一种小反刍兽疫病毒的RTLAMP试剂盒.pdf

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测小反刍兽疫病毒的RT-LAMP试剂盒，所述试剂盒包含有四条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。该试剂盒可快速、灵敏地检测小反刍兽疫病毒，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的现场检测，易于大范围推广应用。

1、  一种用于检测小反刍兽疫病毒的特异性LAMP引物组，包括以下四条引物：
F3：5’-ACATCAACGGGTCAAAGCT-3’；
B3：5’-ACTCGAGGGTCCTTCAGTTG-3’；
    5’-CCGCTGTATCAATTGCCCGGG-TT
FIP：
    TT-CGGCGTGATGATCAGCATG-3’；
    5’-GCATCCGCCTTGTTGAGGTAGT-TT
BIP：
    TT-TTGTCCAAATCAGCACCACG-3’。

2、  一种包括如权利要求1所述的四条LAMP引物的小反刍兽疫病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

3、  如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含LAMP反应液，与四条LAMP引物共同构成LAMP检测体系；25μL LAMP检测体系的具体配置为：
F3、B3                                     各0.1～0.2μM；
FIP、BIP                                   各0.4～0.8μM；
dNTP mix                                   0.4～1.0mM；
Mg²⁺                                       2～6mM；
反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer    1×；
链置换DNA聚合酶                            8U；
甜菜碱                                     0.5～2M；
AMV逆转录酶                                10U；
Triton X-100                               0.1％。

4、  如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，25μL LAMP检测体系的具体配置为：
F3、B3          各0.1μM；
FIP、BIP        各0.8μM；
dNTPmix         1.0mM；
Mg²⁺                                       4mM；
反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer    1×；
链置换DNA聚合酶                            8U；
甜菜碱                                     0.5M；
AMV逆转录酶                                10U；
Triton X-100                               0.1％。

5、  如权利要求2-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测反应条件为：63℃恒温1h，80℃2min，然后终止反应。

一种小反刍兽疫病毒的RT-LAMP试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测小反刍兽疫病毒的RT-LAMP试剂盒。
背景技术
小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)属于副粘病毒科麻疹病毒属，其所导致的小反刍兽疫被世界动物卫生组织列为必须上报动物传染病，是一种烈性、接触性传染病，主要感染小反刍兽，特别是山羊高度易感，易感群中发病率高达100％，严重暴发时致死率为100％。
本病于1942年在西非的科特迪瓦首次发现，近年来该病呈蔓延的趋势，并且规模越来越大。近期，我国周边国家(老挝，孟加拉国，印度，尼泊尔，俄罗斯，巴基斯坦和缅甸等)暴发了大规模小反刍兽疫疫情。目前世界动物卫生组织规定的小反刍兽疫病毒检测标准方法有竞争ELISA和PCR方法。
但是竞争ELISA实验耗时较长，操作复杂，属于感染后的晚期诊断，并不适合作为快速检测方法；早期诊断主要采用基于病毒核酸的RT-PCR方法，但是由于RT-PCR耗时长、灵敏度低、特异性低、仪器要求高，很难在感染的初期就检测出病毒。实时荧光定量TaqManRT-PCR和NASBA方法虽然特异性和灵敏度有所提高，但是需要产生荧光的引物和探针，还需要昂贵的检测设备，最低也只能检测到810个拷贝的RNA模板。
环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用Bst-DNA polymerase的帮助，从而可在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。
Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。
LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见该方法在小反刍兽疫病毒检测中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测小反刍兽疫病毒的特异性LAMP引物组，包括以下四条引物：
F3：    5’-ACATCAACGGGTCAAAGCT-3’；
B3：    5’-ACTCGAGGGTCCTTCAGTTG-3’；
        5’-CCGCTGTATCAATTGCCCGGG-TT
FIP：
        TT-CGGCGTGATGATCAGCATG-3’；
        5’-GCATCCGCCTTGTTGAGGTAGT-TT
BIP：
        TT-TTGTCCAAATCAGCACCACG-3’。
本发明的另一目的是提供一种包括上述四条LAMP引物，具有高灵敏度、高特异性、可见化的、操作方法简单的小反刍兽疫病毒的RT-LAMP检测试剂盒。
本发明所述的小反刍兽疫病毒的RT-LAMP检测试剂盒还包含有四条LAMP引物的LAMP反应液，共同构成LAMP检测体系。
25μL LAMP检测体系的具体配置为：
F3、B3                        各0.1～0.2μM；
FIP、BIP                      各0.4～0.8μM；
dNTP mix                      0.4～1.0mM；
Mg²⁺                          2～6mM；
反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer                1×；
链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)                    8U；
甜菜碱(betaine)                                        0.5～2M；
AMV逆转录酶                                            10U；
Triton X-100                                           0.1％。
优选的，本发明25μL LAMP检测体系的具体配置为：
F3、B3                                      各0.1μM；
FIP、BIP                                    各0.8μM；
dNTPmix                                     1.0mM；
Mg²⁺                                        4mM；
反应缓冲液10×ThermoPol Reaction Buffer     1×；
链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)         8U；
甜菜碱(betaine)                             0.5M；
AMV逆转录酶                                 10U；
Triton X-100                                0.1％。
其中，四条LAMP引物的长度分别为：
F3：ACATCAACGGGTCAAAGCT                19bp
B3：ACTCGAGGGTCCTTCAGTTG               20bp
    CCGCTGTATCAATTGCCCGGG-TT
FIP：                                  44bp
    TT-CGGCGTGATGATCAGCATG
    GCATCCGCCTTGTTGAGGTAGT-TT
BIP：                                  46bp
    TT-TTGTCCAAATCAGCACCACG
本发明所述LAMP试剂盒的检测反应条件为：63℃恒温1h，80℃2min，然后终止反应。
与现有的小反刍兽疫病毒早期检测方法相比，本发明所述的RT-LAMP试剂盒有显著的优点。首先RT-LAMP成本低廉，利用BstDNA polymerase在63℃实现等温扩增，不需要复杂且却昂贵的PCR仪；其次是反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP无需增加42℃30min的反转录过程，可以在1h内完成反应(最少17min)，而一般的RT-PCR至少需要3-4h；反应结果易于观察，LAMP在DNA扩增过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，在反应结束后无需琼脂糖凝胶电泳可直接肉眼观察反应管中的浑浊来判断阳性与否，如果在反应后加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下就会呈现出强烈的绿色荧光；特异性好，对麻疹病毒属内的犬瘟热病毒等都呈阴性反应；灵敏度高，是一般RT-PCR灵敏度的1000倍，最低可以检测到7个拷贝的RNA模板，即使是几个病毒粒子，也能被快速准确的检测出来。
与RT-PCR相比，RT-LAMP操作更为简单，产物更加容易检测，扩增效率更高。除此之外，RT-LAMP在普通的恒温水浴锅中就能进行，而RT-PCR需要精确且快速的温度变化，需要在精密的热循环仪中进行。由于RT-LAMP的阳性结果用肉眼就可以观察到，因此避免了凝胶染色的步骤，也就避免了接触溴化乙锭等危险化合物。
本发明所述的RT-LAMP试剂盒可快速、灵敏地检测小反刍兽疫病毒，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧饲养场的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为LAMP体系优化结果，其中：图1-A为不同MgSO₄浓度与电泳亮度关系图，图1-B为不同dNTP浓度与电泳亮度关系图，图1-C为不同Betaine浓度比例与电泳亮度的关系图，图1-D为不同温度下反应的电泳亮度关系图。其中，图1-A中1～5泳道MgSO₄浓度分别为2mM，4mM，6mM，8mM，10mM；M为DL2000plus marker；图1-B中1～5泳道dNTP浓度分别为0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM；M为DL2000plus marker；图1-C中1～5泳道Betaine浓度分别为0mM，1mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM，M为DL2000plus marker；图1-D中1～5分别为反应混合物的反应温度分别为61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，M为DL2000-plus marker。
图2为内外引物浓度优化的结果，1～4泳道分别是内外引物浓度之比分别为2∶1，4∶1，6∶1，8∶1的电泳结果；M为DL2000-plus marker。
图3为RT-LAMP特异性实验；其中M：DL 2000plus；1：以犬瘟热病毒基因组为模板的RT-LAMP；2：以PPRV基因组为模板的RT-LAMP。
图4为RT-LAMP、RT-PCR和巢式PCR的灵敏度检测；
其中图4-A中，M：DL 2000plus；1～12：以10倍稀释的PPRV RNA(8.5ng/μL～8.5×10^-12ng/μL)为模板的RT-LAMP。
图4-B：M.DL 2000plus；1～12.以10倍稀释的PPRV RNA(8.5ng/μL～8.5×10^-12ng/μL)为模板的RT-PCR。
图4-C：M.DL 2000plus；1～12.以RT-PCR产物为模板的巢式PCR。
图5为RT-LAMP的可视化结果；其中，N：阴性对照；1～12：以10倍梯度稀释的PPRV RNA(8.5ng/μL～8.5×10^-12ng/μL)为模板的RT-LAMP实验。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如无特别指明，以下实施例所用的引物由上海英骏生物技术有限公司合成；Bst DNA聚合酶(大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、Mg²⁺购自Sigma公司。
实施例1
一、引物的设计
使用Primer 4.0(http://primerexlorer.jp；Eiken Chemical Co.Ltd，Japan)，针对PPRV N基因的保守区域(GeneBank，gi：397561，保守区域1-700bp)设计四条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)
二、RT-LAMP
1、病毒RNA的提取：
取小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1(新疆天康生物制品厂制品：小反刍兽疫弱毒疫苗)。使用TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.3.0试剂盒(TaKaRa公司)，按照说明书从250μLPPRV细胞培养液中提取病毒总RNA，最后溶于30μL洗提缓冲液(Elution Buffer)中，加入1μL RNA酶抑制剂(TaKaRa公司)(20U)，-80℃冰箱中储存备用。
2、RT-LAMP检测体系的建立
参照Notomi等(Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28：E63)，构建25μL RT-LAMP反应体系，依次对MgSO₄、dNTP、Betaine的浓度和反应温度进行优化。
通过设置不同终浓度的Mg²⁺：2mM，4mM，6mM，8mM，10mM，12mM；不同终浓度的dNTP：0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，1.0mM，1.2mM；不同终浓度的Betaine：0mM，0.3mM，0.5mM，1mM；不同终浓度的内外引物浓度比例：2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，此时具体的引物浓度比为：0.2μM∶0.1μM，0.4μM∶0.1μM，0.6μM∶0.1μM，0.8μM∶0.1μM，1.0μM∶0.1μM，其它条件选择实验过程的优选试验条件。
包含20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，2mM到10mM MgSO₄，0.2mM到1.0mM eachdNTP，0M到2M Betaine，8UBstDNApolymerase，10UAMV反转录酶，1μL RNA，各0.1μM F3和B3；各0.8μM FIP和BIP，补充DEPC水至25μL。反应混合物分别置于61℃，62℃，63℃，64℃及65℃水浴锅中反应1h，80℃2min终止反应，最终通过产物琼脂糖凝胶电泳获得获得的典型梯状条带的亮度，优化得到最佳反应参数。
结果见图1的A、B、C、D，显然，当MgSO₄的浓度为2-6mM时，条带清晰；当dNTP的浓度为0.4-1.0mM，条带清晰；当甜菜碱Betaine的浓度为1、1.5、2.0M时，条带清晰；在65℃进行反应得到的电泳结果的条带清晰。
在65℃反应1h，80℃2min对不同内外引物浓度比例的反应体系进行反应，通过凝胶电泳选择较亮的条带作为反应的最终浓度，结果参见图2。当内外引物浓度为8∶1时，条带清晰。
优化的检测体系(25μL)如下：
1×ThermoPol Reaction Buffer，外引物(F3和B3)各0.1μM，内引物(FIP和BIP)各0.8μM，Mg²⁺4mM，Betaine 0.5M，d NTPmix 1.0mM each，0.1％的Triton X-100，Bst DNA聚合酶8U，AMV反转录酶10U，模板1μL。
检测反应条件：63℃恒温1h，80℃2min终止反应。
3、检测体系特异性、灵敏性分析
使用同为疱疹病毒属的犬瘟热病毒和小反刍兽疫病毒为模板检测体系的特异性，LAMP检测体系的特异性测试良好，可特异性的检测到小反刍兽疫病毒。参见图3。
从250μL小反刍兽疫病毒液中提取病毒总RNA，在紫外分光光度计上测定其RNA含量，将RNA样品进行十倍梯度稀释，将稀释后的样品分别进行RT-LAMP、RT-PCR和巢式PCR(RT-PCR使用的引物是Nup：CTGGAATTCATGGCTACTCTCCTTAAAAG；和Nlp：GTTGCGGCCGCTCAGCTGAGGAGATCCTTGT；巢式PCR所用的引物是：外引物与RT-PCR使用的引物相同；内引物为Nf：GGCGTGATGATCAGCATGTT；以及Nd：CCACGTGATGCAAAGGTCAAC)，比较三种检测方法的灵敏度。RT-LAMP可以检测到RNA的为水平8.5×10^-11ng/μL，而RT-PCR仅能检测到8.8×10^-8ng/μL，比RT-LAMP低了3个数量级。参见图4。
4、检测体系的结果鉴定
一方面，由于LAMP在DNA扩增过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，可通过观察终反应液是否浑浊确认是否进行了扩增反应，是否为阳。
也可以在RT-LAMP检测体系中加入荧光染料SYBR Green I，紫外灯下肉眼观察若反应液变为绿色，则说明反应呈阳性，若无色则说明反应为阴性，参见图5。
序列表
<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120>一种小反刍兽疫病毒的RT-LAMP试剂盒
<130>KHP09112534.5
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
acatcaacgg gtcaaagct                                        19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
actcgagggt ccttcagttg                                       20
<210>3
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccgctgtatc aattgcccgg gttttcggcg tgatgatcag catg            44
<210>4
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gcatccgcct tgttgaggta gtttttttgt ccaaatcagc accacg                46
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ctggaattca tggctactct ccttaaaag                                   29
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gttgcggccg ctcagctgag gagatccttg t                                31
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ggcgtgatga tcagcatgtt                                             20
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ccacgtgatg caaaggtcaa c                                           21