检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒 技术领域：
本发明涉及一种检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的ELISA试剂盒，属于兽医生物技术领域。用于猪圆环病毒2的抗体检测，以此判断猪群中圆环病毒2型感染情况以及对该病的流行情况以及免疫效果进行监测。
背景技术：
猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)与猪群中发生的许多疾病密切相关，诸如断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post weaning multisystemwasting syndrome，PMWS)猪皮炎肾炎综合症(Porcine dermatitis andnephropathy syndrome，PDNS)、母猪繁殖障碍、增生性肠炎、仔猪先天性震颤、猪呼吸道病综合征等，我们将由PCV2引起的多种病症统称为PCVD(porcinecircovirus disease，PCVD)，在诸多PCVD中，以PMWS最为常见，PMWS的主要引起猪渐进性消瘦、腹泻、呼吸道症状、皮肤苍白或出现黄疸、生产性能降低。PCV2除了本身引起猪病外，因侵害猪的免疫系统，抑制猪的免疫功能，还能与猪蓝耳病、猪流感、猪支原体肺炎、副猪嗜血杆菌和猪链球菌病等常见猪疫病病原相互作用，加重这些病的危害。目前PCV2已经在世界范围内广泛传播，给养猪业造成了巨大的经济损失。
PCV2的实验室诊断方法主要包括病理组织学检测、病毒的分离与鉴定、PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、原位杂交(ISH)、免疫组化法(IHC)等，但这些方法主要用于检测病原，且对试验条件和技术要求较高。
近年来，国内外不少科研单位建立了检测PCV2抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)，该方法具有操作简单、敏感性高、快速、易标准化等优点，尤其适合于大规模血清样品的检测。而目前用于检查PCV2抗体的ELISA方法主要是间接法，该方法的缺点是血清中所含的高浓度的非特异性抗体可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面，从而导致本底较高或者可能出现假阳性的结果。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种依据双抗原夹心ELISA的原理而研制的检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，用于猪圆环病毒2型抗体的检测。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成，包括：
a.ELISA板条：每个试剂盒包含4块真空包装的ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；该包被抗原是依据GenBank中PCV2的基因序列(登录号：AY943819)，设计两条引物，上游引物为：GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物为：GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC；通过PCR的方法从猪PCV2基因组中扩增不含核定位信号的Cap基因，将其克隆到pET32-a(+)原核表达载体中，构建pET32a-Cap重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组Cap融合蛋白，用亲和层析法纯化表达的融合蛋白制得；
b.洗涤液：10倍浓缩的pH为7.4的含0.5％(体积百分比)吐温-20的1M PBS溶液200ml；
c.100倍浓缩的酶标抗原500μl：将上述纯化的Cap融合蛋白用猪源肠激酶酶切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Cap蛋白，并用超滤管将其浓缩至2.0mg/ml，并采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上；
d.酶标稀释液：pH为7.4的0.1M PBS溶液50ml；
e.底物显色液50ml：称取200mg四甲基联苯胺，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A；称取9.33g柠檬酸，14.6g磷酸氢二钠，加入0.75％(质量体积比)过氧化氢尿素6.4ml，调pH值到5.0～5.4，双蒸水定容至1000ml，配制显色液B；显色液A、B等体积混合，即为显色剂；量取111.2ml18M浓硫酸稀释定容至1000ml即用；
f.终止液：2M硫酸溶液50ml；
g.标准PCV2阴、阳性血清各1.0ml。
上述采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上，具体是于5mg/ml HRP溶液中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，对pH4.4的1mM醋酸钠缓冲液4℃透析过夜，加20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2ml待标记的Cap蛋白至1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，4℃放置2小时，对pH7.4的0.15M PBS4℃透析过夜，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时后3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7.4的0.15M的PBS中，对pH7.4的0.15MPBS缓冲盐水透析，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗原。
双抗原夹心ELISA由于具有更高的敏感性和特异性，在人医上已广泛使用。与间接ELISA的主要不同之处在于用酶标抗原代替酶标抗抗体，酶标抗原不会与非特异性吸附的抗体结合，同时检测标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感性和特异性相对高于间接法。在此基础上，本发明将酶标抗原与待检血清同时加入到检测孔中，使反应一步完成。
应用本试剂盒对猪繁殖与呼吸综合症病毒标准阳性血清、猪瘟病毒标准阳性血清、伪狂犬病毒标准阳性血清、口蹄疫病毒标准阳性血清、猪细小病毒标准阳性血清、大肠杆菌标准阳性血清进行检测，结果均为阴性。说明本试剂盒所用诊断抗原与其它病原抗体之间无交叉反应。
而本发明的ELISA试剂盒与西班牙INGENASA公司试剂盒比较：INGENASA公司检测PCV2抗体的间接ELISA试剂盒(INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)在欧美等养猪业发达国家被广泛应用，是目前国际上公认的一种检测PCV2抗体的优质诊断试剂盒。分别用本试剂盒与INGENASA公司检测PCV2抗体的间接ELISA试剂盒(INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)检测94份临床送检血清，比较其结果的一致性，结果见表1。
表1本试剂盒与INGENASA公司试剂盒的比较试验
从本发明的ELISA试剂盒与INGENASA公司试剂盒的对比试验来看，大部分被检样品中的最终判定结果一致，只有少数弱阳性血清和OD450值接近判定标准的阴性血清地检测结果不一致，这可能与两种ELISA检测系统所选用的诊断抗原不同以及两个系统本身的误差有关。
另外，与INGENASA公司检测PCV2抗体的间接ELISA试剂盒相比，本发明的ELISA试剂盒只需一步孵育，省去了酶标抗体孵育过程(30分钟)和一个6次的洗涤过程，从而节省了将近1个小时的检测时间。
本发明的ELISA试剂盒与传统的检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法相比，具有相近的敏感性和更好的特异性，且操作过程更加简单、所需检测时间更少。
附图说明：
图1是重组Cap融合蛋白的表达及纯化后电泳图。
其中：第1泳道：重组表达菌裂解后沉淀；第2泳道：重组表达菌裂解后上清；第3泳道：阴性对照全菌；第4泳道：蛋白质标准，从上至下分别是94KD、66KD、45KD、30KD、26KD、20KD、14KD；第5泳道：纯化的重组Cap融合蛋白。图2是重组Cap融合蛋白的酶切及Cap蛋白的纯化与浓缩后电泳图。
其中：第1泳道：超滤浓缩后Cap蛋白；第2泳道：酶切纯化后Cap蛋白；第3泳道：重组Cap融合蛋白酶切；第4泳道：纯化的重组Cap融合蛋白；第5泳道：蛋白质标准，从上至下分别是97KD、66KD、44KD、29KD、22KD、14KD。
具体实施方式：
包被抗原的制备：
根据GenBank中PCV2的基因序列(登录号：AY943819)，设计两条引物，上有引物为：GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物为：GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC。通过PCR的方法从猪PCV2基因组中扩增不含核定位信号的Cap基因，将其克隆到pET32-a(+)原核表达载体(购自Novagen公司，产品编号：69015-3)中，构建pET32a-Cap重组表达载体。转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组Cap融合蛋白，该蛋白呈可溶性表达。用亲和层析法(Novagen公司His-BindKit，产品编号：70239-3)纯化表达的融合蛋白，见图1。
PCV2抗体检测板的制备：
用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释纯化的Cap融合蛋白，用方阵法确定最佳包被浓度为5μg/ml，取可拆96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被24小时后用含0.05％吐温-20(体积比)的PBS(pH7.4)洗涤液(PBST)洗涤2次，用5％脱脂奶粉(质量体积比)37℃封闭1小时，用PBST充分洗涤，室温风干，制备抗体检测板。
酶标抗原的制备：
将纯化的Cap融合蛋白用猪源肠激酶酶(购自南京金思特公司，产品编号：Z01003)切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Cap蛋白，并用超滤管(购自Millipore公司，滤芯10KDa，产品编号：U650886)将其浓缩至2.0mg/ml用于标记，见图2。
采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶(HRP)偶联于Cap蛋白上。具体过程如下：于5mg/ml HRP溶液中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，对1mM醋酸钠缓冲液(PH4.4)4℃透析过夜，加20μl 0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2ml待标记的Cap蛋白至1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，4℃放置2小时，对0.15M PBS(PH7.4)4℃透析过夜，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时后3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M的PBS(PH7.4)中，对0.15M的PBS(PH7.4)缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗原。用单项滴定法确定酶标抗原的ELISA效价达1∶6000。
缓冲液的制备：
配制0.1M PBS(PH7.4)作为PCV2抗体检测试剂盒的酶标抗原稀释液，含0.5％吐温-20的1M PBS(PH7.4)为10×浓缩洗涤液。
显色剂的制备：
称取200mg四甲基联苯胺(TMB)，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A。称取9.33g柠檬酸，14.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，加入0.75％(质量体积比)过氧化氢尿素6.4ml，调pH值到5.0～5.4，双蒸水定容至1000ml，配制显色液B。显色液A、B等体积混合，即为显色剂。量取111.2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000ml，备用。
阴、阳性对照与判定标准：
在ELISA过程中，不同操作人员和不同的检测批次之间会存在一定的误差，比如，加样和反应时间的误差等，这些误差会导致检测样品OD值的误差。但检测样品OD值/标准样品OD值(S/P值)可以消除误差，准确反应检测结果，是优化的判定标准。在PCV2标准阴、阳性血清中分别加入0.2mg/ml的NaN3，使其能在4℃长期保存而抗体效价变化不大。
判定标准：当标准阳性血清OD值≥0.8；标准阴性血清OD值＜0.3，说明试验有效。当S/P≥0.3，样品为抗PCV2抗体阳性，当S/P＜0.3，样品为抗PCV2抗体阴性。
试剂盒的组装：
a.ELISA板条：每个试剂盒包含4块真空包装的ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA板条，规格为8孔×12条。
b.洗涤液：10倍浓缩的含0.5％(体积)吐温-20的1M PBS(PH7.4)200ml。
c.100倍浓缩的酶标抗原500μl。
d.酶标稀释液50ml。
e.底物显色液50ml。
f.终止液：2M硫酸溶液50ml。
g.标准PCV2阴、阳性血清各1.0ml。
样品检测的基本操作步骤为：
a.将浓缩的酶标抗原用酶标稀释液100被稀释至使用浓度，加入到ELISA板的反应孔内，每孔加入80μl，然后每孔加入血清20μl，震荡混匀，封板，置37℃孵育1小时。
b.每孔加入300μl洗涤液洗板5次，吸干空内残留液体后每孔加入100μl底物TMB，37℃避光显色15分钟。
c.每孔加入终止液2M硫酸100μl终止显色，立即用酶标仪在450nm波长下读数。
注：除浓缩的酶标抗原外，其它试剂盒组分以及待检血清用前恢复至室温。