锁核酸和小沟结合物共修饰核酸片段 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体涉及寡核苷酸的标记方法。
背景技术
为了保证在PCR扩增过程中，探针或引物与模板的结合效率，探针和引物都有一定的长度的限制。一般所设计的引物长度在18~25个碱基，而像TaqMman探针的长度一般为20~40个碱基。但在实际过程中，在一些突变位点，SNP和高变异病毒的检测中，一般的探针和引物往往检测效果不理想，灵敏度和特异性很差。
MGB全名minor groove binder即小沟结合物，是源于某些抗菌素分子的化学基团，其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，一般可以将寡核苷酸的退火温度提高10度以上，可以缩短引物或探针的长度，提高特异性和给设计带来方便。锁核酸(Lockednucleic acid，LNA)，是新型的核酸类似物，它包含了2’-氧4’碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和优越的稳定性。LNA单分子的化学结构决定了寡核苷酸序列与目标序列杂交后的稳定性，与未标记相比，其双链在相同的盐溶液中，每增加一个单体LNA分子将导致其退火温度提升8℃。可以缩短引物或探针的长度，提高特异性和给设计带来方便。但是这两种方法由于其提高退火温度有限，因此有时也不能完全满足设计的要求。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种更好的标记寡核苷酸的方法，用于DNA突变识别检测和SNP的识别。
本发明一方面提供了一种标记寡核苷酸的方法，为在同一条寡核苷酸链上即标记LNA又标记MGB。
所述MGB标记在所述寡核苷酸链的3`端；所述LNA标记在所述寡核苷酸链的个别核苷酸上。
进一步的，所述个别核苷酸为发生突变的碱基。
在确定MGB及LNA在寡核苷酸链上的位置后，可通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法自动合成并标记设计好的序列。
本发明适合标记的寡核苷酸链的长度为10-18个碱基。
本发明的标记寡核苷酸的方法可用于DNA突变和SNP的识别检测。
本发明第二方面公开了一种LNA(Locked Nucleic Acid)和MGB(Minor GrooveBinder)共修饰的核酸片段，为既标记有LNA又标记有MGB的寡核苷酸链。
进一步的，所述MGB标记在所述寡核苷酸链的3`端；所述LNA标记在所述寡核苷酸链的个别碱基上。
进一步的，所述经标记的核酸片段为Taqman探针，所述寡核苷酸链的5’端还标记有报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团。
较佳的，所述报告荧光基团为FAM或VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。
本发明第三方面公开了上述寡核苷酸链作为引物、Taqman探针的应用。
进一步的，本发明的寡核苷酸链可作为引物或Taqman探针用于DNA突变识别检测。
研究发现，将MGB与LNA同时标记修饰寡核苷酸，相比单个标记可进一步提高其稳定性，从而使其退火温度提高。这样不仅让实验者在设计中拥有更大的选择空间，还可以提高寡核苷酸序列的特异性。
本发明的新型寡核苷酸通过运用MGB(minor groove binder)和LNA(Locked nucleicacid，LNA)的组合修饰：1)使Tm值提高了12-25℃，比只运用一种修饰技术的Tm值提高8-15℃提高了10℃左右。这可以保证寡核苷酸在满足Tm值的条件下，比单修饰或不修饰的序列更短，2)寡核苷酸序列中对A，G，C，T的组成要求降低。这些改变使得寡核苷酸：对核酸序列突变和SNP地识别能力增强。
本专利运用非常广泛，可以有效的运用到引物，Taqman探针等。
【附图说明】
图1：反应条件1反应体系1-样品1的PCR结果
图2：反应条件1反应体系1-样品2的PCR结果
图3：反应条件1反应体系1-样品3的PCR结果
图4：反应条件1反应体系1-样品4的PCR结果
图5：反应条件1反应体系2-样品1的PCR结果
图6：反应条件1反应体系2-样品2的PCR结果
图7：反应条件1反应体系2-样品3的PCR结果
图8：反应条件1反应体系2-样品4的PCR结果
图9：反应条件1反应体系3-样品1的PCR结果
图10：反应条件1反应体系3-样品2的PCR结果
图11：反应条件1反应体系3-样品3的PCR结果
图12：反应条件1反应体系3-样品4的PCR结果
图13：反应条件2反应体系1-样品1的PCR结果
图14：反应条件2反应体系1-样品2的PCR结果
图15：反应条件2反应体系1-样品3的PCR结果
图16：反应条件2反应体系1-样品4的PCR结果
图17：反应条件2反应体系2-样品1的PCR结果
图18：反应条件2反应体系2-样品2的PCR结果
图19：反应条件2反应体系2-样品3的PCR结果
图20：反应条件2反应体系2-样品4的PCR结果
图21：反应条件2反应体系3-样品1的PCR结果
图22：反应条件2反应体系3-样品2的PCR结果
图23：反应条件2反应体系3-样品3的PCR结果
图24：反应条件2反应体系3-样品4的PCR结果
图25：反应条件3反应体系1-样品1的PCR结果
图26：反应条件3反应体系1-样品2的PCR结果
图27：反应条件3反应体系1-样品3的PCR结果
图28：反应条件3反应体系1-样品4的PCR结果
图29：反应条件3反应体系2-样品1的PCR结果
图30：反应条件3反应体系2-样品2的PCR结果
图31：反应条件3反应体系2-样品3的PCR结果
图32：反应条件3反应体系2-样品4的PCR结果
图33：反应条件3反应体系3-样品1的PCR结果
图34：反应条件3反应体系3-样品2的PCR结果
图35：反应条件3反应体系3-样品3的PCR结果
图36：反应条件3反应体系3-样品4的PCR结果
【具体实施方式】
以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解实例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1：以Taqman探针为例
1.引物、探针的设计与合成
以乙型肝炎病毒的阿德福韦(ADV)突变为检测模板，设计引物和探针。
设计原理：1)引物以能够扩增出包含阿德福韦(ADV)突变的一段核苷酸序列为目的，按照引物设计原则进行设计.
2)探针以突变序列为目标序列进行设计。
设计的目标：在乙肝阳性标本中，未发生阿德福韦(ADV)突变的样本由于探针不能与之结合，所以不能释放出荧光信号；相反突变样本与目的核苷酸片段结合产生荧光信号。
引物：Forward primer：ADV-236-1：5’-TGGGCCTCAGTCCGTTTC-3’(SEQ ID NO：1)
Reverse primer.：ADV-236-2：5’-CCAATTACATATCCCATGAAGTTAAG-3’(SEQ IDNO：2)
1)普通Taqman探针，2)MGB探针，3)LNA探针，4)新探针.
各种探针的制备：
1.普通Taqman探针：ADV-236-3：5’-FAM-TGGGTATACATTTAACCCC-BHQ1(SEQID NO：3)
2.MGB探针：MGB-ADV-236-3：5’-FAM-TGGGTATACATTTAACCC-MGBNFQ(SEQID NO：4)(Minor groove binder/Non-fluorescent quencher)，该探针序列符合ABI公司提供的MGB设计原则。
1)以MGB为3`端设计TGGGTATACATTTAACCC核苷酸序列；
2)通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法合成设计好的序列。
3.LNA探针：LNA-ADV-236-4：5’-FAM-tatacAtttaaCcCc-BHQ1(SEQ ID NO：5)，该探针序列符合EXIQON公司提供的LNA设计原则。
1)设计tatacAtttaaCcCc核苷酸序列，在突变的位置用LNA进行标记；
2)通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法合成设计好的序列。
4.新探针：MGB-LNA-ADV-236-5：5’-FAM-acatttaaCccc-MGBNFQ(Minor groovebinder/Non-fluorescent quencher)(SEQ ID NO：6)
(注：如A，C表示为这个碱基是用LNA特殊单体标记的)
该探针序列符合ABI公司提供的MGB设计原则和EXIQON公司提供的LNA设计原则。
1)以MGB为3`端设计acatttaaCccc核苷酸序列；
2)通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法合成设计好的序列。
实验样本：4个不同浓度的乙型肝炎阿德福韦(ADV)变异模板为样本。
反应体系1：
模板 4μl
10XPCR reaction buffer 4μl
MgCl2(25mM) 3μl
Forward primer(20μM) 0.5μl
Reverse primer(20μM) 0.5μl
probe(20μM) 0.3μl
dNTP(10mM each) 0.8μl
Taq DNA polymerase(5U) 0.4μl
双蒸水 26.5μl
总体积40μl
反应体系2：
模板 4μl
10XPCR reaction buffer 4μl
MgCl2(25mM) 4μl
Forward pr imer(20μM) 0.5μl
Reverse primer(20μM) 0.5μl
probe(20μM) 0.3μl
dNTP(10mM each) 0.8μl
Taq DNA polymerase(5U) 0.4μl
双蒸水 25.5μl
总体积40μl
反应体系3：
模板 4μl
10XPCR react ion buffer 4μl
MgCl2(25mM) 6μl
Forward primer(20μM) 0.5μl
Reverse primer(20μM) 0.5μl
probe(20μM) 0.3μl
dNTP(10mM each) 0.8μl
Taq DNA polymerase(5U) 0.4μl
双蒸水 23.5μl
总体积40μl
反应条件1：
反应条件2：
反应条件3：
对比结果(结果参见图1-9)：
Taqman普通探 针 MGB探针 LNA探针 新探针 阳性率 0％ 55.56％ 66.7％ 100％
通过不同反应体系和反应条件的对比实验，我们可以看出，普通探针无法对突变位点进行检测，MGB和LNA的探针虽然有时也能检测到突变位点，但是与新探针相比，其在检测灵敏度，特异性，荧光释放以及稳定性都比较差。反应条件和反应体系的稍微改变就会引起检测结果的差异，重复性也较差。
【序列表】
<110>上海之江生物科技有限公司
<120>锁核酸和小沟结合物共修饰核酸片段
<130>ZJ090336
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>1
tgggcctcag tccgtttc 18
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>2
ccaattacat atcccatgaa gttaag 26
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Taqman探针
<400>3
tgggtataca tttaacccc 19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>MGB探针
<400>4
tgggtataca tttaaccc 18
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>LNA探针
<400>5
tatacattta acccc 15
<210>6
<211>12
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>MGB与LNA共修饰探针
<400>6
acatttaacc cc 12