌膜。
15、漆酶能够 直接利用且活性能够达到20U/cm2， 活性稳定。 利用本发 明中的生物传感器检测用于检测 废水中氯酚类物质， 不仅具有提高氯酚测定 的抗干扰能力和降低检测成本的作用， 而且操 作简单， 能够准确快速、 实时 检测废水中氯酚的含量。 0007 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 说明书 1/8 页 4 CN 109294923 A 4 0008 一种桑黄菌体， 所述桑黄菌体在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中 心的保藏编号为CGMCCNO： 16092。 0009 进一步的， 所述桑黄菌体能够在饱和吸附培养基的亲水性微孔滤膜表面 直接生 长， 形成桑黄菌膜； 且所述。
16、桑黄菌膜分泌生成桑黄菌膜漆酶。 0010 其中， 所述桑黄菌膜长满所述微孔滤膜后， 置于改良的高盐察氏培养基 (无琼脂) 中， 桑黄菌生长停滞， 菌膜漆酶活性保持稳定， 且杂菌无法生长。 0011 其中改良高盐察氏培养基包括： 硝酸钠1.5g/L、 磷酸二氢钾1g/L、 硫酸 镁0.5g/L、 氯化钾0.5g/L、 硫酸亚铁0.01g/L、 氯化钠60g/L和蔗糖15g/L。 0012 进一步的， 所述桑黄菌膜漆酶的活性为20U/cm2； 其中， 1U/cm2为每分 钟产生1 mol 产物所需要的酶量。 0013 其中， 菌膜漆酶活性测定方法为： 取微孔滤膜基质面积为1cm2的所述桑 黄菌膜与。
17、 4ml 50mmol/L(含愈创木酚1mmol/L)PBS缓冲液(pH6.0)混合， 打散菌体并搅拌反应20- 30min， 离心后取上清， 于465nm处测吸光值， 愈创 木酚消光系数为 12000mol-1L cm-1， 所述微孔滤膜表面培养的桑黄菌 膜漆酶的催化能力(酶活)用每单位面积菌膜被测试 的酶活单位(U/cm2)表 示， 1个酶活力单位定义为每分钟产生1 mol产物所需要的酶量。 0014 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 所述生物传感器包括金电极、 多孔层、 所述桑黄菌膜、 微孔滤膜、 橡胶O型圈和弹性电极卡套； 所述多孔 层、 所述桑黄菌膜和所述 微孔滤膜由内到外依次设。
18、置在所述金电极一端表面； 所述弹性电极卡套为中空圆柱形结 构； 所述弹性电极卡套套固在所述金电极 外部， 将覆盖所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜的外 缘压固在所述金电极表面； 所述橡胶O型圈嵌入所述弹性电极卡套内， 设置在所述微孔滤 膜外， 对所述 微孔滤膜进行再次紧固。 0015 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器的制备方法， 包括以下步骤： 0016 (1)所述桑黄菌体活化及种子的制备 0017 无菌操作将原斜面上的所述桑黄菌体转接到新鲜的PDA培养基上， 25-30条件 下恒温培养， 直至菌丝长满使得所述桑黄菌体活化， 并于4保 存备用。 0018 将种子培养基装入三角瓶中， 按无菌要求将活化。
19、后的所述桑黄菌体接入 所述种 子培养基中， 25-30， 180-200r/min条件下培养3d， 观察菌丝生长情 况， 得到所述桑黄菌 体的种子液； 0019 其中PDA培养基包括土豆200g/L、 葡萄糖20g/L、 琼脂15g/L和青霉素 0.001g/L； 0020 种子培养基包括葡萄糖2、 酵母膏0.5、 KH2PO4 0.4、 MgSO4 0.15、 VB 10.01和青霉素0.001g/L。 0021 (2)所述微孔滤膜的设置 0022 无菌条件下， 将直径与所述金电极横面直径相同的所述微孔滤膜灭菌后， 置于盛 有发酵培养液的培养皿内设置的支架上， 保证所述微孔滤膜能够吸取 所述。
20、发酵培养液的 营养物质， 又能悬浮于所述发酵培养液的液面之上； 0023 其中发酵培养液包括蔗糖2、 蛋白胨0.5、 酵母浸粉0.1、 硫酸铵0.2、 KH2PO4 0.2、 MgSO4 0.08、 庆大霉素0.001g/L和苯甲酸0.5。 0024 (3)桑黄菌膜的形成 0025 无菌注射器吸取步骤(1)中的所述种子液， 均匀涂布于步骤(2)中的 所述微孔滤 说明书 2/8 页 5 CN 109294923 A 5 膜上， 并将接种过所述种子液的所述微孔滤膜连同盛有所述发酵 培养液的所述培养皿， 一 同置于25-30条件下恒温培养3d， 后在所述培养皿 中加入2mmol/L的愈创木酚和60m。
21、mol/ L的琥珀酸再培养2d， 观察桑黄菌落 及菌膜的大小， 将长满所述桑黄菌体形成所述桑黄菌 膜的所述微孔滤膜及所 述支架从所述培养皿中取出， 切断培养液的供给， 并终止生长。 随 后将所述 微孔滤膜置于盛有特异察氏培养基的培养皿中， 4冰箱储存。 0026 (4)所述多孔层的形成 0027 将所述金电极依次用0.1 m的Al2O3粉抛光和布上抛光至镜面后， 分别用 无水乙 醇、 1:1硝酸、 二次蒸馏水各超声清洗4-10min， 晾干； 后用0.4的三 维氧化石墨烯溶胶滴 涂在所述金电极表面， 形成所述多孔层， 室温晾干； 0028 (5)所述生物传感器的形成 0029 将步骤(3)中的。
22、长满所述桑黄菌体形成所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜， 放置在所 述多孔层上， 使所述桑黄菌膜紧贴所述多孔层； 利用所述弹性电极 卡套套固在所述金电极 外部， 将覆盖所述桑黄菌膜的所述微孔滤膜的外缘压 固在所述金电极表面； 将所述橡胶O 型圈嵌入所述弹性电极卡套内， 设置在 所述微孔滤膜外， 对所述微孔滤膜进行再次紧固， 制成所述生物传感器。 0030 进一步的， 所述多孔层为具有独特三维空间结构的导电多孔层。 0031 本发明公开的具有独特三维空间结构的导电多孔层， 不仅更有利于电极 反应过 程中离子的快速转移， 而且其三维多孔结构为固定的桑黄菌漆酶提供 三维空间， 使其活性 中性更容易暴露在外，。
23、 保持较高而稳定的催化活性， 上 述特点都有利于提高桑黄生物传感 器分析和检测的速度和灵敏度。 0032 进一步的， 所述微孔滤膜的孔径为0.22 m。 0033 本发明选用0.22 m微孔滤膜为桑黄菌培养和固定载体， 优势是， 废水中 含有较多 杂菌和颗粒物， 孔径0.22 m微孔滤膜能够过滤掉几乎所有杂菌和颗 粒物， 防止其穿过滤膜 接触电极， 干扰电极信号； 而不影响桑黄菌传感器对 底物氯酚类等催化反应。 另外， 亲水性 微孔滤膜的网状结构及其透气亲水性 为菌体细胞存活和保持较高酶催化活性提供最优的 微环境。 0034 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器检测废水中氯酚类物质的方法， 包括。
24、以 下步骤： 0035 (1)通过三电极系统分别对2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚进行定性检测 和标定， 确定所述2,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的氧化峰电位； 并按照所 述2,4-二氯苯酚和 所述2,6-二氯苯酚浓度与电流的变化， 分别建立其线性回归 方程； 其中所述三电极系统包 括以Ag/AgCl电极为参比电极； 以铂盘电极为 对电极； 以所述生物传感器为工作电极； 0036 其中， 利用三电极系统对2 ,4-二氯苯酚进行定性检测和标定的方法为： 用 50mmol/LPBS(pH6.0)缓冲液为空白液， 在空白液里加入不同量2,4-二氯苯 酚， 配成2,4-二 氯苯酚终浓度为11。
25、0-7-210-4M内梯度浓度工作液， 后分别 进行循环伏安扫描， 扫描范 围为-0.2-0.2V， 扫描速度为0.04mV/s。 确认2,4- 二氯苯酚的氧化电位， 据此判断2,4-二氯 苯酚存在与否， 实现其定性检测。 0037 2 ,4-二氯苯酚的标准曲线在最佳条件下标定： 最佳条件是在PBS缓冲溶液 (50mmol/L、 pH6.0)中， 2,4-二氯苯酚的氧化峰电位下， 2,4-二氯苯酚在1 10-7-210-4M 说明书 3/8 页 6 CN 109294923 A 6 浓度范围内， 生物传感器的响应电流变化与2,4-二氯苯酚浓度 呈线性相关； 按照2,4-二氯 苯酚浓度与电流变化。
26、建立的线性回归方程。 0038 同理， 2,6-二氯苯酚的定性检测和标定步骤同上， 在此不再一一赘述。 0039 (2)采用循环伏安法， 在所述2,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的氧化 峰电位 下， 观察废水样品中的出峰情况； 0040 以所述生物传感器为工作电极， 采用循环伏安法检测废水样品， 用PBS (50mmol/ L)调节所述废水样品的pH至6.0， 分别在， 2,4-二氯苯酚的氧化 峰电位和2,6-二氯苯酚的 氧化峰电位下观察出峰情况， 并分别记录响应电流变 化， 0041 (3)根据所述2,4-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的线性回归方程， 计算 出所述废 水样品中所述2,4。
27、-二氯苯酚和所述2,6-二氯苯酚的含量； 0042 依据2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚浓度与峰电流的线性方程即可同时计算 出测 定池中2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚含量， 每个测定重复3次， 取平均值。 0043 进一步的， 所述生物传感器对2,4-二氯苯酚的氧化峰电流电位为0.057V； 在该峰 电位下， 所述2,4-二氯苯酚含量与电流变化的线性回归方程为： 0044 y0.2258x+0.9466 0045 其中， y是2,4-二氯苯酚峰电位下响应电流值 A， x是加入2,4-二氯苯酚 浓度 M； 其中2,4-二氯苯酚的线性范围为110-7-210-4M， 检测下限达到2 10。
28、-10M， r20.9957。 0046 进一步的， 所述生物传感器对2,6-二氯苯酚的氧化峰电流电位为0.065V， 在该峰 电位下所述2,6-二氯苯酚含量与电流变化的线性回归方程为： 0047 y0.2571x+1.5518 0048 y是2,6-二氯苯酚峰电位下响应电流值 A， x是2,6-二氯苯酚浓度( M)。 2,6-二氯 苯酚的线性范围为110-7-1.510-4M， 检测下限达到1.510-10M， r20.9932。 0049 经由上述的技术方案可知， 与现有技术相比， 本发明提供了一种桑黄菌 生物传感 器及其制备方法， 具有如下技术优点： 0050 本发明提供一种基于固定化桑。
29、黄菌体的生物传感器， 其中生物传感器中 的桑黄 菌膜能够直接在微孔滤膜表面进行生长， 不需要破壁菌体， 其所产生 的桑黄菌膜漆酶能够 直接利用且活性能够达到20U/cm2， 活性稳定。 利用本发 明中的生物传感器检测用于检测 废水中氯酚类物质， 不仅具有提高氯酚测定 的抗干扰能力和降低检测成本的作用， 而且操 作简单， 能够准确快速、 实时 检测废水中氯酚的含量。 附图说明 0051 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实 施例或 现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面 描述中的附图仅仅是 本发明的实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不。
30、 付出创造性劳动的前提下， 还可以 根据提供的附图获得其他的附图。 0052 图1附图为本发明提供的桑黄菌膜培养装置的结构示意图； 0053 其中， 1为微孔滤膜、 2为脱脂棉芯、 3为支架、 4为发酵培养液、 5为培 养皿； 0054 图2附图为本发明提供的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器的结构 爆炸图； 0055 其中， 6为弹性电极卡套、 1为微孔滤膜、 8为桑黄菌膜、 9多孔层、 10 为金电极、 7为 说明书 4/8 页 7 CN 109294923 A 7 橡胶O型圈； 0056 图3附图为本发明提供的2,4-二氯苯酚含量与峰电位下响应电流变化的 线性回 归图； 0057 图4附。
31、图为本发明提供的2,6-二氯苯酚含量与峰电位下响应电流变化的 线性回 归图。 具体实施方式 0058 下面将结合本发明实施例及相关附图， 对本发明实施例中的技术方案进 行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基 于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有 做出创造性劳动前提下所获得的所有 其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0059 实施例1 0060 桑黄菌膜8的制备 0061 本发明分离得到一种新型的桑黄菌体， 保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会 普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏编 号为CGMC。
32、CNO： 16092， 保 藏日期2018年08月03日， 分类命名鲍氏纤孔 菌(Inonotus baumii)。 0062 无菌操作将原斜面上的桑黄菌体转接到新鲜的PDA培养基上， 28条件 下恒温培 养， 直至菌丝长满使得桑黄菌体活化， 并于4保存备用。 0063 将种子培养基装入三角瓶中， 按无菌要求将活化后的桑黄菌体接入种子 培养基 中， 28， 180r/min条件下培养3d， 观察菌丝生长情况， 得到桑黄菌 体的种子液； 0064 其中PDA培养基包括土豆200g/L、 葡萄糖20g/L、 琼脂15g/L和青霉素 0.001g/L； 0065 种子培养基包括葡萄糖2、 酵母膏0.。
33、5、 KH2PO4 0.4、 MgSO4 0.15、 VB 10.01和青霉素0.001g/L； 0066 发酵培养液包括蔗糖2、 蛋白胨0.5、 酵母浸粉0.1、 硫酸铵0.2、 KH2PO4 0.2、 MgSO4 0.08、 庆大霉素0.001g/L和苯甲酸0.5。 0067 如图1， 本发明提供了一种桑黄菌膜8培养装置， 其中包括微孔滤膜1、 脱脂棉芯2、 支架3和培养皿5； 其中培养皿5内充满发酵培养液4； 支架3 为镂空有机玻璃培养支架， 内填 充脱脂棉芯2浸没在发酵培养液4内， 其中 镂空有机玻璃培养支架顶端与发酵培养液4顶端 基本相平； 其中微孔滤膜1 设置在镂空有机玻璃培养支架。
34、上。 0068 在无菌条件下， 将直径与金电极10横面直径相同的微孔滤膜1灭菌后， 置于盛有 发酵培养液4的培养皿5内的镂空有机玻璃培养支架上， 保证微孔 滤膜1能够吸取发酵培养 液4的营养物质， 又能悬浮于发酵培养液4的液面 之上， 其中微孔滤膜1为亲水性微孔滤膜 1， 孔径为0.22 m。 0069 无菌注射器吸取桑黄菌体种子液， 均匀涂布于微孔滤膜1上， 并将接种 过种子液 的微孔滤膜1连同盛有发酵培养液4的培养皿5， 一同置于30条 件下恒温培养3d， 后在培 养皿5中加入2mmol/L的愈创木酚和60mmol/L的 琥珀酸再培养2d， 观察桑黄菌落及菌膜的 大小， 将长满桑黄菌膜8的。
35、微孔滤 膜1及支架3从培养皿5中取出， 切断培养液的供给， 并终 止生长。 随后将 微孔滤膜1置于盛有改良高盐察氏培养基的培养皿中， 4冰箱储存， 其中 在 改良高盐察氏培养基中桑黄菌生长停滞， 菌膜漆酶活性保持稳定， 且杂菌无 法生长。 其 说明书 5/8 页 8 CN 109294923 A 8 中改良高盐察氏培养基包括： 硝酸钠1.5g/L、 磷酸二氢钾1g/L、 硫酸镁0.5g/L、 氯化钾 0.5g/L、 硫酸亚铁0.01g/L、 氯化钠60g/L和蔗糖15g/L。 0070 桑黄菌体能够在饱和吸附培养基的亲水性微孔滤膜1表面直接生长， 形 成桑黄菌 膜8； 且桑黄菌膜8发酵生成桑黄。
36、菌膜漆酶。 0071 其中， 取微孔滤膜1基质面积为1cm2的桑黄菌膜8与4ml 50mmol/L(含 愈创木酚 1mmol/L)PBS缓冲液(pH6.0)混合， 打散菌体并搅拌反应30min， 离心后取上清， 于465nm处 测吸光值， 愈创木酚消光系数为 12000mol-1Lcm-1， 微孔滤膜1表面培养的桑黄菌 膜漆酶的催化能力(酶 活)用每单位面积菌膜被测试的酶活单位(U/cm2)表示， 1个酶活力 单位定 义为每分钟产生1 mol产物所需要的酶量， 得到桑黄菌膜漆酶的活性为 20U/cm2。 0072 实施例2 0073 如图2所示， 本实施例提供了一种基于固定化桑黄菌体的生物传感。
37、器包 括金电极 10、 多孔层9、 桑黄菌膜8、 微孔滤膜1、 橡胶O型圈7和弹性电极 卡套6； 多孔层9、 桑黄菌膜8和 微孔滤膜1由内到外依次设置在金电极10 一端表面； 弹性电极卡套6为中空圆柱形结构套 固在金电极10外部， 在设有 微孔滤膜1的一端， 通过弹性电极卡套6端部向内翻折， 将覆盖 桑黄菌膜8 的微孔滤膜1的外缘压固在金电极10表面； 橡胶O型圈7嵌入弹性电极卡套 6内， 设置在微孔滤膜8外， 对微孔滤膜1进行再次紧固。 0074 其中， 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器的制备方法具体如下： 0075 将金电极10依次用0.1 m的Al2O3粉抛光和布上抛光至镜面后， 分别。
38、用 无水乙醇、 1:1硝酸、 二次蒸馏水各超声清洗5min， 晾干； 后用0.4的三维 氧化石墨烯溶胶滴涂在金 电极10表面， 形成多孔层9， 室温晾干； 0076 将实施例1中的长满桑黄菌膜8的微孔滤膜1放置在多孔层9上， 其中 多孔层9为具 有独特三维空间结构的导电多孔层9， 使桑黄菌膜8紧贴多孔层 9， 并用弹性电极卡套6卡固 在金电极10外部， 将覆盖桑黄菌膜8的微孔滤 膜1的外缘压固在金电极10表面； 将橡胶O型 圈7嵌入弹性电极卡套6内， 设置在微孔滤膜8外， 对微孔滤膜1进行再次紧固， 制成生物传 感器。 0077 实施例3 0078 一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器检测废水中。
39、氯酚类物质的方法， 本实施 例通过三电极系统进行检测， 其中三电极系统包括以Ag/AgCl电极为 参比电极， 以铂盘电 极为对电极， 以生物传感器为工作电极， 利用循环伏安 法测定废水中氯酚类物质； 具体包 括以下步骤： 0079 (1)通过三电极系统分别对2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚进行定性检测 和标定， 确定2,4-二氯苯酚和2,6-二氯苯酚的氧化峰电位； 并按照2,4-二氯苯 酚和2,6-二氯苯酚 浓度与电流的变化， 分别建立其线性回归方程； 其中三电极 系统包括以Ag/AgCl电极为参 比电极， 以铂盘电极为对电极， 以生物传感器 为工作电极； 0080 其中， 利用三电极系统。
40、对2 ,4-二氯苯酚进行定性检测和标定的方法为： 用 50mmol/LPBS(pH6.0)缓冲液为空白液， 在空白液里加入不同量2,4-二氯苯 酚， 配成2,4-二 氯苯酚终浓度为110-7-210-4M内梯度浓度工作液， 后分别 进行循环伏安扫描， 扫描范 围为-0.2-0.2V， 扫描速度为0.04mV/s。 确认2,4- 二氯苯酚的氧化电位为0.057V， 据此判断 2,4-二氯苯酚存在与否， 实现其定 性检测。 说明书 6/8 页 9 CN 109294923 A 9 0081 2 ,4-二氯苯酚的标准曲线在最佳条件下标定： 最佳条件是在PBS缓冲溶液 (50mmol/L、 pH6.0。
41、)中， 2,4-二氯苯酚的氧化峰电位下， 2,4-二氯苯酚在1 10-7-210-4M 浓度范围内， 生物传感器的响应电流变化与2,4-二氯苯酚浓度 呈线性相关如图3； 按照2, 4-二氯苯酚浓度与电流变化建立的线性回归方程： y0.2258x+0.9466 0082 其中， y是2,4-二氯苯酚峰电位下响应电流值 A， x是加入2,4-二氯苯酚 浓度 M； 其中2,4-二氯苯酚的线性范围为110-7-210-4M， 检测下限达到2 10-10M， r20.9957。 0083 同理， 2,6-二氯苯酚的定性检测和标定步骤同上， 在此不再一一赘述， 如 图4。 生 物传感器对2,6-二氯苯酚的。
42、氧化峰电流电位为0.065V， 在该峰电位下 2,6-二氯苯酚含量 与电流变化的线性回归方程为： 0084 y0.2571x+1.5518 0085 y是2,6-二氯苯酚峰电位下响应电流值 A， x是2,6-二氯苯酚浓度( M)。 2,6-二氯 苯酚的线性范围为110-7-1.510-4M， 检测下限达到1.510-10M， r20.9932。 0086 (2)采用循环伏安法， 在2,4-二氯苯酚和2,6-二氯苯酚的氧化峰电位下， 观察废 水样品中的出峰情况； 0087 以生物传感器为工作电极， 采用循环伏安法检测废水样品， 用PBS (50mmol/L)调 节废水样品的pH至6.0， 分别在。
43、0.057V和0.065V， 电位下 观察出峰情况， 并分别记录响应电 流变化， 0088 (3)根据2,4-二氯苯酚和2,6-二氯苯酚的线性回归方程， 计算出废水样 品中2,4- 二氯苯酚和2,6-二氯苯酚的含量； 依据2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯酚 浓度与峰电流的线性 方程即可同时计算出测定池中2,4-二氯苯酚、 2,6-二氯苯 酚含量， 每个测定重复3次， 取平 均值。 0089 相同废水样品用C18高效液相色谱进行测定； 采用甲醇(含0.5甲酸)： 水9:1 作为流动相， 流速为0.9ml/min； 柱温为30； 检测波长为295nm； 重 复3次， 取平均值。 ； 利用 本发明。
44、公开的传感器对废水样品中2,4-二氯酚、 2,6- 二氯酚含量测定结果与HPLC进行比 较， 具体见表1。 0090 表1传感器与HPLC对废水样品中2,4-二氯酚和2,6-二氯酚含量测定结 果 0091 0092 由表1可知， 本发明公开的一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器对废 水样品中 2,4-二氯酚和2,6-二氯酚含量测定结果与高效液相色谱检测结果基 本相同， 故本发明可 实现废水中氯酚物质的快速定量分析。 说明书 7/8 页 10 CN 109294923 A 10 0093 因此， 本发明提供一种基于固定化桑黄菌体的生物传感器， 其中生物传 感器中的 桑黄菌膜8能够直接在微孔滤膜1表。
45、面进行生长， 且桑黄菌膜8所 产生的桑黄菌膜漆酶， 活 性能够达到20U/cm2， 且活性稳定， 利用本发明中的 生物传感器检测废水中氯酚类物质， 不 仅具有提高氯酚测定的抗干扰能力和 降低检测成本的作用， 而且安装方便， 操作简单， 反 应快速， 能够准确快速、 实时检测废水中氯酚的含量。 0094 在本说明书中的所有公开和专利申请记载对于本领域技术人员而言是描 述性 的。 参考同样的范围， 在本说明书中的所有公开和专利申请记载可以合 并， 所有的公开和 专利申请在此通过引用并入至与每个独立的公开或专利申 请被特定地并且单独地指出通 过引用并入的程度相同。 本公开和专利申请纯 粹的描述不需要组成现有技术对本申请的 许可。 0095 尽管为了更清楚地理解的目的， 前述的发明被通过示例和实例被详细地 描述， 但 显然一定的改变和修改可以在本发明允许的范围实施。 说明书 8/8 页 11 CN 109294923 A 11 图1 图2 说明书附图 1/2 页 12 CN 109294923 A 12 图3 图4 说明书附图 2/2 页 13 CN 109294923 A 13 。