一种简单高效价廉的森林土壤样品DNA纯化方法 【技术领域】
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及到一种简单高效价廉的森林土壤样品总DNA纯化方法。
背景技术
微生物在森林土壤中起着重要的作用，但使用现有的技术仅能培养少量的微生物种群。生物学中使用的分子生物学技术为我们提供了研究微生物群落的新方法，然而从微生物群落样品中获取的DNA的纯度对后续分子操作过程却是至关重要的。许多研究报道了进行土壤微生物群落DNA的提取方法，如基于SDS的提取方法、基于玻璃珠击打的提取法、基于微波的提取方法，但这些方法所获取的DNA纯度不高，含有大量杂质(如腐殖酸、富里酸)，这些杂质会抑制酶的活性。因此，对于森林土壤，特别是对于腐殖酸含量丰富的土壤，DNA纯化步骤是必需的且非常重要的。一些可能有效的纯化方法采用如下处理：1、在预处理试剂或者试剂盒的试剂中再添加一些化学物质，或者增加一步凝胶电泳进行纯化；2、先用PEG进行DNA过夜沉淀，再过Sepharose 4B-polyvinyl-polypyrrolidone(PVPP)柱进行纯化；3、连续过两种不同的纯化柱(PVPP柱与琼脂糖凝胶柱)纯化，在两种纯化柱之间需要进行再次沉淀。这些纯化方法可能适合一些土壤DNA的纯化，然而这些方法要么比较复杂耗时，要么成本较高。
通过大量的研究，我们发明了一种简单高效价廉的土壤DNA纯化方法。该方法由两步纯化法组成。第一步纯化方法可以去除大部分杂质，同时又常常增加样品DNA的得率。通过初步纯化后的DNA，再经过另一常规、简单的纯化方法-硅胶柱来去除残留的少量杂质。整个纯化过程操作容易，可以在一个小时内完成，并且成本很低。
【发明内容】
本发明需要解决的问题是获得一种可以用于各种土壤类型的简单高效价廉的土壤微生物粗品总DNA的纯化方法。
本发明提供一种从森林土壤中纯化微生物DNA的方法，步骤包括：
(1)采用常规方法处理土壤的微生物，获得微生物的粗品DNA；
(2)用提取缓冲液溶解粗品DNA，使用移液器抽打几次后置于65℃水浴10分钟，再加入等体积氯仿-戊异醇溶液抽提，离心分层。上清液在室温下加入0.6倍体积的异丙醇，静置几分钟后离心，将DNA从液相中沉淀析出，弃上清液，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤，用100μL TE缓冲液溶解DNA沉淀；
(3)将初步纯化的DNA用硅胶柱进一步纯化。经初步纯化获得的DNA中加入3倍体积纯化缓冲液混合，几分钟后，过柱，使用洗液洗涤两次后，用100μL TE缓冲液洗脱即获得纯的DNA；
其中，所述的提取缓冲液包含100mM Tris-HCl、100mM sodium EDTA[pH 8.0]、100mM磷酸钠[pH 8.0]、1.5M NaCl、1％CTAB；
所述的纯化缓冲液主要成份是10％异硫氰酸胍，优选QIAquick Gel Extraction Kit的纯化缓冲液。
应当指出，本发明在于根据从土壤中提取的粗品DNA，提供进一步纯化DNA的方法。因此，提取粗品DNA的方法，可以采用常规的技术。在一个具体实施方案中，步骤(1)所述的提取DNA粗品的常规方法采用稍作修正的CTAB-SDS方法(Zhou et al.，1996.Applied and Environmental Microbiology，62：316-322)，包括：
(1)将土壤样品与2-3倍重量的DNA提取缓冲液和100μL蛋白酶K(10mg/mL)在离心管中混合、振荡均匀；
(2)加入1/10体积的20％的SDS，然后于65℃中水浴1-3小时，期间轻柔倒置均匀，而后离心；
(3)吸取上清，并加入与等体积的氯仿-戊异醇(24∶1(v/v))，混合抽提，离心分离上清液；
(4)每份样品在室温下加入0.6倍体积的异丙醇混匀，静置10分钟，离心；
(5)将沉淀使用预冷的70％乙醇或酒精洗涤，得到核酸粗品。
其中，步骤(4)中为了比较每一步的纯化结果可将上清液分成几个等份，每个等份3mL；步骤(5)中将各样品核酸沉淀溶解于100μL TE(Tris-HCl+EDTA)缓冲液中，其它几份未用TE溶解的粗品核酸用于后续纯化比较。
在另一个具体实施方案中，本发明所采用的土壤样品取自亚热带常绿阔叶林竹林表层土壤，优选中国杭州临安竹林0-10cm的表层土壤。
有益效果
本发明能够去除提取的土壤微生物DNA粗品中的绝大部分杂质，得到高纯度地DNA，可以直接用于对抑制物非常敏感的常规PCR；本发明操作简单，成本低，耗时少；适用范围广，可以用于其它已有土壤直接提取方法之后，纯化各种类型的土壤DNA。
【附图说明】
图1是来自五个样品提取DNA的凝胶电泳结果，其中1、2、3、4、5分别代表样品1、2、3、4、5，M表示λ-Hind III digest DNA Marker。A表示初始的粗品DNA；B表示步骤2纯化的DNA。
【具体实施方式】
具体实施实例如下：
实施例1：样品取样
本研究所使用的五个土壤样品均取自中国杭州临安竹林0-10cm的表层土壤，其中包括三个杂质含量高的样品(样2、4、5)与二个杂质含量低的样品(样1、3)，所有样品均取三个重复。
实施例2：初始DNA粗品的提取
步骤(1)：DNA粗品采用稍作修正的CTAB-SDS方法(Zhou et al.，1996.Applied andEnvironmental Microbiology，62：316-322)提取：5g土壤样品与13.5mL DNA提取缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM sodium EDTA[pH 8.0]，100mM磷酸钠[pH 8.0]，1.5MNaCl，1％CTAB)和100μL蛋白酶K(10mg/mL)在离心管中混合，然后在37℃下以225转/分钟的速度水平振荡30分钟。振荡完毕，加入1.5mL 20％的SDS，然后置于65℃的恒温水浴锅中2个小时，期间每15到20分钟轻轻地颠倒离心管，之后将样品在室温下6000转/分离心10分钟。取上清液转移到另一个新离心管中，加入与上清液等体积的氯仿-戊异醇(24∶1(v/v))混合抽提，离心分离上清液。为了比较每一步的纯化结果将上清液分成几个等份，每个等份3mL。每份样品在室温下加入0.6倍体积的异丙醇混匀，静置10分钟，室温16000转/分离心10分钟。弃上清液，沉淀使用预冷的70％酒精洗涤，得到核酸粗品。各样品核酸沉淀溶解于100μL TE(Tris-HCl+EDTA)缓冲液中，其它几份未用TE溶解的粗品核酸用于后续纯化比较。
实施例3：粗品DNA进一步提纯
步骤(2)：用2mL提取缓冲液溶解粗品核酸沉淀，用移液管吸放几次加速溶解，然后置于65℃水浴中10分钟，加入等体积的氯仿-戊异醇溶液(氯仿∶戊异醇＝24∶1)，16000转/分离心5分钟。取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温静置几分钟，然后在室温下以16000转/分的速度离心10分钟，弃上清液，用预冷的70％酒精或乙醇洗涤沉淀，干燥后得到DNA，用100μL TE缓冲液溶解。
步骤(3)：经步骤(2)回收到的DNA用硅胶柱进一步纯化。100μL的粗品DNA中加入3倍体积的QIAquick Gel Extraction Kit缓冲液，数分钟后，转移到回收柱，12000转/分离心30s；加入500μL洗液12000转/分离心30s；再次加入500μL洗液12000转/分离心30s；弃废液，12000转/分空离1min.用100μL TE缓冲液回收DNA，获得纯品。
实施例4：DNA产率与纯度的估算
回收DNA的纯度通过测定其在340nm处吸光值和A260/A280(Krsek and Wellington，1999.Journal of Microbiological Methods，39：1-16；Lakay，et al.，2007.Journal of AppliedMicrobiology，102：265-273)来评估。
取1.5μL各步骤提取的DNA直接用全波长紫外/可见光扫描分光光度计NanoDropND-1000Spectrophotometer V3.5.2(NanoDrop Technologies，Inc.USA)进行测定。回收DNA的产率利用在照片中琼脂糖凝胶带提取物的荧光强度分析确定(使用凝胶定量软件Quantity One v4.4.0.36)。
实施例5：聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应(PCR)被用于回收DNA的纯度检测(Zhou et al.，1996.Applied andEnvironmental Microbiology，62：316-322；Lakay，et al.，2007.Journal of AppliedMicrobiology，102：265-273)。
以真菌ITS3和ITS4区段为引物，扩增片段长度为500bp。PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液，2μL 25mM MgCl2，dNTPs 10mM 0.5μL，引物10mM各0.5μL，2UTaq聚合酶(Sangon，China)，模板DNA 0.5μL，最后用无菌水定容至25μL。依据Casey和Dobson(Casey and Dobson，2004.International Journal of Food Microbiology，91：327-335)设定扩增条件，6μL扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例6：结果与分析：
1步骤(2)纯化得到DNA的产率与纯度
步骤(2)纯化得到的回收DNA的片段大小与粗品DNA的大小基本相同，约23Kb(图1)，通过相对荧光强度估计得到的相对产率见表1。
其中，步骤(2)实验5个样品当中，除了样3失掉了18％，其余4个样品的回收DNA的产率明显比最初的方法提取的DNA高，其中样2的产率几乎高出了50％。
通过步骤(2)的提纯后，样品中82％～91％的腐殖酸被除去(表1)，尤其是样2、样4和样5。波长340纳米下的吸光值由22～26减小到2.7～4.6，颜色由深褐色持续变化到黄色。所有经步骤(2)纯化得到的DNA的A260/A280值都比粗品DNA的高，尤其是样品1(1.880)和样品3(1.863)，这表明样品1和样品3的DNA中存在的腐殖酸已经极少。
表1.粗品DNA进一步纯化步骤(2)之后DNA的产量与纯度
a杂质含量高的粗品DNA测量值超过分光光度计的测定范围
2步骤(3)纯化DNA的产率和纯度
与步骤(2)相比，所有经过步骤(3)的样的A340值明显降低(表2)。三个杂质含量高的样品(样品2、样品4和样品5)，大约有93％的腐殖质被除去，但两个低杂质样腐殖酸分别只除去83.6％和44.8％。当少骤(2)及步骤(3)先后纯化后，三个杂质含量高的样品(样品2、样品4和样品5)腐殖酸除去率达98.7％～99.3％，而另外两个低杂质样品的腐殖酸除去率分别达到98.1％和95.0％。经上述两步共同纯化后，所有DNA的A260/A280值在1.8到2.0之间。但硅胶柱提纯过程中，约50％的DNA被损失掉，这与试剂盒的柱子的DNA结合能力有关。
表2.粗品DNA经步骤(2)纯化及步骤(3)纯化之后DNA的产量与纯度
a与DNA纯化步骤(2)相比较所得到的腐殖酸去除率结果
b与初始粗品DNA纯化相比较所得到的腐殖酸去除率结果
3各步聚合酶链式反应扩增结果
各步骤聚合酶链式反应扩增结果参见表3，它与A260/A280的结果是非常一致的。当用5个初始粗品DNA作为模板时，没有DNA扩增。当5个粗品DNA单独用步骤(2)提纯后，其中两个样(样1和样3)能够观察到500bp的DNA片段。当经过步骤(2+3)二联合纯化后，所有模板都能很好地扩增。
表3.以各种纯化步骤所提纯的DNA为模板的PCR扩增结果
‘+’：琼脂糖凝胶中可观察到一个500bp的扩增带
‘-’：琼脂糖凝胶中观察不到500bp的扩增带