甲基丙烯酸酯嵌段聚合物及其复合物及它们的制备方法和用途 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种甲基丙烯酸酯嵌段聚合物，该聚合物的纳米复合物及此复合物与质粒DNA的复合物，本发明还涉及他们的制备方法及其在作为基因的载体中的应用。
背景技术
对金纳米颗粒的研究已经有150年历史。金纳米颗粒具有抗氧化性强、生物相容性好、密度高和光电特性好的优点，基于金纳米颗粒的生物分析方法已经取得了很多成果。表面包被有单分子层的金纳米团簇(Au2MPCs)同核酸、蛋白质和细胞膜等生物物质发生作用，能应用于生物医学的各个研究领域。
文献[1]报道了阳离子脂质双层包裹的金纳米粒子调节对哺乳动物细胞转染的影响。二甲基二十八烷基溴化铵(DODAB)，阳离子脂质体双层膜包裹的Au纳米颗粒(AuNPs)在血清中能够有效的传递两种质粒DNA到人胚胎肾肝细胞(HEK 293)中，AuNPs的转染效率约是DODAB的5倍。AuNPs与DNA的相互作用由染料插入试验和凝胶电泳表征。文献提出了理解和控制阳离子脂质体和DNA相互作用的新观点，为构建金纳米粒子基因传递载体提供了新方法。
平均分子量为2kDa(PEI2)的支化聚乙烯亚胺(PEI)与金纳米颗粒(GNPs)共价键连接[2]构成PEI2-GNPs融合物，PEI2-GNPs与质粒DNA的复合物体外转染猴肾细胞(COS-7)的效率是PEI2的12倍。而PEI2-GNPs和N-十二烷基-PEI2与质粒DNA的复合物对上述细胞的转染效率进一步提高。具体转染数据是：单独的PEI2转染效率为4％，PEI2-GNPs转染效率为25％，而PEI2-GNPs和N-十二烷基-PEI2混合物与质粒DNA的复合物的转染效率为50％。
文献[3]报道了通过可逆加成-断裂连迁移聚合(RAFT)合成精细共聚物稳定的金属纳米颗粒的制备。反应通过室温条件自发还原硫代酯末端基团成巯基，在金属复合物或金属溶胶的水溶液中生成共聚物稳定的金属纳米颗粒。共聚物稳定的纳米颗粒包括Au(HAuCl4)，Ag(AgNO3)，Pt(Na2PtCl6.6H2O)，和Rh (Na3RhCl6)，使用0.01wt％的盐溶液和1.0M NaBH4作为还原试剂，NaBH4：末端硫代酯聚合物的摩尔比率是25∶1，通过13000rpm离心1小时，得到共价键连接的聚合物胶体溶液。
文献[4]报道了脂肪链季铵盐修饰的混合单层保护的金颗粒(MMPCs)对哺乳动物细胞的转染，通过β牛乳糖转移和活化证实这种转染试剂与孵育期间DNA与纳米颗粒的比率，单层核中电荷的数量，季铵盐周围的缩水填充等因素有关。MMPCs和质粒DNA复合物的重量比(w/w)为30∶1，在10％和100μM氯喹溶液中转染293T细胞效率是60kDa聚乙烯亚胺的8倍。
文献[5]报道了寡聚核酸修饰的金纳米颗粒用于控制细胞中蛋白质表达，这种修饰的金纳米颗粒是一种细胞内在化基因调控试剂，它与互补核酸结合率高于单一寡聚核酸修饰，没有细胞毒性，能高效浓缩核酸，也很难被活性核酸酶降解，细胞摄取率达99％。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供一种细胞转染率高、且细胞毒性低的端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物(MPDMAEMAIM)，此聚合物与金纳米粒子自组装构建的金纳米复合物(PDMAEMAIMGNPs)及该复合物与质粒DNA的复合物。
本发明进一步提供所述聚合物、复合物的制备方法。
本发明最后提供所述聚合物、复合物在作为基因的载体中的应用。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物，其结构式如下：
其中m＝16-36，n＝22-48，所述的聚合物用凝胶色谱表征，N，N-二甲基甲酰胺为流动相，流动速率为1.0mL/min，温度35℃，其数均摩尔质量为5000-11000Da，重均摩尔质量/数均摩尔质量在1.20-1.5；对[H+]缓冲容量在2.0-4.0μmol/mg。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的纳米金复合物，其结构式如下：
其中m＝16-36，n＝22-48，对[H+]缓冲容量在2.0-4.0μmol/mg。
所述的纳米金复合物为端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物自组装3-7个金原子构成的纳米颗粒。所述的纳米金复合物的缓冲溶液为磷酸钠缓冲溶液，纳米金复合物在磷酸钠缓冲溶液中的质量浓度为30μg/mL。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的纳米金复合物与质粒DNA的复合物，所述的质粒DNA选自p53DNA，绿色荧光蛋白质粒DNA(GFP DNA)以及人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA(CpG ODN)。所述的纳米金复合物与质粒DNA的复合物中，组装在金表面地端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物与质粒DNA正负电荷比的范围为6-12。所述的纳米金复合物与质粒DNA的质量比为5∶1，10∶1，15∶1或20∶1。所述的纳米金复合物与质粒DNA的复合物的缓冲溶液为磷酸钠缓冲溶液，纳米金复合物在磷酸钠缓冲溶液中的质量浓度为30μg/mL。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的制备方法，通过以下步骤实现：
a.通过乙基黄原酸钾和溴乙烷反应得到乙基黄原酸乙酯；
b.乙基黄原酸乙酯和乙烯基咪唑在偶氮二异丁腈催化下进行可逆加成-断裂连迁移聚合反应，得到黄原酸乙酯基聚乙烯基咪唑；
c.黄原酸乙酯基聚乙烯基咪唑和2-二甲氨基乙基-甲基丙烯酸酯在偶氮二异丁腈催化下进行可逆加成-断裂连迁移聚合反应，得到黄原酸乙酯基聚2-二甲氨基乙基-甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑；
d.将c中的产物黄原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑的四氢呋喃溶液中加入正丁胺，在氮气保护下氨解，得到端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的纳米金复合物的制备方法，通过以下步骤实现：将氯金酸与端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物混合，添加去离子水，搅拌，用硼氢化钠还原，过夜，磷酸盐缓冲溶液透析、定容。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物在作为基因的载体中的应用。
一种端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的纳米金复合物在作为基因的载体中的应用。
本发明中的聚合物及复合物的作用是结合基因，使基因转入细胞中，从而使转染效率提高，与通常意义上的“基因的载体”的作用相同。
本发明具有如下技术效果：
本发明中，端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物(MPDMAEMAIM)、端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物与纳米金的复合物(PDMAEMAIMGNPs)作为质粒DNA的载体，与质粒DNA结合，进而转染细胞，因此该聚合物可用作肿瘤抑制药物的载体。
端巯基聚(2-甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯咪唑聚合物的纳米金复合物(PDMAEMAIMGNPs)及其与质粒DNA的复合物(PDMAEMAIMGNPs/质粒DNA)在磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)中稳定。Zeta电位研究表明纳米基因复合物带正电，用扫描电镜观察PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA复合物的粒径在80-160nm，该粒径范围的纳米复合物有利于对细胞有效转染，并具有绿色荧光蛋白表达效果；PDMAEMAIMGNPs/CpG ODN复合物对小鼠具有体外免疫疗效；PDMAEMAIMGNPs/p53DNA复合物对鼠肿瘤具有体内外治疗效果，具体效果如下：
1.PDMAEMAIMGNPs和PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA复合物在磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2)中稳定。PDMAEMAGNPs/GFP DNA复合物缓冲溶液中呈现红色胶体、结合基因能力强。
2.PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA纳米复合物转染HEK 293T细胞后有利于质粒DNA释放，转染效率为55％。
3.PDMAEMAIMGNPs和PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA复合物在浓度30μg/ml时，细胞存活率大于90％。
4.PDMAEMAIMGNPs/CpG ODN复合物对小鼠的脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性显示免疫效果大于50％。
5.PDMAEMAIMGNPs/p53DNA复合物对鼠骨肉瘤细胞的基因治疗效果显示：有明显的肿瘤受抑制。
6.MPDMAEMAIM/GFP DNA复合物对293T细胞的转染效率小于10％，但细胞毒性与PDMAEMAIMGNPs基本相同。
【具体实施方式】
实例1：乙基黄原酸乙酯的合成
在500mL圆底烧瓶中加入100mL四氯化碳，0.1mol溴乙烷，0.12mol乙基黄原酸钠，室温下搅拌72h，减压过滤，分别用三氯甲烷和饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸馏除去溶剂，得到黄色油状液体，硅胶柱色谱分离，洗脱剂为己烷和乙酸乙酯混合溶剂(体积比90∶10)，得到乙基黄原酸乙酯。
实例2：黄原酸乙酯基聚乙烯基咪唑(OPEIM)的合成
在5mL圆底烧瓶中加入乙烯基咪唑(EIM)1g，偶氮二异丁腈(AIBN)4mg，乙基黄原酸乙酯80mg和2mL四氢呋喃，[乙基黄原酸乙酯]∶[偶氮二异丁腈]＝20。液氮冷冻去除氧气，再减压去氧后密封，70℃水浴中反应48h。冷却至室温后加入过量己烷沉淀、分离产物OPEIM。聚合物用1H NMR表征，D4-甲醇和D-氯仿为溶剂。
实例3：OPEIM引发2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯的RAFT聚合制备黄原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯基咪唑
在园底烧瓶中加入四氢呋喃，加入由实例2得到的OPEIM、(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈(AIBN)引发剂，[OPEIM]∶[AIBN]＝20。液氮冷冻去除氧气，再减压去氧后密封，70℃水浴中反应48h，冷却至室温后加入过量己烷沉淀、分离，得到黄原酸乙酯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯-嵌段-聚乙烯基咪唑(OPDMAEMAIM)。
实例4：端巯基聚(2-二甲氨基乙基)甲基丙烯酸酯嵌段-聚乙烯基咪唑(MPDMAEMAIM)的合成
将OPDMAEMAIM溶解在四氢呋喃溶液中，滴加数滴过硫酸铵溶液，充氮气30min后，加入正丁胺，在氮气保护下搅拌5h。反应混合物加入10倍过量的正己烷沉淀、过滤，得到端巯基聚聚甲基丙烯酸酯嵌段聚乙烯咪唑(MPDMAEMAIM)。
实例5：MPDMAEMAIM在纳米金表面的自组装产物(PDMAEMAIMGNPs)
在100mL的园底烧瓶中加入4mL氯金酸溶液(质量比1000∶1)，3mLMDPDMAEMAIM(10mg/mL)，3mL去离子水，剧烈搅拌15min。然后加入10vL(100mM)硼氢化钠，继续搅拌60min。静置过夜，然后在磷酸盐缓冲溶液中透析24h，定容至1mg/mL，得到PDMAEMAIMGNPs复合物。
MDPDMAEMAIM(mg/mL) 10* 30** 100*** HAuCl4(0.1％)(mL) 4 4 4 颜色 紫色 红色 红色 粒径(nm) 60-80 15-25 5-15
*最终形成的复合物记为：a
**最终形成的复合物记为：b
***最终形成的复合物记为：c
实例6：PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物
PDMAEMAIMGNPs(b)磷酸钠缓冲溶液与质粒GFP DNA混合(质量比为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1)，在37℃下震摇30min，用去离子水透析4h，滴加到洁净的硅片上，用扫描电镜观察形貌。
PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 颜色 浅红色 浅红色 浅红色 浅红色 粒径(nm) 80-160 80-160 80-160 80-160
实例7：PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA纳米复合物在十二烷基硫酸钠和氯化钠溶液中的稳定性
用凝胶电泳验证PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA纳米复合物的稳定性。十二烷基硫酸钠(SDS)浓度为1％和10％；氯化钠溶液浓度为0.5M，1M和1.5M。结果表明PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA纳米复合物在大于1M氯化钠溶液或1％十二烷基硫酸钠溶液中稳定性差。
实例8.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物转染HEK 293T细胞
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究PDMAEMAIMGNPs(b)与GFPDNA在各种质量比例条件下的绿色荧光蛋白表达效率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 绿色荧光蛋白表达效率％ 58 53 56 54
实例9.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物转染HeLa细胞
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究PDMAEMAIMGNPs(b)与GFPDNA细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 绿色荧光蛋白表达效率％ 3.6 3.7 2.5 2.8
实例10.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物转染293细胞
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基后，继续培养36h，用流式细胞仪研究PDMAEMAIMGNPs(b)与GFPDNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 绿色荧光蛋白表达效率％ 3.5 5.6 3.4 4.1
实例11.MPDMAEMAIM/GFP DNA纳米复合物转染HEK 293T细胞
MPDMAEMAIM/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究MPDMAEMAIM与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
MPDMAEMAIM/GFP DNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 绿色荧光蛋白表达效率％ 3.3 4.2 3.9 3.5
实例12.MPDMAEMAIM/GFP DNA纳米复合物转染HeLa细胞
MPDMAEMAIM/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养36h，用流式细胞仪研究MPDMAEMAIM与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
MPDMAEMAIM/GFPDNA(质比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 绿色荧光蛋白表达效率％ 1.7 1.7 2.5 3.5
实例13.MPDMAEMAIM/GFP DNA纳米复合物转染293细胞
MPDMAEMAIM/GFP DNA纳米复合物加入到平面培养的细胞中，24孔板中每孔种植5万个HEK 293T细胞，转染时间为6h。更换新鲜培养基，继续培养30h，用流式细胞仪研究MPDMAEMAIM与GFP DNA在各种质量比例条件下细胞的绿色荧光蛋白表达效率。
MPDMAEMAIM/GFP DNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 绿色荧光蛋白表达效率％ 2.2 3.2 2.9 2.8
实例14：PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物对小鼠肺和脊髓内鞘的体内转染
分别用PDMAEMAIMGNPs(b)与GFP DNA的质量比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1对小鼠尾静脉注射，48h后处死小鼠，取小鼠肺和脊髓进行切片，在荧光显微镜下计数PDMAEMAIMGNPs(b)/GFPDNA转染小鼠肺和脊髓内鞘的效率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 小鼠肺转染效率％ 6.2 8.5 7.7 6.4 脊髓内鞘转染效率％ 50 51 58 55
实例15.PDMAEMAIMGNPs(b)对HEK 293T细胞的毒性
两万个HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
PDMAEMAIMGNPs(b)(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 90 87 88 85 78 77
实例16.PDMAEMAIMGNPs(b)对HeLa细胞的毒性
两万个HeLa细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM培养基/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM培养基代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
PDMAEMAIMGNPs(b)(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 92 87 82 83 85 77
实例17.PDMAEMAIMGNPs(b)对293细胞的毒性
两万个293细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
PDMAEMAIMGNPs(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 90 87 82 83 75 78
实例18.MPDMAEMAIM对HEK 293T细胞的毒性
两万个HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μLDMEM/10％胎牛血清溶液中MPDMAEMAIM浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μLMTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
MPDMAEMAIM(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 90 85 84 78 75 66
实例19.MPDMAEMAIM对HeLa细胞的毒性
两万个HeLa细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM/10％胎牛血清溶液中MPDMAEMAIM浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
MPDMAEMAIM(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 91 89 85 83 79 73
实例20.MPDMAEMAIM对293细胞的毒性
两万个293细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM/10％胎牛血清溶液中MPDMAEMAIM浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
MPDMAEMAIM(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 90 86 84 83 77 71
实例21.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA复合物对HEK 293T细胞的毒性
两万个HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μLDMEM/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
PDMAEMAIMGNPs(b)(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 92 87 86 74 69 67
实例22.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA复合物对HeLa细胞的毒性
两万个HeLa细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA纳米复合物浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
PDMAEMAIMGNPs(b)(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 91 87 82 78 67 65
实例23.PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA复合物对293细胞的毒性
两万个293细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μL DMEM/10％胎牛血清溶液中PDMAEMAIMGNPs(b)/GFP DNA纳米复合物浓度为10-60μg/mL，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μL MTT。在37℃，CO2培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的存活率。
PDMAEMAIMGNPs(b)(μg/mL) 10 20 30 40 50 60 细胞存活率％ 92 87 82 73 65 57
24.PDMAEMAIMGNPs(b)/CpG ODN复合物对小鼠脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性
固定PDMAEMAIMGNPs(b)的浓度为30μg/mL，改变CpG ODN的浓度，对小鼠脾细胞和胰腺细胞分别用上述不同比例的PDMAEMAIMGNPs(b)/CpG ODN纳米复合物孵育3天，测试脾细胞免疫和胰腺细胞存活率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/CpG ODN(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 脾细胞免疫活性％ 20 26 36 43 胰腺细胞活性％ 35 42 40 37
实例25.PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA复合物对鼠骨肉瘤细胞的体外基因治疗
固定PDMAEMAIMGNPs(b)的浓度为30μg/mL，改变p53DNA的浓度，使其质量比分别为5∶1，10∶1，15∶1和20∶1鼠骨肉瘤细胞的体外基因治疗。鼠骨肉瘤细胞用PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA纳米复合物孵育3天，测试体外基因治疗显示肿瘤增长受抑制率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/p53DNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 肿瘤增长受抑制率％ 43 47 46 42
实例26.PDMAEMAIMGNPs(b)/p53 DNA复合物对鼠骨肉瘤细胞的体内基因治疗
固定PDMAEMAIMGNPs(b)的浓度为30μg/mL，改变p53DNA的浓度，使其质量比分别为5∶1，10∶1，15∶1和20∶1对鼠骨肉瘤进行体内基因治疗。PDMAEMAIMGNPs(b)/p53 DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤孵育3天，测试体内基因治疗显示肿瘤增长受抑制率。
PDMAEMAIMGNPs(b)/p53 DNA(质量比) 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 肿瘤增长受抑制率％ 38 43 41 38
结论及分析
MPDMAEMAIM在金纳米颗粒组装构建的PDMAEMAIMGNPs纳米材料，在金含量固定的条件下，金纳米颗粒的粒径随着MPDMAEMAIM含量的增大由约80nm逐渐变小到约5nm，溶液的颜色由紫色逐渐变成亮红色。MPDMAEMAIM组装到金表面的含量由10％增加到40％以上。
PDMAEMAIMGNPs浓缩GFP DNA的复合物的形貌特征是GFP DNA被PDMAEMAIM浓缩，形成粒径大于PDMAEMAIMGNPs的纳米颗粒；PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA复合物在1％十二烷基硫酸钠中不稳定，在高浓度氯化钠溶液中不稳定，在去离子水或磷酸钠缓冲溶液中稳定；PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA复合物对HEK 293T细胞的绿色荧光蛋白表达结果显示转染效率大于50％，对HeLa细胞和293细胞的转染效率低。
对小鼠实验结果表明，PDMAEMAIMGNPs/GFPDNA复合物对小鼠脊髓内鞘的转染效率高50％，而对小鼠肺转染效率低。PDMAEMAIMGNPs/CpGODN纳米复合物对小鼠的脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性显示免疫效果约40％。PDMAEMAIMGNPs/p53DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤细胞的体外和体内基因治疗效果显示肿瘤受抑制率约40％。
上述PDMAEMAIMGNPs，PDMAEMAIMGNPs/GFP DNA复合物纳米复合物的细胞毒性结果没有明显的细胞毒性。对癌细胞的免疫结果和对肿瘤的抑制效果显示阳性。
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