一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法 【技术领域】
本发明涉及一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法。
背景技术
我国是世界上油菜籽产量最大的国家，年产量已近1200万吨，菜籽粕是菜籽油加工的主要副产物，占菜籽总量的65％，其中含蛋白35％～42％。菜籽蛋白氨基酸组成合理，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，与WHO/FAO推荐的氨基酸组成模式相近，营养价值等于或优于动物蛋白，是一种优良的植物蛋白。但由于菜籽粕存在一些抗营养因子，如硫代葡萄糖甙、植酸、多酚类物质等，加工过程中难以脱除，使菜籽粕只能应用于饲料或肥料工业，利用效能低，资源浪费严重。因此，开发利用菜籽蛋白质资源已成为大势所趋，由于菜籽蛋白水解成多肽后，具有更好的生物活性和加工特性，因此加强对菜籽肽的研究与开发，并使之工业化，对有效利用我国的植物蛋白资源，提高我国人民的营养水平，具有重大的社会意义和良好的经济效益。
目前我国对菜籽肽的研究生产刚刚起步，其方法主要为酶法，即是以菜籽分离蛋白为原料，利用商业蛋白酶制剂水解菜籽蛋白制备菜籽肽。该方法以菜籽分离蛋白为原料，生产所用酶制剂用量大且价格昂贵，导致生产成本较高，并且由于菜籽粕或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程度不高，难以形成大规模工业化生产。
CN200810243461.6、CN200810106919.3公开了生物发酵方法对菜籽粕改性的方法，虽然脱除了菜籽蛋白中的硫代葡萄糖甙(以下简称硫甙)等有害物质，得到菜籽肽或含有菜籽肽的产品，但是产品的可溶性氮含量和生物活性仍有待进一步提高。
【发明内容】
本发明提供一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法，充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，可以有效提高产品的可溶性氮含量和生物活性。
所述微生物液态发酵制备菜籽肽的方法，包括以下步骤：
(1)将菜籽粕粉与营养液混合制备液态发酵培养基；
(2)将微生物接入液态发酵培养基，进行液态发酵；
(3)发酵后的液态培养基经固液分离，得到菜籽肽的粗提液；
(4)粗提液经提纯得到菜籽肽。
所述有产蛋白酶能力的菌种为雅致放射毛霉、宇佐美曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母。
步骤(1)中，菜籽粕粉的粒径不大于200μm。菜籽粕粉与营养液按固液比1∶5～1∶40g/mL配制液态发酵培养基，其中营养液的pH为4.0～10.0。本领域的普通技术人员可以根据菌种选择合适的营养液及固液比。作为优选方案，所述有产蛋白酶能力的菌种为雅致放射毛霉、宇佐美曲霉、乳酸菌或产朊假丝酵母时，固液比为1∶15～1∶30g/mL，营养液中包括葡萄糖0.1％～5％，KH2PO4 0.1％～2.0％，pH为6～7；所述有产蛋白酶能力的菌种为枯草芽孢杆菌时，固液比为1∶15～1∶20g/mL，营养液中包括葡萄糖0.1％～2％，MnSO4 0.1％～2.0％，pH为8.5～9.5，上述百分比均为质量体积百分比，质量体积百分比是指100ml溶液中含某种物质多少克，即1％＝1g/100ml。
步骤(2)中，将有产蛋白酶能力的菌种接入液态发酵培养基，使菌体浓度为105～107个/mL，发酵温度20～40℃，优选25～40℃，发酵时间1～5天。其中发酵温度可以由本领域的普通技术人员根据菌种经实验确定，优选的是，雅致放射毛霉的发酵温度为26～30℃，宇佐美曲霉的发酵温度为26～30℃，枯草芽孢杆菌的发酵温度为30～37℃，乳酸菌的发酵温度为32～35℃，产朊假丝酵母的发酵温度为26～30℃。
优选的方案是，有产蛋白酶能力的菌种分别经活化、扩大培养得到菌体浓度为107～108个/mL的种子液，接入液态发酵培养基。种子液的接种量优选为2％～8％，更优选为3％-5％，以种子液相对于液态发酵培养基体积的百分比计。所述有产蛋白酶能力菌种的活化、扩大培养均采用常规方法，本领域技术人员可以根据不同的菌种选择合适的工艺。
步骤(3)可以公知的方法进行固液分离，如可以采用真空过滤器或压力过滤器去除残渣，也可以采用离心法，相对离心力为1000g～15000g。
作为本发明的优选方案，步骤(4)中，所述提纯方法为：脱色、脱盐和干燥。优选的方案是，将粗提液采用活性炭脱色，离子交换树脂或反渗透脱盐，采用减压浓缩、热风干燥、冷冻干燥或喷雾干燥方式干燥，得到菜籽肽粉。
作为本发明的另一种优选方案，步骤(4)中，所述提纯方法包括离子交换、疏水层析和凝胶过滤，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥得到抗氧化性专一的菜籽肽。当然也可以采用其余的分离纯化方法，如超滤膜进行超滤，收集不同截留分子量的滤液，经脱盐柱脱盐，经过凝胶过滤色谱柱，收集具有生物活性专一的组分，经冷冻干燥后得到菜籽肽。
本发明与现有的技术相比，直接以菜籽粕为原料微生物液态发酵生产生物活性专一的菜籽肽，原料来源广泛，价格低廉，不需要对其进行酸、碱的处理，更不需要分离出菜籽蛋白，生产工艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，以微生物发酵取代纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽，可以节省大量昂贵地生物酶制剂；进行液态发酵，产生多种代谢产物和酶类，充分发挥其水解蛋白质作用和降解硫甙作用，能有效降解菜籽粕种的有毒物质，水解蛋白质，达到人和动物的食用标准，提高产品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率，还含有多种对人体有益的功能因子。总之，本发明对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽肽的方法。
【具体实施方式】
实施例1 枯草芽孢杆菌(产碱性蛋白酶)液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分：葡萄糖2.0g，MnSO4 1.0g，自来水1000mL，pH为9.5。将双低菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右，用营养液按固液比1∶15g/mL的比例与菜籽粕混合均匀，在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备：
斜面培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2-7.4。
种子培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10，NaCl 5g，自来水1000mL，pH 7.0。
从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，37℃，120r/min，摇床培养24h，得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，使菌体浓度为106个/mL，调发酵温度为32℃，转速180r/min震荡培养，定时通风，发酵1-2天。
(3)固液分离，得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基，先用2500g相对离心力低速离心分离去除粕渣，再用12000g相对离心力高速离心去杂，得菜籽肽粗提液，将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为33.5％。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至6.5～7.5，加入10g/L的活性炭，于50℃脱色、脱苦1h，然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂，上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10，流速30mL/min)脱盐，在经截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，喷雾干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白质含量90％(干基，N×6.25)，可溶性氮含量95％，分子量在1000Da～5000Da的肽含量70％，硫甙未检出；抗氧化生物活性指标如下：
菜籽肽还原能力：产品浓度1mg/mL时，A700nm为1.051；
自由基清除率：产品浓度1mg/mL时，DPPH·自由基清除率为86％；
金属螯合力：产品浓度5mg/mL时，金属螯合力为43％；
脂质氧化抑制率：产品浓度1mg/mL时，脂质氧化抑制率为60％。
实施例2 枯草芽孢杆菌液态发酵制备抗氧化性专一的菜籽肽
与实施例1不同之处在于，按下述方法进行(4)提纯：
调节菜籽肽粗提液pH至6.5～7.5，加入10g/L的活性炭，于50℃脱色、脱苦1h，然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂，上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10，流速30mL/min)脱盐，喷雾干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉，其中蛋白质含量88％(干基，N×6.25)，可溶性氮含量92％，分子量在1000Da～5000Da的肽含量62％，硫甙未检出。
菜籽肽的抗氧化生物活性指标如下：
菜籽肽还原能力：产品浓度1mg/mL时，A700nm为0.716；
自由基清除率：产品浓度1mg/mL时，DPPH·自由基清除率为75％；
金属螯合力：产品浓度5mg/mL时，金属螯合力为41％；
脂质氧化抑制率：产品浓度1mg/mL时，脂质氧化抑制率为43％。
实施例3 雅致放射毛霉液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分：葡萄糖50g，KH2PO4 2g，自来水1000mL，pH为6.5。将普通菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右，用营养液按固液比1∶30g/mL的比例与菜籽粕混合均匀，在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备：
斜面培养基配方：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。
平板扩大培养基配方：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。
将雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板于28℃进行扩大培养，4天后用无菌水洗下孢子，转入带玻璃珠的三角瓶中，震荡打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤孢子悬液，得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，使菌体浓度为106个/mL，调发酵温度为30℃，转速180r/min震荡培养，定时通风，发酵3天。
(3)固液分离，得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基，经压力过滤装置过滤去除粕渣，得菜籽肽粗提液，将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为29.5％。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至6.5～7.5，加入10g/L的活性炭，于50℃脱色、脱苦1h，然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂，上清液经反渗透柱脱盐后，喷雾干燥得菜籽肽，其中蛋白质含量85％(干基，N×6.25)，可溶性氮含量90％，分子量在1000Da～5000Da的肽含量54％，硫甙含量11μmoL/g。
实施例4 雅致放射毛霉液态发酵制备抗氧化性专一的菜籽肽
与实施例3不同之处在于，按下述方法进行(4)提纯：
将上述粗提液经过离子交换(HiTrapTM离子交换柱SP XL；流速：1mL/min，磷酸盐缓冲液pH 6.0，温度：25℃)，疏水层析(HiTrapTM疏水层析柱PhenyL FF；流速：1mL/min；温度：25℃)和凝胶过滤(Superdex Peptide HR 10/30；流速：0.2mL/min；温度：25℃)，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥后得到抗氧化性专一的菜籽肽。
该菜籽肽产品的抗氧化生物活性指标如下：
菜籽肽还原能力：产品浓度1mg/mL时，A700nm为0.888；
自由基清除率：产品浓度1mg/mL时，DPPH·自由基清除率为82％；
金属螯合力：产品浓度5mg/mL时，金属螯合力为50％；
脂质氧化抑制率：产品浓度1mg/mL时，脂质氧化抑制率为45％。
实施例5 宇佐美曲霉液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分：葡萄糖50g，KH2PO4 2g，自来水1000mL，pH为6.0。将普通菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右，用营养液按固液比1∶30g/mL的比例与菜籽粕混合均匀，在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备：
斜面培养基配方：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。
平板扩大培养基配方：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。
将雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板于28℃进行扩大培养，4天后用无菌水洗下孢子，转入带玻璃珠的三角瓶中，震荡打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤孢子悬液，得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，使菌体浓度为106个/mL，调发酵温度为28℃，转速180r/min震荡培养，定时通风，发酵3天。
(3)固液分离，得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基，经压力过滤装置过滤去除粕渣，得菜籽肽粗提液，将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为28％。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至6.5，加入10g/L的活性炭，于50℃脱色、脱苦1h，然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂，上清液经反渗透柱脱盐后，喷雾干燥得菜籽肽，其中蛋白质含量84％(干基，N×6.25)，可溶性氮含量85％，分子量在1000Da～5000Da的肽含量34％，，硫甙含量9μmoL/g。
实施例6 产朊假丝酵母液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分：葡萄糖3g，KH2PO4 3g，自来水1000mL，pH为7.0。将菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右，用营养液按固液比1∶20g/mL的比例与菜籽粕混合均匀，在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备：
斜面培养基配方：麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，琼脂20g，自来水1000mL。
种子培养基配方：麦芽浸膏3g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，自来水1000mL。
从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环产朊假丝酵母接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，使菌体浓度为106个/mL，调发酵温度为30℃，转速150r/min震荡培养，定时通风，发酵3天。
(3)固液分离，得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基，经低速离心(2500g相对离心力)分离去除粕渣，得菜籽肽粗提液，将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为26.45％。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至7.0，加入10g/L的活性炭，于50℃脱色、脱苦1.5h，然后高速离心(相对离心力为10000g)去杂，上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10，流速30mL/min)脱盐后，喷雾干燥得菜籽肽，其中蛋白质含量(干基，N×6.25)83％，可溶性氮含量80％，分子量在1000Da～5000Da的肽含量32％，硫甙含量4μmoL/g。
实施例7 乳酸菌液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分：葡萄糖4g，KH2PO4 1g，自来水1000mL，pH为6.0。将菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右，用营养液按固液比1∶25g/mL的比例与菜籽粕混合均匀，在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备：
斜面培养基配方：酵母膏5g，碳酸钙6g，琼脂15～20g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH6.0。
种子培养基配方：酵母膏5g，碳酸钙6g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH 6.0。
从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环乳酸菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，37℃，120r/min，摇床培养24h，得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，使菌体浓度为106个/mL，调发酵温度为35℃，转速150r/min震荡培养，定时通风，发酵2天。
(3)固液分离，得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基，用2500g相对离心力低速离心分离去除粕渣，得菜籽肽粗提液，将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为30.56％。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至7.0，加入10g/L的活性炭，于50℃脱色、脱苦1.5h，然后高速离心(相对离心力为10000g)去杂，上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10，流速30mL/min)脱盐，喷雾干燥得菜籽肽，其中蛋白质含量(干基，N×6.25)≥81％，可溶性氮含量86％，分子量在1000Da～5000Da的肽含量35％，硫甙含量8μmoL/g。
实施例8 乳酸菌液态发酵制备生物活性专一的菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分：葡萄糖4g，KH2PO4 1g，自来水1000mL，pH为6.0。将菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右，用营养液按固液比1∶20g/mL的比例与菜籽粕混合均匀，在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备：
斜面培养基配方：酵母膏5g，碳酸钙6g，琼脂15～20g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH6.0。
种子培养基配方：酵母膏5g，碳酸钙6g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH 6.0。
从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环乳酸菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，37℃，120r/min，摇床培养24h，得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，使菌体浓度为106个/mL，调发酵温度为35℃，转速150r/min震荡培养，定时通风，发酵2天。
(3)固液分离，得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基，用2500g相对离心力低速离心分离去除粕渣，得菜籽肽粗提液，将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为30.6％。
(4)提纯
将上述粗提液分别通过截留分子量为3kDa的超滤膜进行超滤，分子量≤3kDa的组分经过凝胶过滤(柱：SOURCETM 5RPC，流速1mL/min，温度25℃；磷酸盐缓冲液pH7.0)，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥后得到生物活性专一的菜籽肽。
该生物活性专一的菜籽肽降血压生物活性指标：抑制50％的ACE(血管收缩素转移酶)活性所需抑制剂的浓度(IC50)为0.2mg/mL。
本发明所得菜籽肽可溶性氮含量和分子量在1000Da～5000Da的肽含量都很高，因此产品的溶解性较好，有利于肠道吸收和生物活性功能的发挥。