一种纳米分子生物传感器及制备方法和用途 【技术领域】
本发明属于分子生物学和分析生物技术领域，特别涉及一种纳米分子生物传感器，还涉及一种纳米分子生物传感器的制备方法，同时还涉及纳米分子生物传感器的用途。用于检测各种临床、环境样品中的目标分子。
背景技术
生物传感器是利用一定的生物或化学的固定技术，将生物识别元件(酶、抗体、抗原等)固定在换能元件上，当待测物与生物识别元件发生特异性反应后，通过换能元件将所产生的反应结果转变为可以输出、检测的电信号和光信号等，以此对待测物质进行定性和定量分析，从而达到检测分析的目的。就生物传感器目前发展的情况而言，主流仍就是电化学生物传感器，这类传感器是将一些具有生物特性的物质，如酶、抗原、抗体、核酸、细胞、组织等作为生物识别元件，而将各种各样的电极作为换能元件。其生物识别元件是通过共价键结合、LB膜、自组装膜、化学免疫、静电吸附结合、表面富集等方法与电极结合。此类传感器应用广泛，种类多样，但是也存在其自身的一些限制，如制备步骤繁琐(包括生物识别元件的获得、电极的修饰、生物识别元件与电极的结合等步骤)，由于识别元件与换能器空间分离，得到高检测灵敏度难度较大等。分子生物传感器一般将生物识别分子与具有换能功能的生物分子比如pH敏感荧光蛋白分子等直接连接在一起，可以通过蛋白质工程手段构建，或者化学方法制备，具有灵敏度高、制备简单、使用方便等优点。但是在一些需要更高灵敏度的检测领域，譬如环境中低浓度的农药残留，单细胞中的成份检测等方面，还有待进一步提高其灵敏度。
甲基对硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase，MPH)是一种主要以甲基对硫磷(parathionmethyl)为底物的酶。该酶能将甲基对硫磷水解成对硝基苯酚和二甲基硫代磷酸。甲基对硫磷俗称甲基1605，是有机磷农药中的一种，在世界范围内广泛应用于粮食、棉等经济作物的害虫防治。虽然甲基对硫磷的毒性只相当于对硫磷的1/3，但是仍然属于剧毒，具有内吸性，因此要严格按规定施药，并加强安全防护措施。但甲基对硫磷中毒的事件还是时有发生。尤其是其在农作物上的大量使用，对人体健康造成极大的危害。因此发展一种快速有效的有机磷农药检测方法具有十分重要的意义。
【发明内容】
本发明的目的是在于提供了一种纳米分子生物传感器，结构简单，使用方便，主要特点在于使用成线蛋白质将分子生物传感器自组装成纳米分子传感器，与未组装的分子生物传感器比较，极大地提高了检测灵敏度。
本发明的又一个目的是在于提供了一种纳米分子生物传感器的制备方法，利用蛋白质融合技术，将作为生物识别元件的特定酶分子和作为换能器元件的荧光蛋白融合在一起，得到一种同时具有识别和换能输出信号的功能蛋白。同时利用具有自组装功能的成纳米线蛋白与上述功能蛋白融合，使得上述功能蛋白又增加了自组装成纳米线的功能，使得输出信号得到进一步放大。这种在基因水平上的融合，简化了生物传感器的制备过程和成本，一旦在基因水平构建成功，每次制备只需将构建好的基因表达纯化即可获得此传感器。如果将此传感器用于检测，可提高检测灵敏度，并具有快速、成本低的优点。
本发明的再一个目的是在于提供了一种纳米分子生物传感器在对甲基对硫磷检测农药中的应用。该传感器比现有基于颜色反应的甲基对硫磷灵敏上万倍。
为达到上述目的，本发明采取了以下技术措施：
一种纳米分子生物传感器，如图1所示，它包括成线蛋白质(NANOP)1、荧光蛋白质(E2GFP)2、酶(E)3，其结构关系是：成线蛋白质(NANOP)1为骨架，成线蛋白质与其融合的荧光蛋白质(E2GFP)2和酶(E)3分布在骨架1的周围。该纳米分子生物传感器一般上荧光蛋白质(E2GFP)2与骨架1连接，酶3再与荧光蛋白质2连接，也可以通过改变融合蛋白质的顺序，使酶3与骨架1连接，荧光蛋白质2再与酶3连接。应用该传感器时，待检测的目标分子4先与酶3作用，生成产物5，同时释放H+或OH-离子，引起局域pH值变化，该变化会被荧光蛋白质(E2GFP)2感知，引起其荧光强度的变化。
该纳米生物分子传感器为一个成纳米线融合蛋白，它的融合蛋白质单体基因由一段核酸序列所编码，该纳米生物传感器并具有以下功能：1)具有自组装成纳米线功能，2)具有对pH值敏感的荧光蛋白的功能，3)具有作为其自身识别元件的酶的催化活性，该酶在其催化的反应过程具有pH值变化特征。制备该纳米分子生物传感器的步骤是：
1)设计一条短肽链的基因，将对所检测分子具有识别功能的酶分子基因(下文简称为e)与具有pH值敏感的荧光蛋白基因(e2gfp)连接在一起，保证该基因(e2gfp-l-e)表达的融合蛋白能正确折叠，保留其活性功能的完整性，并进一步与成线蛋白质基因(nanop)连接，得到纳米分子传感器地基因(nanop-e2gfp-l-e)。
2)将构建的纳米分子传感器基因(nanop-e2gfp-l-e)与合适的蛋白质表达载体连接，转入表达菌株中，表达纳米分子传感器单体蛋白质(NANOP-E2GFP-L-E)。
3)表达的纳米分子传感器单体蛋白质(NANOP-E2GFP-L-E)，经过分离纯化后，所得融合蛋白单体在合适的缓冲液和pH(pH 1-12)条件下进行自组装成纳米线，成为最终应用的纳米分子传感器。
本发明获得的纳米分子生物传感器在检测农药甲基对硫磷中的应用。其应用过程是：选用甲基对硫磷水解酶为该纳米分子生物传感器的识别元件，酵母蛋白质Sup351-61作为成线蛋白质，将该纳米分子生物传感器表达纯化得到后，与高纯水按1∶4混合得到检测反应液，取100μl此检测反应液到比色皿中，在荧光分光光度计选用激发波长488nm，读取523nm处的峰高值作为荧光强度初始值，依次分别加入1μl系列浓度梯度的甲基对硫磷样品(溶剂：甲醇)，反应后再次测523nm处的峰高作为荧光强度值。由此可以得到甲基对硫磷浓度与荧光强度减弱变化率的标准曲线。待测样品经前处理，也以上述方法检测，就能在标准曲线上找到相应的甲基对硫磷浓度值，继而达到检测甲基对硫磷的目的。
本发明应用与现有技术相比，具有以下优点：
1)生物传感器的识别元件和换能元件分别由两种有特定功能的蛋白质来充当。并运用蛋白质融合技术将两者有效的结合在一起，减化了生物传感器的制备步骤。只需一步表达纯化就能拿到所需生物传感器。
2)加入了自主装纳米线蛋白，一方面使得纳米线的组装与生物传感器的获得可以同步，无须另外步骤。另一方面纳米技术的引入大大提高了该生物传感器的灵敏度。
3)检测所需样品量少，检测灵敏度高。本发明的传感器检测可以在一个100μl液相体系中完成的，检测样品只需1μl即可。
【附图说明】
图1.一种纳米分子生物传感器的结构示意图
1-成线蛋白质(NANOP)2-荧光蛋白质(E2GFP)3-酶(E)4-检测分子5-检测分子与酶反应后产物。
图2.构建的融合蛋白Sup351-61-E2GFP-L-MPH的电子显微镜照片。照片显示该融合蛋白能够自主装成纳米线，且纳米线的形状清晰。
图3.本发明的纳米分子生物传感器荧光强度对应pH值的变化曲线。结果显示，纳米分子生物传感器荧光强度在pH6.0-8.0的范围内随pH值变化趋势明显。
图4.本发明的纳米分子生物传感器在检测系列浓度梯度的甲基对硫磷样品下得到的荧光强度减弱变化率的标准曲线与常规分子生物传感器的比较图。结果显示，在该纳米分子生物传感器(成线融合蛋白)的浓度为100μl/ml，反应体系磷酸盐缓冲液浓度为10nmol/l的条件下，对甲基对硫磷进行检测下限到1nmol/l，也就是0.2-0.3ng/ml。
【具体实施方式】
通过以下实施方案来具体说明本发明，而不对本发明做出限定。
一种纳米分子生物传感器，根据图1可所，纳米分子生物传感器它包括成线蛋白质(NANOP)1、荧光蛋白质(E2GFP)2、酶(E)3，其结构关系是：成线蛋白质(NANOP)1为骨架，成线蛋白质1与其融合的荧光蛋白质(E2GFP)2和酶(E)3分布在骨架1的周围。该纳米分子生物传感器一般上荧光蛋白质(E2GFP)2与骨架1连接，酶3再与荧光蛋白质2连接，也可以通过改变融合蛋白质的顺序，使酶3与骨架1连接，荧光蛋白质2再与酶3连接。应用该传感器时，待检测的目标分子4先与酶3作用，生成产物5，同时释放H+或OH-离子，引起局域pH值变化，该变化会被荧光蛋白质(E2GFP)2感知，引起其荧光强度的变化。
以甲基对硫磷水解酶检测农药甲基对硫磷为例，该纳米分子生物传感器的制备过程是：
1)本发明所用到的pH敏感荧光蛋白质E2GFP是在表达载体pEGFP-C1(购自BDBiosciences公司)中EGFP的基础上突变了两个位点得到，这两个位点为T203Y，L231H，结构基因长度为714bp。设计引物E2gfp-A：5’TCGCCCGGTGAGCAAGGGC 3’和E2gfp-D：5’AGTCCAAGCACAGCTCGTCCAT 3’将E2GFP基因通过PCR扩增得到，并使两端带上Nde I和HindIII酶切位点，并用相应的限制性内切酶酶切得到酶切片断。
2)MPH基因来源自Pseudomonas sp.WBC-3(申请人实验室筛选得到，具体参见专利：有机磷农药降解菌及其制备方法，ZL 01128319.X)，结构基因长度为896bp。MPH基因定位于Pseudomonas sp.WBC-3的大质粒上。通过碱裂解法得到质粒，以得到的质粒为模板，设计引物Mph-A：5’ACTCTGATATCGCCGCCAGCA 3’和Mph-D：5’TCCCAGCTGGATGGGGTTGAC 3’将MPH基因通过PCR扩增得到，并使两端带上EcoRV和Xho I酶切位点，并用相应的限制性内切酶酶切得到酶切片断。
3)设计两条核苷酸链：5’AGCTTAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGTGAT 3’和5’ATCACCGGAACCGCTACCGAACCAGAGCCGCTA3’将这两条核苷酸链在65℃下退火得到一条双链核苷酸，两端带有HindIII和EcoRV酶切位点。
4)用限制性内切酶Nde I和Xho I酶切质粒pET20b(+)(购自Novagen公司)，得到相应的内切酶酶切得到酶切片断。将上述片断通过连接酶连接在一起，连接条件为16℃，12小时。将连接产物转入E.coli DH5α(购自美国Merck公司)感受态中。转化子中获得的正确阳性克隆子即为DH5α/pET20b(+)-E2GFP-L-MPH菌株。
5)设计引物E2gfp-mph-A：5’GGAGCCGAATTGTACGTGAGCAAGGGC 3’和E2gfp-mph-D：5’TGGTGCTCGAGAGTGTTGGGGTTGACGA 3’通过PCR从以上得到的pET20b(+)-E2GFP-L-MPH质粒上扩增出两端带有EcoR I和Xho I酶切位点的E2GFP-L-MPH基因，并用相应的限制性内切酶酶切得到酶切片断。
6)所用到的Sup351-61基因来源自毕赤酵母的Sup35p基因，取其N区的前183bp。用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切pET28a-Sup351-61质粒(申请人实验室构建得到，具体构建见下面)，得到相应的内切酶酶切片断。通过连接酶将E2GFP-L-MPH的酶切片断和pET28a-Sup351-61(申请人实验室构建)酶切片断进行连接，连接条件同上述。将连接产物转入E.coli DH5α感受态中。转化子中获得的正确阳性克隆子即为含有质粒pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH的DH5α菌株。所述的pET-28-Sup351-61制备过程是：设计带有6×His-tag编码序列和Nco I酶切位点的上游引物和带有BamH I酶切位点的下游引物，从毕赤酵母的基因组里PCR扩增得到。PCR产物片段和pET-28(Merck)通过Nco I和BamHI双酶切后，连接在一起转入E.coli DH5α感受态中，得到含有pET-28-Sup351-61质粒的E.coli DH5α菌株，将该菌株培养后，既可通过提取菌液得到pET-28-Sup351-61质粒。
7)在37℃下，将DH5α/pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH接种到LB+卡那霉素培养基中过夜培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将该质粒pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH转化到表达菌株E.coli BL21(DE3)制得的感受态细胞中。
8)挑取BL21(DE3)(购自美国Merck公司)/pET28a-Sup351-61-E2GFP-L-MPH转化子到LB+卡那霉素培养基中，37℃培养过夜，将培养得到的菌液按1/100的量接入新鲜LB+卡那霉素培养基中，在37℃下进行扩大培养。当菌液OD到达0.5-0.8时，当加入IPTG(购自美国Merck公司)诱导目的融合蛋白进行表达。诱导表达温度25-30℃，诱导时间5-6小时。
9)通过离心(8000rpm，7min)收集菌体，将收集到的菌体重悬到磷酸盐缓冲液中，通过超声波进行破碎。在4℃条件下，将破碎过后的溶液高速离心(13000rpm，30min)，取上清，获得粗蛋白样品。
10)蛋白质的纯化采取Ni离子亲和层析，柱子用20mM咪唑，50mMNaH2PO4-Na2HPO4(pH8.0)的缓冲溶液平衡，上样后，用100mM咪唑，50mMNaH2PO4-Na2HPO4(pH8.0)将目的蛋白洗脱下来。由此得到具有Sup351-61-E2GFP-L-MPH基因编码的相对应的融合蛋白质单体。
11)融合蛋白蛋白质单体稀释到1-2mg/ml，与4℃下静止过夜，即可自组装成纳米线。所获得的纳米分子传感器在电镜观察下，显示该融合蛋白能够自主装成纳米线，且纳米线的形状清晰，如图2所示。
所构建的纳米分子生物传感器，包括成线蛋白质(Sup351-61)、荧光蛋白质(E2GFP)、酶(MPH)，其结构关系是：成线蛋白质(Sup351-61)为骨架，成线蛋白质1与其融合的荧光蛋白质(E2GFP)和酶(MPH)分布在骨架的周围。其中荧光蛋白质(E2GFP)与骨架连接，酶再与荧光蛋白质连接。也可以通过改变融合蛋白质的顺序，使酶与骨架连接，荧光蛋白质再与酶连接。
为检验本发明获得的纳米分子生物传感器对液相pH值的敏感范围，将此种纳米生物分子传感器与磷酸盐缓冲溶液配得的一系列pH值融合分别混合，各个混合液分别取100μl到比色皿中，在荧光分光光度计选用激发波长488nm，读取500-600nm处的峰面积值F(488，500-600)作为荧光强度，以所得到的不同pH值下的F(488，500-600)和不同pH值作曲线，可以得到不同pH值下纳米分子生物传感器荧光强度变化曲线。如图3所示。
本发明获得的纳米分子生物传感器用于检测农药甲基对硫磷的过程为：
1)将此种纳米生物分子传感器(成纳米线融合蛋白)与MiniQ水按1∶4混合得到检测反应液，纳米生物传器在检测反应液中的终浓度要保持在100-200μg/ml。取100μl检测反应液到比色皿中，在荧光分光光度计选用激发波长488nm，读取523nm处的峰高值作为荧光强度初始值，再将1μl一个特定浓度的甲基对硫磷样品加入到检测反应液中，反应2-3min后同样读取523nm处的峰高作为样品检测荧光强度值，荧光强度减弱率＝1-(荧光强度初始值-样品检测荧光强度值)/荧光强度初始值，如此按一定浓度梯度进行多个甲基对硫磷标准样品的检测，得到一系列荧光强度减弱率，以得到甲基对硫磷浓度-荧光强度减弱率的标准曲线。
2)待测样品通过有机溶剂萃取得到。同样取100μl检测反应液到比色皿中，在荧光分光光度计选用激发波长488nm，读取523nm处的峰高值作为荧光强度初始值。再加入1μl待测样品反应2-3分钟后，在荧光分光光度计中选用激发波长488nm，读取523nm处的峰高值作为样品检测荧光强度值。同步骤1)计算得到待测样品的荧光强度减弱率，即可在标准曲线上找到相应的甲基对硫磷浓度值，继而达到检测甲基对硫磷的目的。
为显示本发明的优点，申请人也构建了未融合成线蛋白质的普通分子传感器(E2GFP-L-MPH)，通过与未成线的常规分子生物传感器(E2GFP-L-MPH)的比较(图4)，可见本发明公开的纳米分子传感器具有更高的检测灵敏度，检测限比未成线的常规分子生物传感器低4个数量级。