手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用 (一)技术领域
本发明涉及一种液相芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于分子生物学技术及临床检测技术领域。
(二)背景技术
手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)又名发疹性口腔炎，是由肠道病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征的一种急性常见传染病。儿童多发，3岁及3岁以下婴幼儿更容易得病。HFMD传染性强，传播途径复杂，传播快，在短时间内即可造成大流行。
引起HFMD的病原体主要为微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组的2、4、5、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CA16)与肠道病毒71型(EV71)。不同型别肠道病毒感染导致的HFMD病情也各不相同。与CA16和ECHO等肠道病毒相比，EV71型引起的HFMD重症感染的比例较大，可引起脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、疱疹性咽峡炎、神经源性肺水肿、肺出血、病毒性心肌炎等多种疾病。重症患儿病死率可达10％至25％。
目前HFMD实验室诊断常用方法为血清学中和实验，病原学细胞接种，分子生物学逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或real-time RT-PCR(rRT-PCR)等，这些方法一次只能检测一种病毒，在实际应用过程中对于病毒谱的检测既繁琐又需要相对大量的试剂和临床标本，检测费用高，因此如果能运用新的技术将这些病毒进行同时检测，将会对这一类疾病的诊疗提供极大的方便。目前日益成熟的生物芯片技术的高通量的特点可以实现多种病毒的一次性的联合检测。液相芯片技术是生物芯片的一种，它除了具有普通生物芯片(即固相芯片)高通量的特点外，还具有固相芯片不具有的高稳定性、高敏感性等优点，因此手足口病相关病毒平行检测液相芯片的研制和开发迎合了目前实验室和临床诊断的需要。
(三)发明内容
根据引发手足口病相关病毒多样化的特点，针对目前手足口病检测采用的ELISA、RT-PCR和real-time RT-PCR等方法一次只能检测一种病毒技术的不便、繁琐费时和实验室及临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用，不仅可以同时检测引发手足口病的多种病毒，而且检测迅速，准确，省时省力，有利于实现手足口病的早发现、早诊断和早治疗。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的手足口病相关病毒平行检测液相芯片，主要由微球，特异性探针，生物素化的通用引物，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是26、36和46号微球；所述特异性探针是针对EV71、CoxA16和Echo9病毒VP1区域的氨基化的特异性探针，通用引物是经活化的生物素标记的肠道病毒通用引物。
其中：所述EV71特异性探针与26号微球形成偶联体，CoxA16特异性探针与36号微球形成偶联体，Echo9特异性探针与46号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。
以红色激光激发球形基质上的红色分类荧光，依据球形基质的色彩不同确定类型；所述通用引物的生物素标记与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的手足口病相关病毒核酸的的含量。
本发明共确定了3种用于手足口病诊断的针对VP1区域的特异性的探针，并利用所述探针分别检测其相应的病毒核酸，分别是：EV71病毒核酸、CoxA16病毒核酸和Echo9病毒核酸。本发明所涉及的3种针对手足口病相关病毒VP1区域的特异性探针，是在大量临床应用的基础上，证实确与手足口病的发生有密切关系而选择的。
优选的，所述生物素化的通用引物是：经过活化生物素标记的针对肠道病毒的通用引物。
优选地，所述26、36和46号微球是经洗涤、活化的羧基微球。
生物素化的通用引物用于扩增手足口病相关病毒核酸，同时将扩增的RT-PCR产物标记上生物素，生物素标记可以将与液相芯片微球体结合的RT-PCR产物与检测荧光偶联，间接将结合的RT-PCR产物的浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对每种病毒的浓度进行定量测定。
本发明的设计思路是：选择针对手足口病相关病毒VP1区域的特异性探针，分别与不同色号的微球偶联，根据检测需要混合，初步制备出可对上述手足口病相关病毒进行一次性平行检测的液相芯片。在应用时，加入待检病毒核酸RT-PCR产物，目的PCR产物被微球上的特异性探针捕获，再加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，病毒核酸RT-PCR产物上的生物素与链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)结合，最后通过液相芯片检测系统，实现对上述手足口病相关病毒的一次性定性定量检测。
本发明所述手足口病相关病毒平行检测液相芯片的制备方法，其步骤是：
(1)特异性探针与微球偶联形成偶联体
分别选取26、36和46号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；以上述顺序分别对应地加入针对EV71、CoxA16和Echo9病毒VP1区域的特异性探针；加入EDC混匀；室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；得EV71特异性探针与26号微球形成偶联体，CoxA16特异性探针与36号微球形成偶联体，Echo9特异性探针与46号微球形成偶联体；计数单位体积每种微球偶联体的数，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合；
(2)手足口病液相芯片的制备
将标记有不同探针的球形基质即特异性探针与微球偶联的偶联体混合，初步得到本发明的手足口病相关病毒平行检测液相芯片。
(3)生物素化通用引物的选择
优选生物素化的通用引物是用于扩增手足口病相关病毒核酸。
通用引物的生物素标记，用于将链霉亲和素-藻红蛋白结合到微球上。
本发明所述手足口相关病毒平行检测液相芯片在制备实验室和临床检测试剂中的应用。
利用本发明的手足口病相关病毒平行检测液相芯片，可以实现对多种手足口病相关病毒的平行检测，即可同时检测3种肠道病毒，也可以根据实验室和临床需要选择性的测量其中的几种病毒，方便不同的疾病的实验室和临床检测需要。
本发明的方法由于将多种手足口病相关病毒的检测在一个反应体系中进行，不同的探针可以和不同的目的分子进行结合，反应后通过激光检测球形基质的色彩编号可以对不同的检测反应加以区分，既具有RT-PCR或real-time RT-PCR检测的定性或定量的特点，又具有高通量的优点，因而可更加省时省力，同时节约了检测成本。
(四)具体实施方式
实施例1：探针与已知编号的微球的偶联
1.分别选取26，36和46号羧基微球(Luminex公司)，用漩涡震荡器振荡微球悬液，时间20s，使微球混合均匀。
2.分别取上述各号羧基微球大约2×103个，分别转移到离心管中，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
3.移走上清，加入100μl dH2O，用漩涡震荡器振荡20s重悬微球，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
4.移走上清，加入80μl、100mM、pH＝6.2的磷酸二氢钠盐溶液，用漩涡震荡器振荡20s重悬洗涤的羧基微球。
5.加入10μl、50mg/ml的Sulfo-NHS(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。
6.加入10μl、50mg/ml的EDC(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。室温孵育20min，每隔10min用漩涡震荡器轻振一次。≥8000×g离心2min，沉淀活化的羧基微球。
7.移走上清，加入250μl、50mM、pH＝5.0的MES，漩涡震荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球。≥8000×g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球。
8.重复步骤7两次，用50mM、pH＝5.0的MES洗涤2次。
9.加入100μl、50mM、pH＝5.0的MES，用漩涡震荡器振荡20s。在混匀的微球中分别加入1nmol针对EV71、CoxA16和Echo9病毒VP1区域的特异性探针，用50mM、pH＝5.0的MES定容至500μl，用漩涡震荡器混匀。
10.在室温下放在摇床上(200rpm)孵育2h。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
11.移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30s。在室温下放在摇床(200rpm)上孵育30min。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
12.移走上清，加入1ml PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30s。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
13.重复步骤12一次，用PBS-TBN洗涤2次。
14.加入500μl PBS-TBN，重悬偶联好和洗涤好的微球，即得EV71特异性探针与26号微球形成偶联体，CoxA16特异性探针与36号微球形成偶联体，Echo9特异性探针与46号微球形成偶联体。
15.用细胞计数器计数微球的数量，换算出每种微球的浓度。
16.把偶联好的微球放在4℃避光保存，一般每种探针偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。
实施例2：本发明所述手足口病相关病毒平行检测液相芯片在临床检测中的应用
利用本发明所述手足口病相关病毒平行检测液相芯片检测手足口病相关病毒的技术流程：
1.病毒核酸的提取：可使用商业化的试剂盒提取RNA，如使用QIGEN ViralRNA mini Extraction Kit(CAT：52904)从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA；
(1)向一支1.5ml离心管中加入560μl的AVL缓冲液；
(2)再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物；
(3)室温下放置10min，然后瞬时离心；
(4)加入560μl无水乙醇，充分混匀至少15s，瞬时离心；
(5)小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中，将QIAamp柱套在收集管上，然后8000rpm离心5s，使液体通过滤膜；
(6)弃去收集管中的液体，重复第6步骤；
(7)弃去收集管中的液体小心加入750μl的AW1缓冲液，8000rpm离心5s，使液体通过滤膜；
(8)弃去收集管中的液体小心加入750μl的AW2缓冲液，8000rpm离心5s，使液体通过滤膜；
(9)弃去收集管中的液体，13000rpm再次离心1min；
(10)将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；
(11)向膜上加入30μl的EB缓冲液，然后室温下静置2-5min；
(12)在离心机中以8000rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。
2.RT-PCR扩增
(1)在冰面上融化病毒RNA样本和各种PCR试剂；
(2)配下列试剂主溶液：
2×RT-PCR Buffer………………………………………25.0μl
dNTPs(2.5mM each)……………………………………2.0μl
通用引物(正义、反义引物)………………………各1.0μl
RNA酶抑制剂……………………………………………0.5μl
TaqDNA聚合酶(5u/μl)……………………………0.5μl
AMV逆转录酶(10u/μl)……………………………1.0μl
模板RNA…………………………………………………3.0μl
RNase Free d H2O………………………………………16.0μl
50.0μl
(3)在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：
42℃………………………45min
94℃………………………2min
1个循环
94℃…………………………15s
58℃…………………………30s
72℃…………………………1min
35个循环
72℃…………………………5min
1个循环
所得RT-PCR产物置于4℃保存，待检。
3.液相芯片检测
(1)分别取出上述制备的针对每种病毒的偶联微球各500个，按等比例混合，分装在96孔板中，每一个孔中含有各种特异性探针的偶联微球各500个，加入待检RT-PCR产物2μl；
(2)52℃杂交30min；
(3)加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)100μl，混匀，52℃孵育30min；
(4)加入100μl PBS-TBN重悬微球，用于液相芯片进行检测；
(5)液相芯片检测中，红色荧光定义微球的种类，确定待测样品的病毒类型，即定性；绿色荧光测定微球结合的SA-PE的平均荧光强度，根据荧光值，确定病毒含量，即定量。