一种增强型毕赤酵母AOX1启动子 【技术领域】
本发明涉及基因表达调控技术领域，更具体地，涉及真核基因表达调控技术领域，特别是指一种增强型毕赤酵母AOX1启动子。
背景技术
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年来使用非常广泛的一种酵母表达系统。在毕赤酵母中存在两个编码醇氧化酶的基因：AOX1和AOX2。在甲醇诱导的条件下，AOX1蛋白能占细胞总蛋白的30％，AOX1的mRNA占总mRNA的5％。因此，目前在毕赤酵母表达系统中，驱动外源基因表达的启动子一般采用AOX1启动子。为了提高外源基因在毕赤酵母中的表达，一般的做法是通过G418、Zeocin等选择压力提高外源基因在重组毕赤酵母染色体上整合的拷贝数。在相同拷贝数的情况下，极少有通过改变AOX1启动子的序列来提高外源基因表达的报道。2008年，Hartner等人通过构建启动子突变文库，在AOX1基因启动子上缺失‑771至‑712位碱基并形成两拷贝‑203至‑190位碱基序列时，报告基因GFP的表达量上升至160％(Nucleic Acids Res.36：e76)。
因此，本发明人尝试构建增强型毕赤酵母AOX1启动子，以期提高外源基因在毕赤酵母中的表达，从而提高表达效率。
【发明内容】
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种增强型毕赤酵母AOX1启动子，该增强型毕赤酵母AOX1启动子能使其后插入的外源基因在毕赤酵母中高效表达，从而提高了表达效率，适于表达载体的构建。
为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种增强型毕赤酵母AOX1启动子，其特点是，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子包括由2‑9个拷贝的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列串联的核苷酸片段和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述核苷酸片段连接在所述的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5’端。
较佳地，所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的拷贝数为3、2或9。
在本发明的第二方面，提供了一种增强型毕赤酵母AOX1启动子，其特点是，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性。
较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
较佳地，所述增强型毕赤酵母AOX1启动子为所述的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
本发明的有益效果如下：
1)本发明的一种增强型毕赤酵母AOX1启动子包括由2‑9个拷贝的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列串联的核苷酸片段和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述核苷酸片段连接在所述的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5’端，应用该启动子驱动外源基因表达时，和天然AOX1启动子相比，可使外源基因mRNA转录平均增加25％‑35％，使外源基因蛋白表达量平均增加45％‑60％，可使外源基因在毕赤酵母中表达更高效，适用于表达载体的构建；
2)本发明的另一种增强型毕赤酵母AOX1启动子与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性，采用该增强型毕赤酵母AOX1启动子驱动外源基因表达时，和天然AOX1启动子相比，可使外源基因mRNA转录平均增加15％～20％，使外源基因蛋白表达量平均增加25％～37％，可使外源基因在毕赤酵母中表达更高效，适用于表达载体的构建。
【附图说明】
图1是本发明的菌株R3表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。
图2是本发明的菌株R2表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。
图3是本发明的菌株R9表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。
图4是本发明的菌株M1表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。
图5是本发明的菌株M2表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。
图6是本发明的菌株M3表达GFP蛋白的柱形图，以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。
【具体实施方式】
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
下列实施例中的材料与方法为：
所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
所使用的工具酶均购自TaKaRa生物公司(大连，中国)，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。
下面的商品化质粒和大肠杆菌株用于基因克隆：
pPIC3.5K、大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115菌株购自Invitrogen公司。
实施例1三拷贝增强型AOX1启动子的构建及其效果
1、载体pP‑GFP的构建
GFP(绿色荧光蛋白)的ORF由714个碱基组成，设计合成了PCR引物GFP‑1和GFP‑2，以含有该GFP基因的毕赤酵母GS115‑KDR‑P的基因组为模板，使用高保真Pyrobest DNApolymerase进行扩增。PCR反应条件：初始变性94℃3min，变性94℃30s，退火46℃30s，延伸72℃1min，循环反应30次，最后延伸72℃7min。PCR反应扩增得到一个720bp的DNA片段。回收该PCR片段。
GFP‑1：5’‑ACCATGGGTTCTAAAGGTGAAGAAT‑3’
GFP‑2：5’‑TTTGTACAATTCATCCATACCATGG‑3’
用限制性内切酶SnaBI将pPIC3.5K线性化，用胶回收试剂盒进行回收。因为Pyrobest DNApolymerase的PCR产物为平末端DNA片段，所以将回收的GFP的PCR产物和回收的pPIC3.5K线性化载体直接。连接产物转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑选若干菌落，用5’AOX1通用引物和GFP‑2引物进行PCR鉴定，鉴定重组质粒中插入片段的大小和方向。鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑GFP。
2、突变载体pP‑ΔD的构建
以pPIC3.5K质粒上的AOX1启动子(GenBank accession nos.U96967)为模板，其是一段940bp的DNA序列，ΔD缺失‑638至‑‑511位碱基。在构建AOX1基因启动子缺失片段时，设计四条引物dD‑1，dD‑2，dD‑3和dD‑4，运用overlap PCR的方法。其中dD‑1和dD‑4位于整个缺失片段的上游和下游，dD‑2和dD‑3位于欲缺失的区域的上游和下游，并且有20bp的重叠区域，通过两轮的PCR构建出缺失片段。
dD‑1：5’‑CTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAA‑3’
dD‑2：5’‑CATATTAGAATAAACAAACATGAACCTC‑3’
dD‑3：5’‑TGTTTATTCTAATATGACAAAAGCGTGA‑3’
dD‑4：5’‑TAGACATGTAGGATCTTCGAATAATTAGTTGT‑3’
第一轮PCR以pPIC3.5K质粒DNA作为模板，用dD‑1和dD‑2两个引物作为上下游引物，扩增ΔD片段5′端的区域(ΔD‑up)；用dD‑3和dD‑4两个引物作为上下游引物，扩增ΔD片段3′端的区域(ΔD‑down)。
回收第一轮PCR的产物(ΔD‑up和ΔD‑down)，以回收的两个片段作为模板，先不加引物，进行5个循环，初始变性：94℃4min，变性：94℃30s，退火：50℃30s，延伸：72℃1.5min，5个循环后加入dD‑1和dD‑4引物，初始变性：94℃4min，变性：94℃30s，退火：50℃30s，延伸：72℃1.5min，30个循环。最终得到ΔD片段。
将载体pP‑GFP用限制性内切酶BamHI、ScaI进行双酶切，然后与用BamHI酶切的ΔD片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出来的菌落中挑取若干，用引物dD‑1和dD‑4进行菌落PCR鉴定，然后将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑ΔD。
3、pP‑AOX737‑ΔD+3D载体的构建
将AOX1启动子的前‑940位至‑737位的序列替换为三个拷贝串联的D区序列。
采用基因全合成的方法委托商业公司合成三个拷贝串联的D区序列，并在两端分别带上AatII和SacI酶切位点，整个序列共计396个碱基，经AatII和SacI对其进行双酶切后，回收400bp左右的片段与经过AatII和SacI双酶切的pP‑ΔD载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出的菌落中挑取若干个，用D1和D2引物进行菌落PCR验证，将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑AOX737‑ΔD+3D，该质粒中所得的AOX1启动子序列如SEQ ID NO：3所示。4、电转毕赤酵母和单拷贝重组菌株的筛选
将质粒pP‑AOX737‑ΔD+3D电转Pichia.pastoris GS115菌株，涂于4块MGY平板，放在30℃培养箱培养72‑96小时。将MGY平板上长出的单克隆挑至10ml YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，并保种。
采用realtime荧光定量PCR，以毕赤酵母看家基因GAP(glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase)为内参，筛选单拷贝重组菌株，取其中一个菌株经PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为R3。
5、三拷贝增强型AOX1启动子驱动的GFP mRNA转录和蛋白表达测定
将菌株R3进行摇瓶发酵，同时以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。以甲醇为诱导物，用流式细胞仪和荧光定量PCR的方法分别检测毕赤酵母菌株R3及对照菌株(control)的GFP表达量和转录水平的变化，结果如图1所示。结果显示，采用该改进的启动子比天然的AOX1启动子可使GFP的mRNA转录增加35％，使GFP蛋白表达增加57％。
实施例2二拷贝增强型AOX1启动子的构建及其效果
1、pP‑AOX737‑ΔD+2D载体的构建
采用基因全合成的方法合成两个拷贝串联的D区序列，并在两端分别带上AatII和SacI酶切位点，整个序列共计268个碱基，经AatII和SacI对其进行双酶切后，回收300bp左右的片段与经过AatII和SacI双酶切的实施例1所得的pP‑ΔD载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出的菌落中挑取若干个，用D1和D2引物进行菌落PCR验证，将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑AOX737‑ΔD+2D，该质粒中所得的AOX1启动子序列如SEQ ID NO：4所示。
2、电转毕赤酵母和单拷贝重组菌株的筛选
将质粒pP‑AOX737‑ΔD+2D电转Pichia.pastoris GS115菌株，涂于4块MGY平板，放在30℃培养箱培养72‑96小时。将MGY平板上长出的单克隆挑至10ml YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，并保种。
采用realtime荧光定量PCR，以毕赤酵母看家基因GAP(glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase)为内参，筛选单拷贝重组菌株，取其中一个菌株经PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为R2。
3、二拷贝增强型AOX1启动子驱动的GFP mRNA转录和蛋白表达测定
将菌株R2进行摇瓶发酵，同时以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。以甲醇为诱导物，用流式细胞仪和荧光定量PCR的方法分别检测毕赤酵母菌株R2及对照菌株(control)的GFP表达量和转录水平的变化，结果如图2所示。结果显示，采用该改进的启动子比天然的AOX1启动子可使GFP的mRNA转录增加25％，使GFP蛋白表达增加45％。
实施例3九拷贝增强型AOX1启动子的构建及其效果
1、pP‑AOX737‑ΔD+9D载体的构建
采用全基因合成的方法合成九个拷贝串联的D区序列，并在两端分别带上AatII和SacI酶切位点，整个序列共计1164个碱基，经AatII和SacI对其进行双酶切后，回收1200bp左右的片段与经过AatII和SacI双酶切的实施例1所得的pP‑ΔD载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出的菌落中挑取若干个，用D1和D2引物进行菌落PCR验证，将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑AOX737‑ΔD+9D，该质粒中所得的AOX1启动子序列如SEQ ID NO：5所示。
2、电转毕赤酵母和单拷贝重组菌株的筛选
将质粒pP‑AOX737‑ΔD+9D电转Pichia.pastoris GS115菌株，涂于4块MGY平板，放在30℃培养箱培养72‑96小时。将MGY平板上长出的单克隆挑至10ml YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，并保种。
采用realtime荧光定量PCR，以毕赤酵母看家基因GAP(glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase)为内参，筛选单拷贝重组菌株，取其中一个菌株经PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为R9。
3、九拷贝增强型AOX1启动子驱动的GFP mRNA转录和蛋白表达测定
将菌株R9进行摇瓶发酵，同时以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。以甲醇为诱导物，用流式细胞仪和荧光定量PCR的方法分别检测毕赤酵母菌株R9及对照菌株(control)的GFP表达量和转录水平的变化，结果如图3所示。结果显示，采用该改进的启动子比天然的AOX1启动子可使GFP的mRNA转录增加30％，使GFP蛋白表达增加49％。
实施例4与SEQ ID NO：3相比有10碱基不同的增强型AOX1启动子的构建及其效果
1、pP‑AOX737‑ΔD+3D‑Δ10载体的构建
采用全基因合成的方法合成SEQ ID NO：6中前384bp的碱基序列，并在两端分别带上AatII和SacI酶切位点，整个序列共计396个碱基，经AatII和SacI对其进行双酶切后，回收400bp左右的片段与经过AatII和SacI双酶切的实施例1所得的pP‑ΔD载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出的菌落中挑取若干个，用D1和D2引物进行菌落PCR验证，将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑AOX737‑ΔD+3D‑Δ10，该质粒中所得的AOX1启动子序列如SEQ IDNO：6所示。
2、电转毕赤酵母和单拷贝重组菌株的筛选
将质粒pP‑AOX737‑ΔD+3D‑Δ10电转Pichia.pastoris GS115菌株，涂于4块MGY平板，放在30℃培养箱培养72‑96小时。将MGY平板上长出的单克隆挑至10ml YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，并保种。
采用realtime荧光定量PCR，以毕赤酵母看家基因GAP(glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase)为内参，筛选单拷贝重组菌株，取其中一个菌株经PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为M1。
3、与SEQ ID NO：3相比有10碱基不同的增强型AOX1启动子驱动的GFP mRNA转录和蛋白表达测定
将菌株M1进行摇瓶发酵，同时以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。以甲醇为诱导物，用流式细胞仪和荧光定量PCR的方法分别检测毕赤酵母菌株M1及对照菌株(control)的GFP表达量和转录水平的变化，结果如图4所示。结果显示，采用该改进的启动子比天然的AOX1启动子可使GFP的mRNA转录增加15％，使GFP蛋白表达增加25％。
实施例5与SEQ ID NO：3相比多10碱基的增强型AOX1启动子的构建及其效果
1、pP‑AOX737‑ΔD+3D+10载体的构建
采用全基因合成的方法合成SEQ ID NO：7中前394bp的碱基序列，并在两端分别带上AatII和SacI酶切位点，整个序列共计406个碱基，经AatII和SacI对其进行双酶切后，回收410bp左右的片段与经过AatII和SacI双酶切的实施例1所得的pP‑ΔD载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出的菌落中挑取若干个，用D1和D2引物进行菌落PCR验证，将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑AOX737‑ΔD+3D+10，该质粒中所得的AOX1启动子序列如SEQ IDNO：7所示。
2、电转毕赤酵母和单拷贝重组菌株的筛选
将质粒pP‑AOX737‑ΔD+3D+10电转Pichia.pastoris GS115菌株，涂于4块MGY平板，放在30℃培养箱培养72‑96小时。将MGY平板上长出的单克隆挑至10ml YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，并保种。
采用realtime荧光定量PCR，以毕赤酵母看家基因GAP(glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase)为内参，筛选单拷贝重组菌株，取其中一个菌株经PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为M2。
3、与SEQ ID NO：3相比多10碱基的增强型AOX1启动子驱动的GFP mRNA转录和蛋白表达测定
将菌株M2进行摇瓶发酵，同时以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。以甲醇为诱导物，用流式细胞仪和荧光定量PCR的方法分别检测毕赤酵母菌株M2及对照菌株(control)的GFP表达量和转录水平的变化，结果如图5所示。结果显示，采用该改进的启动子比天然的AOX1启动子可使GFP的mRNA转录增加20％，使GFP蛋白表达增加37％。
实施例6与SEQ ID NO：3相比少10碱基的增强型AOX1启动子的构建及其效果
1、pP‑AOX737‑ΔD+3D‑10载体的构建
采用全基因合成的方法合成SEQ ID NO：8中前374bp的碱基序列，并在两端分别带上AatII和SacI酶切位点，整个序列共计386个碱基，经AatII和SacI对其进行双酶切后，回收390bp左右的片段与经过AatII和SacI双酶切的实施例1所得的pP‑ΔD载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态涂含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从长出的菌落中挑取若干个，用D1和D2引物进行菌落PCR验证，将鉴定正确的质粒经进一步测序确认后命名为pP‑AOX737‑ΔD+3D‑10，该质粒中所得的AOX1启动子序列如SEQ IDNO：8所示。
2、电转毕赤酵母和单拷贝重组菌株的筛选
将质粒pP‑AOX737‑ΔD+3D+10电转Pichia.pastoris GS115菌株，涂于4块MGY平板，放在30℃培养箱培养72‑96小时。将MGY平板上长出的单克隆挑至10ml YPD培养基中，30℃摇床培养过夜，并保种。
采用realtime荧光定量PCR，以毕赤酵母看家基因GAP(glyceraldehyde‑3‑phosphatedehydrogenase)为内参，筛选单拷贝重组菌株，取其中一个菌株经PCR检验及测序验证后正确的毕赤酵母菌株命名为M3。
3、与SEQ ID NO：3相比少10碱基的增强型AOX1启动子驱动的GFP mRNA转录和蛋白表达测定
将菌株M3进行摇瓶发酵，同时以含有天然AOX1启动子驱动的GFP毕赤酵母菌株作为对照。以甲醇为诱导物，用流式细胞仪和荧光定量PCR的方法分别检测毕赤酵母菌株M3及对照菌株(control)的GFP表达量和转录水平的变化，结果如图6所示。结果显示，采用该改进的启动子比天然的AOX1启动子可使GFP的mRNA转录增加18％，使GFP蛋白表达增加29％。
本发明通过将天然AOX1启动子缺失‑638至‑511的碱基序列，并在5’端‑940位至‑737位的序列替换为2至10个拷贝的缺失部分(即‑638至‑511的碱基序列)，优选地为三个拷贝，采用该增强型毕赤酵母AOX1启动子驱动外源基因表达时，和天然AOX1启动子相比，可使外源基因mRNA转录平均增加25％‑35％，使外源基因蛋白表达量平均增加45％‑60％。
本发明的另一种增强型毕赤酵母AOX1启动子与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性，采用该增强型毕赤酵母AOX1启动子驱动外源基因表达时，和天然AOX1启动子相比，可使外源基因mRNA转录平均增加15％～20％，使外源基因蛋白表达量平均增加25％～37％。
综上所述，本发明的增强型毕赤酵母AOX1启动子能使其后插入的外源基因在毕赤酵母中高效表达，从而提高了表达效率，适于表达载体的构建。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
【序列表】
<110>华东理工大学
<120>一种增强型毕赤酵母AOX1启动子
<160>14
<210>1
<211>128
<212>DNA
<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(128)
<223>天然毕赤酵母AOX1启动子的‑638至‑511的碱基序列
<400>1
tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatgagg gctttctgag 60
tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 120
cttggaac 128
<210>2
<211>609
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(609)
<223>天然毕赤酵母AOX1启动子缺失了‑638至‑511的碱基序列及‑940位至
‑737位的碱基序列
<400>2
gagctcgctc attccaattc cttctattag gctactaaca ccatgacttt attagcctgt 60
ctatcctggc ccccctggcg aggttcatgt ttgtttattc taatatgaca aaagcgtgat 120
ctcatccaag atgaactaag tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag 180
aaacttccaa aagtcgccat accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa 240
aataatctca ttaatgctta gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt 300
gccgaaacgc aaatggggaa acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg 360
tatgcttcca agattctggt gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt 420
aactgttcta acccctactt gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa 480
accttttttt ttatcatcat tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac 540
aagcttttga ttttaacgac ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta 600
ttcgaagga 609
<210>3
<211>993
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(993)
<223>增强型毕赤酵母AOX1启动子
<400>3
tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatgagg gctttctgag 60
tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 120
cttggaactc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 180
tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 240
aacgctgtct tggaactccg aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag 300
atgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg 360
acagtttaaa cgctgtcttg gaacgagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact 420
aacaccatga ctttattagc ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt 480
attctaatat gacaaaagcg tgatctcatc caagatgaac taagtttggt tcgttgaaat 540
gctaacggcc agttggtcaa aaagaaactt ccaaaagtcg ccataccgtt tgtcttgttt 600
ggtattgatt gacgaatgct caaaaataat ctcattaatg cttagcgcag tctctctatc 660
gcttctgaac cccggtgcac ctgtgccgaa acgcaaatgg ggaaacaccc gctttttgga 720
tgattatgca ttgtctccac attgtatgct tccaagattc tggtgggaat actgctgata 780
gcctaacgtt catgatcaaa atttaactgt tctaacccct acttgacagc aatatataaa 840
cagaaggaag ctgccctgtc ttaaaccttt ttttttatca tcattattag cttactttca 900
taattgcgac tggttccaat tgacaagctt ttgattttaa cgacttttaa cgacaacttg 960
agaagatcaa aaaacaacta attattcgaa gga 993
<210>4
<211>865
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(865)
<223>增强型毕赤酵母AOX1启动子
<400>4
tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatgagg gctttctgag 60
tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 120
cttggaactc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 180
tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 240
aacgctgtct tggaacgagc tcgctcattc caattccttc tattaggcta ctaacaccat 300
gactttatta gcctgtctat cctggccccc ctggcgaggt tcatgtttgt ttattctaat 360
atgacaaaag cgtgatctca tccaagatga actaagtttg gttcgttgaa atgctaacgg 420
ccagttggtc aaaaagaaac ttccaaaagt cgccataccg tttgtcttgt ttggtattga 480
ttgacgaatg ctcaaaaata atctcattaa tgcttagcgc agtctctcta tcgcttctga 540
accccggtgc acctgtgccg aaacgcaaat ggggaaacac ccgctttttg gatgattatg 600
cattgtctcc acattgtatg cttccaagat tctggtggga atactgctga tagcctaacg 660
ttcatgatca aaatttaact gttctaaccc ctacttgaca gcaatatata aacagaagga 720
agctgccctg tcttaaacct ttttttttat catcattatt agcttacttt cataattgcg 780
actggttcca attgacaagc ttttgatttt aacgactttt aacgacaact tgagaagatc 840
aaaaaacaac taattattcg aagga 865
<210>5
<211>1761
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1761)
<223>增强型毕赤酵母AOX1启动子
<400>5
tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaacatcact ccagatgagg gctttctgag 60
tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 120
cttggaactc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 180
tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 240
aacgctgtct tggaactccg aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag 300
atgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg 360
acagtttaaa cgctgtcttg gaactccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat 420
cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc 480
caaaactgac agtttaaacg ctgtcttgga actccgaatg caacaagctc cgcattacac 540
ccgaacatca ctccagatga gggctttctg agtgtggggt caaatagttt catgttcccc 600
aaatggccca aaactgacag tttaaacgct gtcttggaac tccgaatgca acaagctccg 660
cattacaccc gaacatcact ccagatgagg gctttctgag tgtggggtca aatagtttca 720
tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt cttggaactc cgaatgcaac 780
aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc tttctgagtg tggggtcaaa 840
tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta aacgctgtct tggaactccg 900
aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt tctgagtgtg 960
gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa cgctgtcttg 1020
gaactccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat gagggctttc 1080
tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc caaaactgac agtttaaacg 1140
ctgtcttgga acgagctcgc tcattccaat tccttctatt aggctactaa caccatgact 1200
ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat gtttgtttat tctaatatga 1260
caaaagcgtg atctcatcca agatgaacta agtttggttc gttgaaatgc taacggccag 1320
ttggtcaaaa agaaacttcc aaaagtcgcc ataccgtttg tcttgtttgg tattgattga 1380
cgaatgctca aaaataatct cattaatgct tagcgcagtc tctctatcgc ttctgaaccc 1440
cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc tttttggatg attatgcatt 1500
gtctccacat tgtatgcttc caagattctg gtgggaatac tgctgatagc ctaacgttca 1560
tgatcaaaat ttaactgttc taacccctac ttgacagcaa tatataaaca gaaggaagct 1620
gccctgtctt aaaccttttt ttttatcatc attattagct tactttcata attgcgactg 1680
gttccaattg acaagctttt gattttaacg acttttaacg acaacttgag aagatcaaaa 1740
aacaactaat tattcgaagg a 1761
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<211>993
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(993)
<223>增强型毕赤酵母AOX1启动子
<400>6
tccgaatgca acaagctccg catatatacc gaacatcact ccagatgacc atattctgag 60
tgtggggtca aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 120
cttggaactc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgaccat 180
attctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 240
aacgctgtct tggaactccg aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag 300
atgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg 360
acagtttaaa cgctgtcttg gaacgagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact 420
aacaccatga ctttattagc ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt 480
attctaatat gacaaaagcg tgatctcatc caagatgaac taagtttggt tcgttgaaat 540
gctaacggcc agttggtcaa aaagaaactt ccaaaagtcg ccataccgtt tgtcttgttt 600
ggtattgatt gacgaatgct caaaaataat ctcattaatg cttagcgcag tctctctatc 660
gcttctgaac cccggtgcac ctgtgccgaa acgcaaatgg ggaaacaccc gctttttgga 720
tgattatgca ttgtctccac attgtatgct tccaagattc tggtgggaat actgctgata 780
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<211>1003
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1003)
<223>增强型毕赤酵母AOX1启动子
<400>7
tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaaatctaca tcactccaga tgagggcttt 60
ctgagtgtgg ggtcaaatag tttcatgttc cccaaatggc ccaaaactga cagtttaaac 120
gctgtcttgg aactccgaat gcaacaagct ccgcattaca cccgaaatct acatcactcc 180
agatgagggc tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac 240
tgacagttta aacgctgtct tggaactccg aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac 300
atcactccag atgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg 360
cccaaaactg acagtttaaa cgctgtcttg gaacgagctc gctcattcca attccttcta 420
ttaggctact aacaccatga ctttattagc ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc 480
atgtttgttt attctaatat gacaaaagcg tgatctcatc caagatgaac taagtttggt 540
tcgttgaaat gctaacggcc agttggtcaa aaagaaactt ccaaaagtcg ccataccgtt 600
tgtcttgttt ggtattgatt gacgaatgct caaaaataat ctcattaatg cttagcgcag 660
tctctctatc gcttctgaac cccggtgcac ctgtgccgaa acgcaaatgg ggaaacaccc 720
gctttttgga tgattatgca ttgtctccac attgtatgct tccaagattc tggtgggaat 780
actgctgata gcctaacgtt catgatcaaa atttaactgt tctaacccct acttgacagc 840
aatatataaa cagaaggaag ctgccctgtc ttaaaccttt ttttttatca tcattattag 900
cttactttca taattgcgac tggttccaat tgacaagctt ttgattttaa cgacttttaa 960
cgacaacttg agaagatcaa aaaacaacta attattcgaa gga 1003
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<211>983
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(98+3)
<223>增强型毕赤酵母AOX1启动子
<400>8
tccgaatgca acaagctccg cattacaccc gaagatgagg gctttctgag tgtggggtca 60
aatagtttca tgttccccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt cttggaactc 120
cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc tttctgagtg 180
tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta aacgctgtct 240
tggaactccg aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt 300
tctgagtgtg gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa 360
cgctgtcttg gaacgagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact aacaccatga 420
ctttattagc ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt attctaatat 480
gacaaaagcg tgatctcatc caagatgaac taagtttggt tcgttgaaat gctaacggcc 540
agttggtcaa aaagaaactt ccaaaagtcg ccataccgtt tgtcttgttt ggtattgatt 600
gacgaatgct caaaaataat ctcattaatg cttagcgcag tctctctatc gcttctgaac 660
cccggtgcac ctgtgccgaa acgcaaatgg ggaaacaccc gctttttgga tgattatgca 720
ttgtctccac attgtatgct tccaagattc tggtgggaat actgctgata gcctaacgtt 780
catgatcaaa atttaactgt tctaacccct acttgacagc aatatataaa cagaaggaag 840
ctgccctgtc ttaaaccttt ttttttatca tcattattag cttactttca taattgcgac 900
tggttccaat tgacaagctt ttgattttaa cgacttttaa cgacaacttg agaagatcaa 960
aaaacaacta attattcgaa gga 983
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<220>
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<222>(1)...(25)
<223>根据绿色荧光蛋白基因序列设计的上游引物GFP‑1
<400>9
accatgggtt ctaaaggtga agaat 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(25)
<223>根据绿色荧光蛋白基因序列设计的下游引物GFP‑2
<400>10
tttgtacaat tcatccatac catgg 25
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(25)
<223>根据pPIC3.5K质粒上的AOX1启动子设计的上游引物dD‑1
<400>11
ctgtgactgg tgagtactca accaa 25
<210>12
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<212>DNA
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(28)
<223>根据pPIC3.5K质粒上的AOX1启动子设计的下游引物dD‑2
<400>12
catattagaa taaacaaaca tgaacctc 28
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(28)
<223>根据pPIC3.5K质粒上的AOX1启动子设计的上游引物dD‑3
<400>13
tgtttattct aatatgacaa aagcgtga 28
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(32)
<223>根据pPIC3.5K质粒上的AOX1启动子设计的下游引物dD‑4
<400>14
tagacatgta ggatcttcga ataattagtt gt 32