产气荚膜梭菌的快速定量检测方法及检测试剂盒.pdf

本发明提供的定量检测产气荚膜梭菌的方法，其包括以下步骤：(a)获得患者分泌物并提取其中细菌的基因组DNA；(b)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的序列为引物，以SEQ ID NO：3的序列为探针，对步骤(a)中获得的DNA进行荧光定量PCR扩增；(c)制作CT值与所述产气荚膜梭菌的浓度之间的标准曲线，根据步骤(b)的扩增结果，对患者分泌物中的产气荚膜梭菌进行定量。本发明的方法具有高度的特异性、灵敏性和定量准确度，可以检出细菌或病毒的存在，全部检测过程在2-3小时内可以完成；最低可检出约10个细菌，定量误差小于5％，特异性和试剂稳定性等指标符合有关国家标准。而且，本发明利用荧光定量PCR方法，一次检测量可以达到96或384个样本。

1.  一种定量检测产气荚膜梭菌的方法，其包括以下步骤：
(a)获得患者分泌物并提取其中细菌的基因组DNA；
(b)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的序列为引物，以SEQ ID NO：3的序列为探针，对步骤(a)中获得的DNA进行荧光定量PCR扩增；
(c)制作CT值与所述产气荚膜梭菌的浓度之间的标准曲线，根据步骤(b)的扩增结果，对患者分泌物中的产气荚膜梭菌进行定量。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的提取其中细菌的基因组DNA包括使用柱提取方法。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所获得的扩增产物的序列如SEQ ID NO：4所示。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中制作所述标准曲线包括通过如下方式获得DNA对照标准品的步骤：(a)克隆由所述引物对扩增获得的产气荚膜梭菌基因；(b)用质粒法制作DNA对照标准品。

5.  一种快速定量检测产气荚膜梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；和SEQ ID NO：3所示的探针。

6.  如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA对照标准品。

7.  如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明书。

产气荚膜梭菌的快速定量检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速定量检测气性坏疽病原体的方法及检测试剂盒，具体涉及利用TaqMan荧光定量PCR方法快速定量检测人感染产气荚膜梭菌的方法及检测试剂盒。
背景技术
气性坏疽主要是产气荚膜梭菌侵入伤口引起的严重急性感染，多见于软组织严重开放性损伤，在战场中发生率很高。该病以组织坏死、水肿、胀气、全身中毒为特征，死亡率高达40％-100％。在战争状态下，由于疫原通常是多样性的和未知的，一旦发生气性坏疽，样品的检测量大、生物安全性要求高，重要的是危害性评估要求定量准确。然而，目前的技术还不能解决在短时间内快速定量的问题，因此有必要提供一种快速测定产气荚膜梭菌的数量的方法以满足日常和战时需要。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种定量检测人感染产气荚膜梭菌的方法，其能够在短时间内准确测定产气荚膜梭菌的数量。
本发明的另一目的在于提供一种定量检测人感染产气荚膜梭菌的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供的定量检测人感染产气荚膜梭菌的方法，其包括以下步骤：
(a)获得患者分泌物并提取其中细菌的基因组DNA；
(b)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的序列为引物，以SEQ ID NO：3的序列为探针，对步骤(a)中获得的DNA进行荧光定量PCR扩增；
(c)制作CT值与所述产气荚膜梭菌的浓度之间的标准曲线，根据步骤(b)的扩增结果，对患者分泌物中的产气荚膜梭菌进行定量。
在本发明的一个实施方式中，步骤(a)所述的提取其中细菌的基因组DNA包括使用柱提取方法。
在本发明的一个实施方式中，步骤(b)中所获得的扩增产物的序列如SEQID NO：4所示。
本发明的另一个方面提供一种快速定量检测产气荚膜梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；和SEQ ID NO：3所示的探针。
在本发明的一个实施方式中，可通过如下方式获得DNA对照标准品以建立标准曲线：(a)克隆由所述引物对扩增获得的产气荚膜梭菌基因；(b)用质粒法制作DNA对照标准品。
在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；SEQ ID NO：3所示的探针；和DNA对照标准品。
在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒还包括使用说明书。
本发明针对气性坏疽病原体，建立一种荧光定量PCR方法，对战时气性坏疽病原体进行快速检测，实现对这种战时高发疾病安全、快速和定量检测，以便于对战时气性坏疽做出快速准确的报告，尽可能减少截肢的发生。本发明的方法具有高度的特异性、灵敏性和定量准确度，可以检出细菌或病毒的存在，全部检测过程在2-3小时内可以完成。本发明的检测方法和检测试剂盒最低可检出约10个细菌，定量误差小于5％，特异性和试剂稳定性等指标符合有关国家标准，检测全过程小于3小时。而且，本发明利用荧光定量PCR方法，一次检测量可以达到96或384个样本，这种集成化的自动检测手段，国内外尚无类似产品供应。
附图说明
图1为根据本发明的方法对患者分泌物进行气性坏疽病原体荧光定量PCR得到的产气荚膜梭菌DNA扩增曲线，其中CT值在15到34之间；
图2为对4个标准品进行气性坏疽病原体荧光定量PCR得到的Log浓度-CT值的标准曲线，其中标准品的浓度依次为5×10⁷拷贝/ml、5×10⁶拷贝/ml、5×10⁵拷贝/ml和5×10⁴拷贝/ml；
图3为根据本发明的方法对不同细菌的DNA进行荧光定量扩增得到的扩增曲线；
图4为根据本发明的方法对不同浓度梯度的产气荚膜梭菌DNA进行荧光定量扩增得到的扩增曲线；
图5为PCR扩增获得的本发明的目的基因片段的测序图谱。
具体实施方式
以下结合附图具体描述本发明的检测方法以及检测试剂盒及其优点。
本发明的基本原理：所选取的扩增产气荚膜梭菌目的基因片段的引物探针具有高度的特异性，仅能扩增产气荚膜梭菌目的基因并产生荧光。通过扩增曲线和标准曲线的分析，鉴定并定量产气荚膜梭菌的含量，从而达到快速、准确、定量检测气性坏疽病原体产气荚膜梭菌的目的。
本发明的方法中提取细菌基因组DNA时所用的硅基填料吸附分离方法是指采用溶解酶和蛋白酶K裂解细菌的方法释放细菌DNA后，采用柱提取方法，选择性吸附细菌DNA，再经过洗涤步骤，获得提纯的DNA。
试剂及仪器
试剂：NALC溶液(100ml NALC溶液包括：50ml 2.94％柠檬酸钠，50ml 4％氢氧化钠，500mg N-乙酰-L-半胱氨酸)；PBS；溶菌酶(10mg/ml，在10mM tris-HCl中，pH8.0)；结合缓冲液(Binding Buffer)(6M胍-HCl、10mM尿素，10mMTris-HCl、20％Triton X-100，pH4.4)；Proternase K；异丙醇；抑制剂去除缓冲液(inhibitor removal buffer)(5M胍-HCl、20mM Tris-HCl，pH6.6)；洗涤缓冲液(wash buffer)(20mM NaCl、2mM Tris-HCl，pH7.5)；洗脱缓冲液(elution buffer)(10mM Tris-HCl，pH8.5)；核酸提取柱5×PCR缓冲液；dNTPs；15μM引物1；15uM引物2；10μM探针；5U/μl Taq酶。
仪器：Roche LightCycler 480全自动荧光定量PCR扩增仪
细菌DNA模板的制备
以1∶1比例将NALC溶液加入到样本中，轻柔搅拌，直至样本变成流体；3000g离心5min，弃上清；沉淀物加入200μl PBS，用吸管反复吹打使之重悬；加入5μl溶菌酶混匀，37℃孵育15min；加入200μl结合缓冲液和40μlProternase K，混匀，70℃孵育15min；加入100μl异丙醇，混匀；采用柱提取方法，将所有样品吸取到核酸提取柱上面，8000g离心1min，选择性吸附细菌DNA；加入500μl抑制剂去除缓冲液8000g离心1min；加入500μl洗涤缓冲液8000g离心lmin，重复洗涤一遍；14000rpm离心1min，充分去除残留洗涤缓冲液；加入200μl预热到70℃的洗脱缓冲液，8000g离心1min，获得提纯的DNA。
荧光定量PCR
按顺序向PCR管中加入5μl 5×PCR缓冲液；1μl 5mmol/L dNTPs；1μl 15μM引物1；1μl 15uM引物2；0.6μl 10μM探针；0.2μl 5U/μl Taq酶及2μl细菌DNA模板，最后以无菌双蒸水补足至体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的小离心管置于Roche LightCycler 480全自动荧光定量PCR扩增仪中，扩增程序为95℃ 5分钟，然后95℃ 15秒、55℃ 20秒、72℃ 20秒、55℃时采集荧光，重复40个循环。在上述PCR中，探针的序列为：
5’-[FAM]TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC[TAMRA]-3’
标准曲线的制作
在本发明中可综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(threshold)和基线(baseline)：基线选取2-6或3-7个循环，阈值线选在阴性扩增曲线的上方。此处阈值为0.8268，噪音限(noise band)为0.9491，基线循环数(baseline cycle)为3-7个循环。仪器自动生成标准曲线，并计算给出样本的结果。如图2所示，Roche LightCycler 480全自动荧光定量PCR扩增仪自动生成的标准曲线参数为：斜率为-3.319，截距为42.00，效率为2.001。
在其他实施方式中，可通过以下步骤来获得DNA对照标准品以建立标准曲线：(a)克隆由所述引物对扩增获得的产气荚膜梭菌基因；(b)用质粒法制作DNA对照标准品。这种DNA对照标准品由于只含有100个碱基左右的产气荚膜梭菌基因，完全没有感染性和危险性；而且质粒中的DNA相当稳定，非常适合批量和规范制备的需要。
扩增产物的测序结果
使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物对，对提取的DNA进行普通PCR后，采用Takara(日本)公司的pMD19-T载体和目的片段连接后，转化到DH5α大肠杆菌中，获得阳性克隆，经过琼脂糖电泳鉴定后测序。测序所得序列如SEQID NO：4所示。测序图谱如图5所示。
本发明方法的特异性测试
以相似方法对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、诺氏梭菌等其他细菌的基因组DNA进行扩增，扩增曲线无明显抬高。
实验步骤：取1ml培养的菌液(3×10⁸个细菌)，3000g离心5分钟，弃上清；沉淀物加入200μl PBS，用吸管反复吹打使之重悬；加入5μl溶菌酶混匀，37℃孵育15min；加入200μl结合缓冲液和40μl Proternase K，混匀，70℃孵育15min；加入100μl异丙醇，混匀；采用柱提取方法，将所有样品吸取到柱子上面，8000g离心1min，选择性吸附细菌DNA；加入500μl抑制剂去除缓冲液，8000g离心1min；加入500μl洗涤缓冲液，8000g离心1min，重复洗涤一遍；14000rpm离心1min，充分去除残留洗涤缓冲液；加入200μl预热到70℃的洗脱缓冲液，8000g离心1min，获得提纯的DNA。
按顺序向PCR管中加入5μl 5×PCR缓冲液；1μl 5mmol/L dNTPs；1μl 15μM引物1；1μl 15uM引物2；0.6μl 10μM探针；0.2μl 5U/μl Taq酶及2μl细菌DNA模板，最后以无菌双蒸水补足至体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的小离心管置于Roche LightCycler 480全自动荧光定量PCR扩增仪中，扩增程序为95℃ 5分钟，然后95℃ 15秒、55℃ 20秒、72℃ 20秒、55℃时采集荧光，重复40个循环。
结果分析：综合分析仪器给出的各项数据，此处阈值为0.2657，噪音限为0.2657，基线循环数为2-6个循环，结果如图3所示，阳性曲线为产气荚膜梭菌，CT值为30，水平曲线从上往下依次为：创伤弧菌、弗劳地枸橼酸杆菌、产吲哚黄杆菌、ATCC25923金黄色葡萄球菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC25922大肠埃希菌、ATCC35656多食鞘氨醇杆菌、ATCC43047阴沟肠杆菌、ATCC12453奇异变形杆菌、ATCC35157肺炎克雷伯菌、ATCC14028伤寒沙门菌、ATCC51331嗜麦芽窄食单胞菌。实验结果总结在下表1中，可见本发明只可扩增产气荚膜梭菌，因而具有非常高的特异性。
表1