一种丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)基因的分析及应用 【技术领域】
本发明属于药用植物基因工程领域，具体地说，涉及利用cDNA芯片技术克隆一种新的丹参异戊烯焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI)基因，转化该基因以提高丹参中二萜类次生代谢产物含量的方法。
背景技术
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将破解药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。
萜类(terpene)是植物界广泛存在的一类天然烃类化合物，具有异戊二烯(isoprene)单元组成的基本骨架，根据所含异戊二烯数目的不同，萜类可分为单萜、倍半萜、二萜、三萜等。许多二萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，药用植物中很多活性成分如紫杉醇、丹参酮II A、雷公藤甲、乙素等均为二萜类化合物。药用植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为一味常用中药，素有“一味丹参，功同四物”的美称，具有活血化瘀，理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成分。丹参中主要含有两类活性成分：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。
萜类化合物生物合成途径亦称为类异戊二烯生物合成途径(isoprenoid biosynthesispathway)，由甲羟戊酸途径(MVA)和丙酮酸、磷酸甘油醛途径(MEP)组成。MVA途径存在于细胞质和线粒体，主要为甾醇、特定的倍半萜和泛醌等提供前体物质；MEP途径位于质体，主要为半萜、单萜、二萜和多萜等提供前体物质。IPPI正是处于MVA和MEP途径的交汇位置，其功能是催化异戊烯焦磷酸酯(IPP)和甲基丙稀基焦磷酸酯(DMAPP)之间的同分异构化。随后，IPP和DMAPP之间，以及IPP和DMAPP缩合产生的中间产物间，可以发生多次聚合反应，最终合成出各种各样的类异戊二烯类物质。
异戊烯焦磷酸异构酶基因的表达水平直接影响萜类合成五碳前体库的代谢流流向，是下游代谢途径的总开关(2000)。Kajiwara认为(1997)，植物体内的异戊烯焦磷酸异构酶可能是一关键性的限速酶，他们将酵母(pharfi arhosozyma)和雨生红球藻中分离的IPPI cDNA转入大肠杆菌菌株JM101后番茄红素产量增加3.6-4.5倍。Sun等(1998)在单细胞绿藻中导入外源IPPI基因，导致细胞中类胡萝卜素大量累积，并且含量与IPPI基因的表达量正相关。因此，IPPI基因在萜类物质生物合成中是一个重要的调节因子，它的超量表达，利于代谢流向下游流动，将促进下游相关产物的生物合成。
植物中的IPPI，最早是1996年Blanc，V.M.等在伯惠绣衣(Clarkia breweri)中克隆到，而真正有功能的IPPI是1998年Campbell等在拟南芥中克隆到的。随后在很多物种中都克隆到IPPI基因，如橡胶树(Hevea brasiliensis)，烟草(Nicotiana tabacum)，玉米(Zea mays)等。本发明首次从药用植物丹参中克隆到了丹参Sm IPPI基因片段，采用RACE技术克隆得到其cDNA的全长序列，并对其进行功能鉴定及转基因操作。本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参异戊烯基转移酶基因及其氨基酸序列。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种丹参cDNA芯片的制作、杂交、差异基因分析以及功能基因克隆的方法，并提供一种过表达IPPI基因以提高丹参中萜类成分含量的方法。本发明涉及的丹参cDNA芯片克隆关键酶基因、IPTG诱导大肠杆菌原核表达、载体构建、遗传转化、分子检测、丹参酮类成分提取及含量测定方法用于本发明，为利用转基因丹参大规模生产有效成分奠定了坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明应用cDNA基因芯片方法从丹参中克隆IPPI基因，检测茉莉酸甲酯处理后SmIPPI基因的表达情况及丹参酮II A含量的变化情况；构建含所述DNA分子的大肠杆菌原核表达载体，IPTG诱导原核表达；构建含所述DNA分子的植物过表达载体，用根癌农杆菌介导，将IPPI基因导入丹参并再生出植株；PCR检测外源目的基因IPPI的整合情况，HPLC测定丹参中二萜类成分含量，筛选获得二萜类成分含量显著提高的转基因丹参植株。
本发明包括如下具体步骤：
(1)采用cDNA芯片方法获得丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)基因；
(2)将SEQID No.1基因的cDNA克隆到原核表达载体pET32a的限制性内切酶HindIII和BamH I位点间，得到表达载体，利用CaCl2等方法得到含有该表达载体的大肠杆菌菌株。
(3)转入E.coli BL21(DE3)表达宿主菌采用IPTG诱导表达，表达产物经初步纯化后，加入到以IPP或DMAPP为底物的体外酶促反应体系中，取上层乙醚抽提物GC-MS检测反应产物。结果表明，此异构酶能够以IPP为底物催化形成DMAPP，也能够以DMAPP为底物催化形成IPP。从峰面积结果看，此异构酶利用底物的效率不同，更倾向于以IPP为底物向DMAPP方向进行。
(4)构建含IPPI基因的植物过表达载体，转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含IPPI基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
(5)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，获得经PCR检测的转基因丹参植株；
(6)对获得的转基因丹参中萜类成分含量进行HPLC测定，筛选获得丹参酮、隐丹参酮、丹参酮II A等二萜类成分含量显著提高地转基因丹参植株。
结果表明，在过表达SmIPPI基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高：1.4、3.6、2.5、3倍，初步证明SmIPPI基因在丹参次生代谢产物生成过程中具有重要作用。这一结果对于培育高品质的药用植物品种特别是丹参具有重要的理论及实际意义。
本发明所提供的丹参异戊烯基焦磷酸异构酶(SmIPPI)首次从丹参中克隆制备，填补了从我国药物植物丹参异戊烯基焦磷酸异构酶基因的空白。利用本发明可以通过基因工程技术来提高丹参等植物中萜类活性成分丹参酮类物质的含量。转基因结果显示，丹参异戊烯基焦磷酸异构酶基因可通过转基因技术用于提高丹参酮等成分含量的研究和产业化，尤其可用于中药材丹参的品质改良，能缓解丹参酮类药源严重匾乏问题，对提高丹参酮类物质产量具有较好的促进作用，具有很好的应用前景。
【具体实施方式】
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、丹参cDNA芯片的制作
1、丹参总RNA的分离和检测
取陕西商洛丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge)根2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L-1，EDTA 25m mol·L-1，NaCl 2.0mol·L-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L-1，EDTA 1mmol·L-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。
2、cDNA文库的构建
采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司)分离mRNA后，通过在cDNA分子两端加上EcoR I/Not I接头，在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化，与表达载体λZAP Express Predigested Vector(ZAP Express Predigested VectorKit，stratagene公司)连接，然后采用stratagene公司的ZAP Express Pridigested Gigapack CloningKits(EcoRI/CIAP-Treated)将包装蛋白在体外包装连接产物，感染E.coli XL1-Blue MRF’构建成cDNA文库。
3、cDNA芯片的制备
3.1PCR扩增
挑取分离良好的噬菌斑溶于100μL SM缓冲液(Amresco公司)中混匀后作为PCR模板。PCR扩增引物为λZAP Express多克隆位点两侧的部分序列：M13-20引物：5′-GTAAAACGACGGCCAGTG-3′，BK反向引物：5′-GGAAACAGCTATGACCTTG-3′。96孔板PCR反应体系，准备如下混合物：dNTP(25mmol·L-1)，600μL；Mg2+600μL，10×缓冲液1000μL；Taq(Takara Ex Taq，5U·μL-1)，40μL；M13-20引物(12.5μmol·L-1)，200μL；BK反向引物(12.5μmol·L-1)200μL；高纯水补足至10mL。混合均匀后，用排枪分装至96孔PCR板。然后各加入6μL DNA模板，混合均匀。在ABI9700型基因扩增仪上进行PCR反应，反应条件为94℃预变性3分钟，然后进行35个循环，为94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 2分钟，循环结束后72℃后延伸5分钟。取3μL反应产物在含EB的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照。
3.2PCR产物纯化
使用96孔Multiscreen filter plates(Millipore公司)纯化板进行PCR产物的纯化。将1.4.1项下琼脂糖凝胶检测为单一条带的PCR产物(100μL)转入纯化板中；将纯化板放于Millipore的真空装置上，于15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；加入100μL水，15mmHg真空抽滤10分钟，直至抽干；从真空抽滤装置上取下PCR纯化板，加入40μL(pH8.0左右)的水，将纯化板放至摇床上轻摇20～30分钟重悬DNA；将纯化产物吸出，置于酶标板上测定浓度和纯度；取1μL纯化产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测；将纯化产物真空干燥。
3.3cDNA芯片点制
根据上述测定的浓度差异加入适量50％DMSO作为点样液，调节浓度至约250ng·μL-1后，将样品转移至384孔板中准备芯片点制。点样仪为GeneMachine公司OmniGrid 100。点样参数为：针：2×12，X：8000，Y：6000；点间距：300microns；点阵：13×14；点阵间距：500microns；矩阵模式：4×12。
实施例2、丹参异戊烯焦磷酸异构酶基因的克隆
1、实验材料的准备
丹参毛状根为发根农杆菌15834直接感染的方式进行Ri-质粒转化诱导的毛状根。取6，7-V固体培养基(不含激素)暗藏保存的丹参毛状根，在无菌条件下将2g湿根接种于装有200ml无激素的6-7V液体培养基的500mL三角瓶中进行继代培养，培养至18d后作为试验材料。培养条件为25℃，110～120r·min-1，黑暗条件下培养。
2、诱导子的制备和处理
酵母提取物(yeast extract，YE)生物诱导子的制备：取25g酵母提取物溶于125mL蒸馏水中，加入100mL无水乙醇，置于4℃冰箱静置4d，倾去上清液，胶状沉淀溶于125mL蒸馏水中，加入无水乙醇(乙醇含量达80％)二次沉淀，离心，沉淀溶于100mL蒸馏水中，120℃灭菌20min，冷却后置于4℃冰箱备用。
银离子(Ag+)的制备：取AgNO35.096g溶于100mL蒸馏水中，制备得3mmol·L-1的Ag+。
诱导子处理：向培养18d的丹参毛状根培养基中分别加入诱导子组合YE+Ag+(YE 2ml、Ag+66.7ul)进行诱导处理，每个处理3个重复，分别于YE+Ag+处理后不同时期收获，用吸水纸吸干，各样本称取约2g鲜重于液氮速冻后-70℃保存(提取总RNA)或40℃干燥至恒重，精密称量毛状根的干重用于测定毛状根中丹参酮IIA的含量。
3、诱导子处理后丹参酮II A的含量变化
采用高效液相色谱法测定诱导子处理后丹参酮II A的含量。取干燥至恒重的丹参毛状根适量，研碎过40目筛，混匀。取药材细粉约0.2g，精密称量，置20mL容量瓶中，加甲醇溶液4mL，精密称重，超声处理40min，取出放冷，加甲醇溶液补足至原重，摇匀，静置，过0.45μm微孔滤膜即得。色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，RP-Waters C18柱(150mm×3.9mm，5μm)，检测波长：270nm；柱温：30℃，流速1.0m·min-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。经过诱导子处理后，丹参酮IIA含量迅速上升，处理后第48h，丹参酮IIAYE+Ag+处理组是对照组的2.1倍，处理后第6d处理组是对照组的5.4倍，处理后第9d，处理组是对照组的6.9倍。结果表明丹参毛状根经诱导子处理之后，丹参酮类成分在短时间内迅速积累。
4、芯片杂交分析
根据上述诱导子处理后丹参酮II A的变化情况，选用YE+Ag+处理后48h的毛状根及对照组作为芯片杂交样品，以对照组(C)为参照，与YE+Ag+(YA)的材料进行杂交，重复两次，每组均采用正反标记以消除染料的误差。
采用间接标记法进行探针标记，包括双链cDNA合成、T7介导的RNA体外转录合成cRNA、随机引物反转录、cDNA用KLENOW酶标记等步骤。
(1)双链cDNA合成：取5g总RNA，以T7-Oligo(dT)15，(5′-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′，V可以是G、C和A，上海博亚生物技术有限公司)为引物，用cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)合成双链cDNA；双链合成以后用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。
(2)体外转录合成cRNA：用T7RiboMAX Express Large Scale RNA Production System(Promega公司)将双链cDNA进行体外转录合成cRNA；然后用RNeasy试剂盒(Qiagen公司)纯化。
(3)随机引物反转录：取2g cRNA，用SuperscriptII反转录酶，200U·μL-1(Invitrogen公司)，9Random Primer进行反转录，反转录产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化。
(4)cDNA用KLENOW酶标记：取1g cRNA反转录产物，用随机引物进行KLENOW标记，标记产物用QIAquick PCR PurifiCation Kit(Qiagen公司)纯化，纯化后抽干。标记过程中dATP，dGTP，dTTP使用浓度为120M，dCTP使用浓度为60M，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP使用浓度为40M。
将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30L杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。将不同样品分别用cy3、cy5(Amersham公司)进行标记，然后溶于30L杂交液中(3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5分钟，而后在0.2×SSC中室温洗5分钟，玻片甩干后进行扫描。芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(Axon Instruments公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后用Ttest方法结合两倍差异的标准来确定差异表达基因。
5、差异基因的获得和分析
将每组芯片两次重复的共同差异基因进行5’单向测序，获得的EST序列采用Windows系统下的Staden Pachage(gap4)(http://staden.sourceforge.net)软件进行序列前处理以及拼接聚类。去掉载体、接头以及低质量序列和较短的序列。使用BLASTX(6December 2005：BLAST2.2.13 released；http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)将处理后的EST序列在蛋白质水平上与NCBI非冗余蛋白质数据库(non-redundantproteindatabase)进行同源性比较，结果克隆号为chip18f03的基因在YA/C天杂交结果中表现为上调基因，BlASTX注释为(isopentenyldiphosphate isomerase，IPPI)基因，命名为丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)基因。
6、cDNA末端快速扩增(5′-RACE和3′-RACE)
采用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)试剂盒进行扩增SmIPPI的5′末端和3′末端的扩增，按照说明书进行操作。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。以设计的GSP1(5`-CAATTCACAAGCTGACTTAGCC-3`)为5′RACE特异引物，进行cDNA 5′末端的扩增。PCR条件为94℃ 5min，94℃ 30s、68℃ 30s、72℃2min(35个循环)，72℃ 7min。扩增得到长约1000bp的特异性cDNA片段。根据SmIPPI基因片段设计的3′RACE特异引物为：GSP2(5′-GGATGATTACTTGTCTGCCTCCTGGG-3′)，以GSP2为扩增引物，进行SmIPPI cDNA 3′末端的扩增。PCR条件为94℃ 5min，94℃ 30s、68℃ 30s、72℃ 1.5min(35个循环)，72℃ 7min。扩增出约400bp的DNA片段。琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara公司)回收目的片段，按pMD19T载体(Takara公司)试剂盒操作手册将上述片段克隆至pMD19-T载体中，鉴定阳性克隆并测序(北京三博远志生物有限公司)。
通过cDNA杂交所得EST序列和5’-RACE获得的部分片段测序结果可得到序列表SEQID NO：1所示的丹参IPPI基因全长cDNA序列，其所推导的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
7、全长cDNA的克隆和测序
根据5`RACE和3`RACE所得到的结果和芯片杂交获得的Unigene序列，从两端设计得到钩取SmIPPI全长cDNA的引物，IPPI-F：5`-GGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA-3`；IPPI-R：5`-GCGGTGAATGAAGCGGCGAAACGGAGGC-3`；再以5`-RACE-Ready cDNA为模板，进行LA-PCR。琼脂糖凝胶电泳表明约在1300bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目的片段，按上述方法克隆至pMD19-T载体中(Takara)，鉴定阳性克隆并进行双向测序(北京三博远志生物有限公司)，用于原核表达载体的构建。
实施例3、SmIPPI基因的生物信息学分析
本发明涉及的丹参异戊烯焦磷酸异构酶基因全长cDNA的长度为1320bp，编码序列表中由305个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQ ID No.2。
详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于127～1044bp。将丹参全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，结果表明丹参SmIPPI与IPPI同源性介于70.4％(葛根，AAQ84167)至99.1％(烟草，BAB40974)之间，具有高度的同源性，丹参SmIPPI与杠柳(BAC65421)，胡黄连(ABO14800)的IPPI同源性也较高，分别为89.8％和88.9％。在IPPI基因有多处氨基酸序列保守区，均可作为同源PCR克隆的引物设计位点。
实施例4、茉莉酸甲酯处理后Sm IPPI基因表达与丹参酮IIA含量的分析
利用茉莉酸甲酯(100mM)处理丹参毛状根，收集不同时间点的材料用于丹参IPPI基因表达量和丹参酮IIA的含量。IPPI基因表达量采用荧光实时定量PCR。总RNA用Trizol(Invitrogene公司)试剂盒提取，步骤详见试剂盒操作手册。取1μg RNA模板按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。Real-time定量PCR采用ABI Prism 7000SequenceDetection System(Applied Biosystems，USA)和SYBGREEN PCR Master Mix(AppliedBiosystems，UK)试剂盒，以丹参actin基因(GenBank登录号DQ243702)(引物序列actin-222：5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’，actin-488：5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’)作为对照，确证不同时间都符合要求而且cDNA的量都相差不多。IPPI基因引物为：Sm IPPI正向F5′-3′：GCGGTGAATGAAGCGGCGAAACGGAGGC，反向5′-3′：TAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG。按94℃ for 5min，(94℃ for 30sec，55℃ for30sec and 72℃ for 2min)36cycles，72℃7min的PCR条件进行扩增。结果表明：经过MJ处理后，Sm IPPI基因表达水平于24h内迅速升高，之后逐渐降低到对照组水平。经actin内参基因均一化之后，与对照组比较，处理后24h，MJ处理组是同时期对照组的2.1倍，说明丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，Sm IPPI基因表达水平内迅速升高，从而有利于提高Sm IPPI活性，推动代谢流向目的产物丹参酮类成分流动。
采用HPLC测定丹参酮IIA含量，色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，丹参酮II A(购自北京市药品检定所)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm，5μm)柱，检测波长：270nm；柱温：30℃，其流动相条件为：流速1.0mL.min-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。在该色谱条件下对丹参毛状根中丹参酮II A进行含量测定。结果显示：经过MJ处理后5d，丹参酮类成分含量迅速上升，处理后第5d，丹参酮IIA成分是对照组的2.1倍，处理后第10d，丹参酮IIA成分含量是对照组的6.3倍；处理后第15d，丹参酮IIA成分含量是对照组的6.9倍。结果表明：丹参毛状根经茉莉酸甲酯处理后，丹参IPPI基因表达量能被显著的诱导表达，且伴随丹参酮II A的迅速积累。由上推测所得到的丹参IPPI基因为丹参酮类成分生物合成途径的关键酶基因。
实施例5、SmIPPI基因原核表达分析
1、大肠杆菌表达载体的构建
依据丹参IPPI基因全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)的ORF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点HindIII和BamHI。以全长cDNA片段为模板，经PCR扩增后，保证丹参IPPI基因的阅读框完全正确，并用HindIII和BamHI内切酶进行酶切反应，回收目的片段；大肠杆菌表达载体pET32a用HindIII和BamHI内切酶进行酶切反应，回收目的片段。将经酶切的丹参IPPI基因的目的片段克隆至酶切过的pET32a表达载体上，转化大肠杆菌BL21，进行重组子的PCR鉴定和酶切鉴定。
2、蛋白表达的诱导
挑取蛋白接种于2mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1∶100稀释加入到50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.3-0.5，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导目标蛋白表达，继续于37℃摇床培养3-4小时。当细菌培养至OD600为1.0时，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(50mmol/L PBS，pH7.2)重悬，冰上超声破碎，SDS-PAGE电泳检测总蛋白和可溶解蛋白。
3、丹参异戊烯焦磷酸异构酶活性的分析
取经Ni2+-琼脂糖柱纯化的菌液蛋白10ug，加入100uL反应体系(100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.0，含5mmol/L MgCl2，20ug IPP或DMAPP，10mmol/L巯基乙醇)，37℃反应12h。在反应体系中加入100ul 100mmol/L Tris HCl(pH9.5)，然后加入碱性磷酸酶(1U)，37℃反应12h。加入200ul乙醚，充分涡旋振荡后10000r/min离心，取上层乙醚抽提物GC-MS检测反应产物。结果表明，此异构酶能够以IPP为底物催化形成DMAPP，也能够以DMAPP为底物催化形成IPP。从峰面积结果看，此异构酶利用底物的效率不同，更倾向于以IPP为底物向DMAPP方向进行。
实施例6、根癌农杆菌介导IPPI基因遗传转化丹参获得转基因丹参植株
1.Gateway过表达载体的构建：
设计扩SmIPPI基因全长的引物(SmIPPI-B1：TAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG；SmIPPI-B2：GCGGTGAATGAAGCGGCGAAACGGAGGC)。应用高保真酶进行PCR，将产物切胶回收。
BP反应
PCR产物 50-100ng(3.5uL) PDONR221 50-100ng(0.5uL) BP Clonase酶 1.0uL(用前轻轻混合下)
A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，
B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。
C.将BP反应产物经过DH5α克隆
D.含40ug/ml kan(卡那霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证，提质粒。
LR反应
BP反应质粒 50-150ng(3.5uL) PH7WG2D载体 150ng(0.5uL) LR Clonase酶 1.0uL(用前轻轻混合下)
A.反应体系置25度温育12小时(PCR仪)，
B.加入0.5uL蛋白酶K溶液37度温育10分钟，终止BP反应。
C.将BP反应产物经过DH5α克隆
D.含50ug/ml Spe(壮观霉素)LB培养板上过夜，PCR验证，测序验证。
提质粒并通过电击转化的方法转入农杆菌中。
2、根癌农杆菌ACCC10060介导基因转化丹参
2.1外植体预培养
选取10d的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm2的小块，用刀将叶表面划伤，以背面向上方式将叶片置于MS固体培养基上，于25℃光照16h，黑暗8h条件下预培养2d。
2.2农杆菌活化扩增
4℃保存的平板上挑取单菌落于新的含50mg/L Rif和80mg/L Spe的YEB培养基上，划线，挑取单菌落接种于15ml含50mg/L Rif和80mg/L Spe的YEB液体培养基中，于28振荡培养至OD260 0.5左右(250rpm，23h)，保菌，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，弃上清，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于侵染。
2.3侵染及共培养
将预培养材料放入MS重悬液中，侵染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，暗培养48-72h。
2.4选择培养
将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400mg/L cef水浸泡5min左右，无菌水清洗1次，吸干水分后移入含2mg/L Hyg和400mg/L cef的MS固体培养基上，与黑暗中进行筛选培养。每7天更换一次培养基，选择生长迅速至2-3cm的抗性毛状根，将其切下，单独标号转入2mg/LHyg和400mg/L cef的MS培养基上，将除菌后的阳性根转入2mg/L Hyg的MS培养基继代。
2.5进一步筛选确定
毛状根经过绿色荧光显微镜检测(GFP)，再经过特异引物PCR检测目的基因是否插入植物基因组，选择阳性株系进行放大培养(6，7-V培养基)。
实施例7、转基因丹参植株的PCR检测
根据SEQ ID No.1基因的ORF序列设计SmIPPI基因的双向引物对目的基因进行检测。结果表明，转IPPI丹参株系在910bp左右处扩增出特异DNA片段，而以非转化丹参基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化丹参的含IPPI基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化丹参，获得经PCR检测的转基因丹参植株。
实施例8、转基因丹参中丹参酮类成分成分含量测定
生长45d的丹参毛状根37℃干燥，研磨成粉，100mg加4ml甲醇，4℃浸泡过夜，超声30min，离心(3000rpm，3min)，上清取出液氮吹干，加入1ml甲醇复溶，过0.22um滤膜。采用HPLC测定二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量，色谱条件为：Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Millennium 32工作站，色谱甲醇(天津)；水为三重蒸馏水，氯仿(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA(购自北京市药品检定所)。RP-Waters C18(150mm×3.9mm，5μm)柱，检测波长：270nm；柱温：30℃，其流动相条件为：流速1.0mL.min-1，流动相为0.5％醋酸甲醇(A)和0.5％醋酸水(B)线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；25～30min，60％～65％A；30～50min，65％～70％A；50～60min，70％～80％A；60～61min，80％～30％A。
结果表明，在过表达SmIPPI基因的转基因发根高产株系中二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I和丹参酮IIA含量比非转基因对照组分别提高：1.4、3.6、2.5、3倍。结果证明，丹参SmIPPI基因对促进丹参酮类含量的提高有明显作用，SmIPPI基因可用于利用转基因技术来提高丹参酮含量的研究和产业化中，具有很好的应用前景。
【序列表】
<110>中国中医科学院中药研究所
<120>一种丹参异戊烯焦磷酸异构酶基因(SmIPPI)基因的分析及应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1320
<212>DNA
<213>丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge.)
<220>
<221>CDS
<222>(127)..(1044)
<400>1
atcctctaga gattctaata cgactcacta tagggcaagc agtggtatca acgcagagta 60
cgcggggacc taaaaagagc ccagtattaa aaatgccata aatttccatt aaataagaaa 120
agaaaaatgt cgtccttgac cagcatcccg tttcaaaaat tgttggctgc atccgctgca 180
gctgcttctt cttcttcttc atcgatttct ccgctcaaat ctctcctttt aaagcccact 240
tcttgtagag cccttttcca tcccaaaccc aacgccgccg ctaccccttt tggcctccgt 300
ttcgccgctt cattcaccgc cgctacctca accatgggtg acgtcgccgc cgccgattcc 360
gccatggacg ccgttcagag gcgcctcatg tttgaagacg aatgcatatt ggttgatgag 420
aatgatcacg ttgttggcca tgaatccaag tacaattgtc atctgatgga aaagattgag 480
gctctaaatc tgttgcacgg agctttcagt gtcttcctgt ttaactcaaa atacgagtta 540
ttgcttcagc aacgatccac aactaaggtt acttttccgt tggtgtggac aaacacttgc 600
tgcagtcatc cactataccg agattctgag cttattgaag agaatgctct tggtgtgagg 660
aatgctgctc agaggaagct gttggatgaa ctcggcatcc ctgctgaaga tgtcccagtc 720
gatcagtttg ttcctttggg gcgtatgctg tacaaggccc cgtcagatgg aaaatgggga 780
gagcatgaat tggattatct cctattcatt gtccgggatg tgagcgtgca tccaaatcca 840
gacgaagtgc acgatgtgaa atatgtgaac cgggaggagc tgaaagagct tctacggaag 900
gcagatgccg gtgagggggg cttgaagcta tcgccgtggt tcagattagt ggtggacaac 960
ttcttgttca agtggtggga ccacgtcgag aaagggacga taaaggaagc tgttgacatg 1020
aagacaattc acaagctgac ttagaaatga agtagtaatg tctgatttca tttcaacttg 1080
tgtcatttta tcatattcag ttgtttgaaa ctgatcaaac ttggttgcca aataggggtg 1140
ttgttgacgc cggtaagttt gaatcgtgtt gcaaattcaa tttgctcttg gtggtgaatt 1200
ttggcaggcc ttctaagttt aggtatatct ccttgtcttt gtttgatgtg gtcagttttt 1260
gttgtggctt tgaaataaaa tttattgtta cctgtcgaaa aagcggccgc gaattcaaaa 1320
<210>2
<211>305
<212>PRT
<213>丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge.)
<400>2
Met Ser Ser Leu Thr Ser Ile Pro Phe Gln Lys Leu Leu Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile Ser Pro Leu Lys Ser
20 25 30
Leu Leu Leu Lys Pro Thr Ser Cys Arg Ala Leu Phe His Pro Lys Pro
35 40 45
Asn Ala Ala Ala Thr Pro Phe Gly Leu Arg Phe Ala Ala Ser Phe Thr
50 55 60
Ala Ala Thr Ser Thr Met Gly Asp Val Ala Ala Ala Asp Ser Ala Met
65 70 75 80
Asp Ala Val Gln Arg Arg Leu Met Phe Glu Asp Glu Cys Ile Leu Val
85 90 95
Asp Glu Asn Asp His Val Val Gly His Glu Ser Lys Tyr Asn Cys His
100 105 110
Leu Met Glu Lys Ile Glu Ala Leu Asn Leu Leu His Gly Ala Phe Ser
115 120 125
Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser
130 135 140
Thr Thr Lys Val Thr Phe Pro Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser
145 150 155 160
His Pro Leu Tyr Arg Asp Ser Glu Leu Ile Glu Glu Asn Ala Leu Gly
165 170 175
Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly Ile Pro
180 185 190
Ala Glu Asp Val Pro Val Asp Gln Phe Val Pro Leu Gly Arg Met Leu
195 200 205
Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr
210 215 220
Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp Val Ser Val His Pro Asn Pro Asp Glu
225 230 235 240
Val His Asp Val Lys Tyr Val Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu Leu Leu
245 250 255
Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu Gly Gly Leu Lys Leu Ser Pro Trp Phe
260 265 270
Arg Leu Val Val Asp Asn Phe Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu
275 280 285
Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ala Val Asp Met Lys Thr Ile His Lys Leu
290 295 300
Thr
305