大分子胶原蛋白的精制工艺 【技术领域】
本发明涉及一种蛋白精制工艺，特别是一种大分子胶原蛋白的精制工艺。
背景技术
胶原蛋白是一类在医用外科、美容充填、护肤品等行业广泛应用的原材料。目前我国胶原蛋白生产主以猪、牛等的皮、腱等为原料经过提取工艺得到大分子胶原蛋白粗品。大分子胶原蛋白粗品需要经过精制才能在医用外科、美容充填、护肤品等行业应用。传统大分子胶原蛋白的精制过程为：在胶原蛋白粗提液中首先加入Tris至0.01-1.0mol/L，再加入氯化钠至1.5-3.5mol/L，盐析并在低温或4℃冰箱放置2-48h，后1000-20000rpm冷冻离心机离心10-100min，得胶原蛋白沉淀；将沉淀溶解在0.1-10mol/L的醋酸中，重新盐析1-5次，用0.001-0.1mol/L醋酸透析10-100h，再用蒸馏水透析10-100h，冷冻干燥得到大分子胶原蛋白。
传统精制工艺中，首先加入Tris，再加入氯化钠，缓慢搅拌溶解、需要消耗大量的Tris和分析纯氯化钠，Tris的价格昂贵，大大增加了精制成本，制约了大分子胶原蛋白的工业提取过程。
传统精制工艺中，盐析后需要低温冷冻离心的方法得到胶原蛋白沉淀，设备复杂，能耗高。
传统精制工艺中，透析过程采用两步法，先用稀酸溶液，再用蒸馏水的方法，大分子胶原蛋白透析的过程复杂，工艺操作难度高。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、可操作性强、成本低的大分子胶原蛋白的精制工艺。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其特征在于，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入0℃-30℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶5-50；或者直接取0℃-30℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入0℃-30℃、浓度为0.01-2.0mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到5-12，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在0℃-30℃静置2-48小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于0℃-30℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶5-50，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用0.05-10mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶5-50，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为醋酸、柠檬酸或盐酸溶液。
以上所述的大分子胶原蛋白的精制工艺中：
1、可以重复步骤(2)1-5次，得胶原蛋白悬浮层；
2、在步骤(1)中：向大分子胶原蛋白粗品中加的酸性溶液的温度优选为0℃-10℃；大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比优选为1∶5-20；或者直接取0℃-10℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料；
3、在步骤(1)中：向溶解液或酸性提取液中加入的NaOH溶液的温度优选为0℃-10℃、浓度优选为0.5-1.0mol/L，优选将其pH值调节到7-11。
4、在步骤(1)中：静置时优选将胶原蛋白溶液置于0℃-10℃中，静置时间优选为10-36小时；
5、在步骤(2)中：溶解胶原蛋白悬浮层的酸性溶液优选为0℃-10℃，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比优选为1∶5-20。
6、在步骤(3)中：溶解胶原蛋白悬浮层的醋酸溶液的浓度优选为0.1-5mol/L，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比优选为1∶5-20。
7、本发明工艺适用于对现有技术中所公开的任何一种酸法提取制得的大分子胶原蛋白粗品进行精制，也适用于对现有技术中公开的任何一种酸法提取制得的大分子胶原蛋白酸性提取液进行精制。
与现有技术相比，本发明工艺具有以下优点：
1、本发明精制工艺直接在酸性胶原蛋白溶液中加入NaOH溶液调酸度，从而节省了添加大量Tris、NaCl，使提取费用大大降低；
2、本发明精制工艺中省去了盐析后胶原蛋白的冷冻离心过程，简化了工艺过程，降低了能耗；
3、本发明精制工艺的透析工艺采用直接蒸馏水透析工艺，使透析费用和时间大大缩短；
4、本发明精制工艺的成本降低一倍以上，既降低了工艺的操作难度，又节约了生产成本，提取得到的胶原蛋白分子量不小于10万道尔顿，其纯度与传统精制工艺制得的胶原蛋白基本无异。
【附图说明】
图1为采用本发明方法制得的大分子胶原蛋白的电泳图，图中：
1：用Tris、NaCl传统方法盐析精制得到的胶原蛋白；
2：用本发明方法制到的胶原蛋白。
【具体实施方式】
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入0℃地酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶5；向溶解液中加入0℃、浓度为0.01mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到5，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在0℃静置2小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于0℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶5，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用0.05mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶5，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为醋酸溶液。
实施例2。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入30℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶50；向溶解液中加入30℃、浓度为2.0mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到12，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在30℃静置48小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于30℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶50，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用10mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶50，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为柠檬酸溶液。
实施例3。参照图1。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入4℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶20；或者直接取4℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入4℃、浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到7，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在4℃静置24小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于4℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶20，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用0.05-10mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶40，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为盐酸溶液。
采用SDS-PAGE电泳检测方法对上述方法制得大分子胶原蛋白进行检测，具体过程参考文献：Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structural proteinsduring assembly head of bacteriophage T4.Nature，277，680-685，同时对用Tris、NaCl传统方法盐析精制得到的胶原蛋白进行检测，结果参见图1。
从图1中可以看出，二者从电泳图上看，纯度差异不明显。
实施例4。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入10℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶10；或者直接取10℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入10℃、浓度为1.0mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到9，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在10℃静置12小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于10℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶10，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用2mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶10，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为醋酸溶液。
实施例5。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入8℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶12；或者直接取8℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入8℃、浓度为0.8mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到6，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在8℃静置5小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于8℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶30，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；再重复上述步骤1次，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用8mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶30，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为柠檬酸溶液。
实施例6。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入2℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶18；或者直接取6℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入6℃、浓度为1.5mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到11，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在6℃静置15小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于6℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶35，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；再重复上述步骤5次，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用1.5mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶16，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液盐酸溶液。
实施例7。一种大分子胶原蛋白的精制工艺，其步骤如下：
(1)向大分子胶原蛋白粗品中加入5℃的酸性溶液进行溶解，得溶解液，大分子胶原蛋白粗品与酸性溶液的重量体积比为1∶22；或者直接取5℃的大分子胶原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入5℃、浓度为1.2mol/L的NaOH溶液，将其pH值调节到10，得胶原蛋白溶液；将胶原蛋白溶液在5℃静置36小时后，取出胶原蛋白溶液上部凝聚的胶原蛋白悬浮层；
(2)将胶原蛋白悬浮层溶解于5℃的酸性溶液中，胶原蛋白悬浮层与酸性溶液的重量体积比为1∶45，然后按步骤(1)所述的方法调节pH值、静置，得胶原蛋白悬浮层；再重复上述步骤3次，得胶原蛋白悬浮层；
(3)取胶原蛋白悬浮层用3mol/L的醋酸溶液溶解，胶原蛋白悬浮层与醋酸溶液的重量体积比为1∶10，然后用蒸馏水直接透析，透析后将得到的胶原蛋白悬浮液冷冻干燥，得精制大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为柠檬酸溶液。