技术领域
本发明涉及一种仪器，可以用于清醒状态下偏头痛动物模型造模。
背景技术
偏头痛是一种原发性头痛，发病机制不明，主要理论有血管源性学说、三叉神经血 管学说和皮层扩布性抑制学说。目前偏头痛的动物模型主要包括：血管源性机制模型， 以离体和在体的颅内血管为研究对象，主要用偏头痛药物的药代动力学等研究；皮层扩 布性抑制模型，关注皮层神经元的电活动，与偏头痛先兆有关；基因相关模型，从遗传 学方面探讨家族性偏头痛的发病机制；三叉神经血管反射模型，以三叉神经脊束核神经 元激活为造模成功的标志，根据造模方式分为三叉神经节刺激模型、硝酸甘油模型和硬 脑膜神经源性炎症模型。
颅内的动静脉系统是由三叉神经及其分支支配，因此称为三叉神经血管反射。硬脑 膜及附近的大静脉窦是颅内主要的伤害性感受组织，由三叉神经眼支支配，在偏头痛的 发病中起重要作用。在偏头痛发病时，由于脑膜血管扩张及脑膜周围炎症刺激了硬脑膜 及血管周围的痛觉感受器，信息由三叉神经节传入并兴奋三叉神经脊束核内的神经元。 信息沿头面痛传导通路向上传递至皮层，产生头痛，同时围绕血管周围的三叉神经术梢 释放血管源性活性肽如P物质、降钙素基因相关肽及神经肽等促进脑膜周围炎症的产生， 进一步兴奋三叉神经脊束核内的神经元，激活的三叉神经脊束核内的神经元可以再次释 放血管活性物质，形成激活环路，引起脑膜的无菌性炎症和血管扩张，使头痛的时间延 长、强度增加。因此，硬脑膜神经源性炎症模型较为合理的模拟了三叉神经血管放射学 说的病理生理过程，也是目前被学术界最认可的一种偏头痛发病理论学说。
目前常用的硬脑膜神经源性炎症模型又可以分为化学刺激模型和电刺激模型。电刺 激上矢状窦及其附近硬脑膜可以使三叉神经血管反射系统激活，导致三叉神经支配区域 的血流最增加，引起下丘脑、中脑导水管周围灰质等疼痛相关核团的神经元激活，模拟 偏头痛急性发作时的痛觉传入过程。但是，该造模方法对手术的要求较高，且目前国际 上采用的此种造模模型都是在麻醉状态下建造的，不符合临床实际偏头痛发作的情况。 头痛作为一种疼痛，是性质、强度和程度各不相同的多种感觉的复合，与自主神经系统、 心理和情绪反应交织在一起，是一种机制复杂的神经活动。动物在麻醉状态下，很难说 明该病的病理生理全貌。基于此种考虑，既往有研究曾尝试建立清醒状态下的头痛模型， 如有学者将辣椒素注入清醒大鼠小脑延髓池，观察到相应的头痛行为表现(过度理毛、 逃避和重复动作，但辣椒素可以破坏血脑屏障，直接激活中枢神经系统。有学者给清醒 大鼠皮下注射硝酸甘油，通过硝酸甘油的扩血管作用建立清醒状态下偏头痛模型，但由 于硝酸甘油无法特异性针对颅内血管起作用，全身性作用较大，因此对三叉神经血管反 射系统的激活有限。
发明内容
根据上述理论和实践经验，用一种双通道塑料盒与铜丝组合，采用牙科水泥固定， 建立了大鼠清醒状态下偏头痛动物模型。该模型属于硬脑膜神经源性炎症模型的电刺激 模型。但是在实践中，反复使用该模型发现有以下问题：①电极固定是将通电电极轻附 着在硬脑膜表面后用牙科水泥固定，反复使用后，牙科水泥容易整体脱落，盲法制作的 电极与硬脑膜接触无法保证；②固定电极需要的牙科水泥量大，覆盖在大鼠头顶部，影 响缝皮和皮肤愈合；③电极与刺激器连接的连接线是铜丝外塑料软管，反复使用容易折 断、脱落。
为此，我们又重新设计制作了内置铜芯双螺丝铆钉电刺激造模仪，该造模仪是在大 鼠清醒状态下，通过内置铜芯双螺丝铆钉代替既往牙科水泥固定电极的方法，直接将电 极固定在动物颅骨表面，并与刺激器连接，增加电极的牢固性和动物模型反复使用的可 行性，操作较前简化，电极与硬脑膜接触的可靠性提高。
使用本造模仪建立的模型属于硬脑膜神经源性炎症模型的电刺激模型。在既往麻醉 电刺激上矢状窦及附近硬脑膜的基础上，通过将前端长度限制的平头内置铜芯双螺丝铆 钉锚定在大鼠颅骨表面，增加电极与颅骨的接触表面的同时，限制了电极深入颅骨内的 长度，螺纹锚定固定更加稳定可靠，有效模拟临床上偏头痛患者清醒状态下发病、反复 发病的临床过程，模型稳定，可重复性好，有效解决了以往动物模型使用次数有限，电 极容易脱落等问题。
附图说明
图1：实施例一所使用的电极
图2：实施例二所使用的内置铜芯螺丝铆钉
具体实施方式
偏头痛动物模型是研究偏头痛的重要工具，能够进行在人体无法进行的研究，揭示 偏头痛发生和维持过程中的重要机制，但前提是动物模型要尽可能的有效模拟疾病的状 态。以下描述了所建立的两种动物模型，以及采用的电刺激造模仪。
实施例一：
实验动物(本申请采用大鼠)以10％水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔内注射麻醉后，剪 掉头正中部毛发，固定于立体定位仪上。消毒并逐层切开皮肤、筋膜及骨膜以暴露颅骨。 在颅骨上选取颅中线冠状缝交点前4mm为前界，交叉点后6mm为后界，用台式牙科钻 钻开两个直径约1mm的圆孔，钻孔时使用4℃生理盐水以降低钻及孔的温度，防止灼伤 硬膜；暴露上矢状窦硬脑膜后将与线线接口连接好的单极电极放置于钻好的刺激孔中， 轻柔接触硬膜，但注意勿划破硬膜及上矢状窦；待颅骨骨面完全干燥后用齿科粉围绕电 极铺底面直径约为2mm的圆锥体，先以502胶水固定，待齿科粉完全干燥后再以齿科粉 加义齿基托树脂固定整个电极于骨面，待其完全干燥后缝合头皮皮肤，仅留线线结构与 皮肤外；马上以注射用青霉素钠溶于生理盐水腹腔注射(4万IU/100g)预防感染，以上所 有操作均在无菌条件下进行。此后将每只大鼠单笼饲养，自由进食进水，术后三天每天 均以注射用青霉素钠溶于生理盐水腹腔注射(4万IU/100g)，第四天将线线接口与电刺激 器的线线接口相连，进行电刺激。附图1是本实施例所采用的电极。
但是，上述实施例一所建立的动物模型发现有以下问题：①电极固定是将通电电极 轻附着在硬脑膜表面后用牙科水泥固定，反复使用后，牙科水泥容易整体脱落，盲法制 作的电极与硬脑膜接触无法保证；②固定电极需要的牙科水泥量大，覆盖在大鼠头顶部， 影响缝皮和皮肤愈合；③电极与刺激器连接的连接线是铜丝外塑料软管，反复使用容易 折断、脱落。因此，在实施例一的基础上，进一步研究出了实施例二的动物模型，通过 内置铜芯双螺丝铆钉代替牙科水泥固定电极的方法，增加电极的牢固定性和动物模型反 复使用的可行性，操作较前简化，电极与硬脑膜接触的可靠性提高。
实施例二
实验动物(本申请采用大鼠)以10％水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔内注射麻醉后， 剪掉头正中部毛发，固定于立体定位仪上。消毒并逐层切开皮肤、筋膜及骨膜以暴露颅 骨。在颅骨上选取颅中线冠状缝交点前4mm为前界，交叉点后6mm为后界，暴露上矢 状窦硬脑膜。将本申请所使用的内置铜芯螺丝铆钉尾部露出的铜丝用砂纸打磨去掉绝缘 外层，旋转固定于颅骨表面，旋转深度约1-1.5mm，使得铜丝贴近硬脑膜表面，由于螺 丝铆钉尾部为平面，不会损伤硬脑膜，从而达到刺激脑膜的效果。将两个螺丝铆钉都使 用上述方法固定在颅骨表面后，用75％酒精消毒切口及皮肤周围后缝合皮肤，将大鼠置 于原环境中静养，期间给与抗生素喂食，环境中保持安静，室温在25℃左右。大约4-5 天后，大鼠的皮肤愈合，但是螺丝铆钉顶部上方的铜丝将暴露在皮肤表面，通过该铜丝 对实验组大鼠给予电刺激。
在进行电刺激时，先将刺激器的两个导电夹分别夹在暴露在大鼠皮肤表面的两个铜 丝上(夹前去除铜丝上与导电夹接触区域的绝缘外层)，分离器与刺激器相连，应用刺激 器和分离器行电刺激。采用日本光电工业株式会社生产的刺激器(SEN-7103)和分离器 (SS-102J)给予方波电流刺激，频率为20HZ(Duration＝50μs，Interval＝250μs)。
给予电刺激后，大鼠模型出现过度理毛、甩头和扭头三种头痛相关行为学表现，刺 激局部硬脑膜的血流量增加，免疫组织化学染色提示三叉神经脊束核背角浅层神经元激 活，偏头痛治疗药物曲普坦类对疼痛的典型行为学、增加的硬脑膜血流量和激活的三叉 神经脊束核背角浅层神经元有抑制作用，符合偏头痛动物模型制备的业内标准(三叉神 经脊束核背角浅层神经元激活)和临床患者的表现(血管扩张、血管搏动样疼痛)、对药 物的反应(曲普坦治疗最有效)。
附图2是本申请所使用的内置铜芯螺丝铆钉，该螺丝铆钉是一个十字螺钉，在螺钉 顶部的十字中央钻孔，该孔至顶向下穿过整个螺钉，然后将覆盖了绝缘外层的铜丝穿过 该孔，从而形成本申请所使用的内置铜芯螺丝铆钉。
另外，本申请的电刺激造模仪还具有一个控制器，用于控制电流刺激的频率和强度， 一方面，实验人员可以手动调整电流刺激的频率和强度，另一方面，控制器还可以监控 实验动物的生理状态数据，根据该生理状态数据，以及预先设置的调整规则，自动地调 整电流刺激的频率和强度。
使用实施例二的电刺激造模仪建立的动物模型属于硬脑膜神经源性炎症模型的电刺 激模型。在既往麻醉电刺激上矢状窦及附近硬脑膜的基础上，通过将前端长度限制的平 头内置铜芯双螺丝铆钉锚定在大鼠颅骨表面，增加电极与颅骨的接触表面的同时，限制 了电极深入颅骨内的长度，螺纹锚定同定更加稳定可靠，有效模拟临床上偏头痛患者清 醒状态下发病、反复发病的临床过程，模型稳定，可重复性好，有效解决了以往动物模 型使用次数有限，电极容易脱落等问题。
在该模型的实际使用过程中，我们发现，由于电极发热以及电极本身材料的刺激都 会影响动物模型的模拟效果，因此为了获得更稳定和有效的模拟效果，需要进一步进行 改进。
首先，为了减少发热对硬脑膜的影响，铜丝本身的粗细应该是非均匀的。优选的， 铜丝接触硬脑膜的一端最粗，另一端最细，从最粗端到最细端，铜丝的粗细程度呈现线 性变化。
进一步的，我们在动物模型的模拟过程中发现，大脑对于外界的温度影响是很敏感 的，温度高一点和低一点都会对模拟效果产生较大的影响，因此为了获得最佳效果，铜 丝的线性变化系数应该谨慎选择。假设铜丝某一点距离其最粗端的长度为X，铜丝在该 点的横截面积为A，铜丝最粗端的横截面积为S，整根铜丝全长L，整根铜丝满足下述公 式A＝(L-nX/m)S/L，其中n和m是自然数，n＜m，n/m是铜丝的线性变化系数。我们选 取了10只大鼠，在n和m不同取值的情况下，对这些大鼠做了对照试验，观察大鼠模 拟效果的稳定性，通过近千次的对照试验，我们发现，当n＝3，m＝7时，大鼠的模拟效 果非常稳定，10只大鼠的偏头痛表现基本趋于一致，符合偏头痛动物模型制备的业内标 准(三叉神经脊束核背角浅层神经元激活)和临床患者的表现(血管扩张、血管搏动样 疼痛)，以及对药物的反应。也就是说，在优选方案下，铜丝应满足公式A＝(L-3X/7)S/L。
为了防止电极材料对硬脑膜的刺激影响，螺丝铆钉的材料应使用铜合金。纯铜的强 度不高，难以满足结构件的要求，必须进行铜的合金化。一般来说，Cr、Fe、P、Si、Zr、 Ti等元素容易导致铜合金的导电率下降明显，不适合于本发明作为电极材料使用。合金 元素Ag对铜合金导电率的降低影响小，是目前最廉价的贵金属电极材料，而其含量过高 会导致成本上升，本发明选择在铜合金中引入2％的银。Sn元素的使用提高铜合金电极 材料的机械强度和硬度，抗腐蚀性较好。本发明选择在铜合金中使用10％的Sn。最后， Ni也是本发明使用的主要合金元素之一，Ni元素能显著提高铜的强度、耐蚀性、导电和 导热性。另外，值得一提的是，本发明的铜合金中不含任何铅成分，安全环保，对环境 无害。本发明的铜合金纯度较高，不含S、P、Si等杂质。
根据上述理由，本发明螺丝铆钉优选成分为铜、锡、银和镍四种元素的合金，铜合 金中合金元素锡、银和镍的元素比例高达20％。所述铜合金依照重量百分比为：80％的 铜，10％的锡，2％的银，8％的镍。并且不含S、P、Si、Pb、Cr、Fe、Si、Zr、Ti杂质。