一种茂铁偶氮苯肽核酸单体及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种含有双官能基团(茂铁和偶氮)的肽核酸单体及其制备方法。
背景技术
肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)是DNA的类似物，它用N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架代替了DNA的糖-磷酸酯骨架作为重复的结构单元，它与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性。因为它具有非常好的特异性，比如高的生物稳定性，对DNA、RNA有高的序列选择性，更重要的是PNA/DNA双螺旋结构比DNA/DNA双螺旋结构对错配有更高的灵敏度，所以PNA已经在基因治疗药物开发，基因诊断，生物传感器以及分子生物学等方面得到了广泛应用。为了高效的研究核酸以及核酸和肽等的相互作用，这就要求发展灵敏度高的方法来对它们进行识别和定量。分光光度技术，放射自显影技术，电化学技术已经在对核酸分析方面广为应用，它们一般都要求插入信号报告基团，报告基团的插入有利于提高检测分析的灵敏度并且不影响它们的结构和功能。由于PNA比DNA有诸多优势，其中PNA一端是氨基，一端是羧基更加容易进行标记引入报告基团，因此PNA的标记也引起了科学家们的极大兴趣。PNA的标记研究较多的是放射性标记、荧光标记、电化学标记等。电化学方法检测核酸有诸多优势，高的灵敏度、低的费用、简便快速，更重要的是容易微型化设计成芯片，因此，电化学方法检测核酸引起了人们的极大兴趣。各种电化学检测方法也相继诞生，其中为了设计电化学核酸传感器，各种金属复合物修饰的核苷酸及其寡聚体也被合成，其中二茂铁是常用电活性标记分子，已被广泛应用到标记DNA(Russian Chemical Reviews.2003，72，537；J.Am.Chem.Soc.2003，125，8724)，由于二茂铁小的体积，高的可逆性，高的氧化还原反应速率，高的生物稳定性，因此，二茂铁的衍生物也首先被应用到标记PNA。同时，偶氮苯是一个典型的光致发光分子，它的结构可以在光的照射下发生顺反异构，所以我们首先合成了具有电化学性质的二茂铁和具有光化学性质的偶氮苯结合的肽核酸单体。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种具有电化学和光化学性质的茂铁偶氮苯肽核酸单体。
本发明的另外一个目的在于提供一种茂铁偶氮苯肽核酸单体的制备方法。
本发明巧妙的将具有可逆性电化学和光化学性质的二茂铁和偶氮苯结合在一起，合成了一种新颖的肽核酸单体分子。
我们首次合成了一种新型的具有电化学和光化学性质的肽核酸单体，该类肽核酸单体至今未见文献报道。肽核酸单体的结构分为三部分：茂铁偶氮苯部分、骨架部分和腺嘌呤碱基。
一种茂铁偶氮苯肽核酸单体，它的结构式为：
本发明利用二茂铁、对硝基苯胺、对氨基苯甲酸和腺嘌呤制备茂铁偶氮苯肽核酸单体。
关于茂铁偶氮苯肽核酸单体的制备方法的进一步描述：
首先将对硝基苯胺在亚硝酸钠作用下经重氮化后和茂铁反应生成对茂铁硝基苯，再经锡还原生成对茂铁苯胺；利用过一硫酸氢钾将对氨基苯甲酸氧化成对亚硝基苯甲酸，然后和对茂铁苯胺在乙酸和二甲亚砜中反应生成对茂铁偶氮苯甲酸。腺嘌呤六元杂环上裸露氨基的保护是用苄氧羰基来实现的，然后再与溴乙酸乙酯反应生成的酯用氢氧化钠碱解，再调酸生成N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸，N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸和N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯在3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮和二环己基碳二亚胺的作用下发生偶联反应得到腺嘌呤肽核酸单体N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯；最后腺嘌呤肽核酸单体N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯在三氟乙酸的作用下脱去上面的叔丁氧羰基再和对茂铁偶氮苯甲酸在二异丙基碳化二亚胺和3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮的作用下发生偶联反应生成茂铁偶氮苯肽核酸(腺嘌呤)单体。
一种茂铁偶氮苯肽核酸单体的制备方法，其特征在于该方法包括：
以对硝基苯胺为原料，在亚硝酸钠作用下在盐酸溶液中经重氮化和茂铁反应生成对茂铁硝基苯然后经锡还原生成对茂铁苯胺；将对氨基苯甲酸在过一硫酸氢钾作用下氧化为对亚硝基苯甲酸，然后和对茂铁苯胺在乙酸和二甲亚砜溶液中生成对茂铁偶氮苯甲酸；
反应过程如(I)所示：
腺嘌呤在氢化钠的作用下与苄氧羰基氯反应，然后以碳酸钾和碳酸铯作催化剂和溴乙酸乙酯在反应生成N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸乙酯经氢氧化钠碱解生成N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸；
反应过程如(II)所示：
N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸和N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯在3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮和二环己基碳二亚胺的作用下发生偶联反应得到N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯；
反应过程如(III)所示：
N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯在三氟乙酸地作用下脱去上面的叔丁氧羰基再和对茂铁偶氮苯甲酸在二异丙基碳化二亚胺和3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮的作用下发生偶联反应生成茂铁偶氮苯肽核酸单体。
反应过程如(IV)所示：
本发明合成的新型肽核酸单体用FT-IR，1HNMR，MS，熔点仪等分析手段进行了结构表征，证实其结构为以上结构式所标示。
本发明丰富了在肽核酸的修饰方面的应用，对PNA和DNA或者RNA的检测、识别和分离将产生积极的作用。
本发明具有如下优点：
将对硝基苯胺经重氮化后和茂铁反应再经还原生成对茂铁硝基苯胺；利用过一硫酸氢钾将对氨基苯甲酸氧化成对亚硝基苯甲酸，然后和对茂铁苯胺反应生成对茂铁偶氮苯甲酸。将苄氧羰基保护的腺嘌呤肽核酸单体在三氟乙酸的作用下脱去上面的叔丁氧羰基再和对茂铁偶氮苯甲酸在二异丙基碳化二亚胺和3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮的作用下发生偶联反应生成茂铁偶氮苯肽核酸(腺嘌呤)单体。本发明经过一系列的反应步骤合成出了具有典型的电化学和光化学性质的茂铁偶氮苯肽核酸单体。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明，通过实例进行说明
实施例1：
4-茂铁基硝基苯的合成：
取对硝基苯胺(14g，0.1mol)，依次加入30ml水和浓盐酸30ml，加热使其全部溶解后在冰水浴上冷至0℃，然后滴加溶有亚硝酸钠(7g，0.1mol)的水溶液20ml，搅拌反应1h，加少量尿素分解过量的亚硝酸，得到黄色重氮盐溶液备用。
取二茂铁(9.5g，0.05mol)溶于100ml乙醚中，加入十六烷基三甲基溴化铵(1g，0.003mol)，搅拌下滴加入上述重氮盐溶液，加毕，室温下搅拌反应3h，蒸去乙醚，过滤，用大量水洗涤，固体用水蒸气蒸馏除去未反应的二茂铁，残留物用石油醚重结晶，得紫色产物13.5g，产率75％。m.p.159-160℃；FT-IR：vC-H：3428，3104，2920，骨架振动：1594，vasNO2：1506，vsNO2：1340；ESI-MS：[M+H]+＝308.30；1H NMR(CDCl3)：δ＝8.12(d，2H)，7.53(d，2H)，4.723(s，2H)，4.455(s，2H)，4.036(s，5H)。
4-茂铁基苯胺的合成：
取4-茂铁基硝基苯(4.1g，0.013mol)，加入浓盐酸50ml和乙醇80ml，再加入锡粒(9g，0.08mol))，90℃回流7小时，冷至室温，二氯甲烷萃取(3×300ml)，有机相用硫酸钠干燥，蒸干二氯甲烷，石油醚重结晶，得橙红色固体3.2g，产率88.3％。m.p.157-159℃；FT-IR：vasN-H：3546，vsN-H：3463，v＝C-H：3041，骨架振动：1610，1527；ESI-MS：[M+H]+＝278.95；1H NMR(DMSO-d6)：δ＝7.340(t，2H)，6.761(t，2H)，4.643(t，2H)，4..258(t，2H)，3.978(s，5H)，2.072(s，2H)。
对亚硝基苯甲酸的合成：
取对氨基苯甲酸(9.99g，0.07mol)溶解在112ml二氯甲烷中，过一硫酸氢钾(89.8g，0.15mol)溶解在450ml水中加入到上述二氯甲烷中。氮气保护下室温搅拌一天，过滤，水洗两次，五氧化二磷干燥，得黄色产物11g，产率99％。m.p.368-369℃；FT-IR：vO-H：3399，v＝C-H：3058，vC＝O：1697，vN＝O：1428(二聚体)；ESI-MS：[M-H]-＝150.11；1H NMR(DMSO-d6)：δ＝13.544(s，1H)，8.24(d，2H)，8.03(d，2H)。
对茂铁偶氮苯甲酸的合成：
取对亚硝基苯甲酸(1.7g，0.012mol)超声溶于152ml乙酸/二甲亚砜＝1/1的溶剂中，加入对茂铁基苯胺(1.55g，5.6mmol)室温反应，薄层色谱检测(约反应36h)，仔细加入水沉淀通过过滤分离，水洗，丙酮和水重结晶的产物1.7g，产率74％。m.p.365-367℃；FT-IR：vC＝O＝1689cm-1，vN＝N＝1421cm-1；ESI-MS：[M-H]-＝409.11；1H-NMR(d6-DMSO)：δ＝13.16(s，br.，1H)，8.123(d，2H)，7.959(d，2H)，7.874(d，2H)，7.764(d，2H)，4.942(s，2H)，4.469(s，2H)，4.050(s，5H)。
实施例2：
N6-苄氧羰基腺嘌呤的合成：
氢化钠(6.07g，152mmol，60/5 dispersion in oil)加入到冰冷的150ml N，N-二甲基甲酰胺中，剧烈搅拌下，分批加入腺嘌呤(5g，37mmol)，悬浮物被剧烈搅拌3min，然后滴加苄氧羰基氯(11.6ml，37mmol)，搅拌4小时后，倒入300ml冰水中，再用1mol·L-1盐酸调pH＝7，过滤，沉淀水洗，最后甲醇和三氯甲烷混合液重结晶，冰箱过夜，过滤的白色产物2.61g，产率20％。FT-IR(cm-1)：vN-H：3374，v＝C-H：2965，vC＝O：1745，杂环骨架：1581；ESI-MS：[M+H]+＝270.14；1H NMR(DMSO-d6)：δ：12.256(s，1H)，11.065(s，1H)，8.585(s，1H)，8.433(s，1H)，7.389(m，5H).5.281(s，2H)。
N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸的合成：
N6-苄氧羰基腺嘌呤(5.0g，0.019mol)，碳酸钾(2.6g，0.019mol)和碳酸铯(0.6g，1.9mmol)悬浮于40ml干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加溴乙酸乙酯(2.3ml，0.019mol)搅拌反应1天，混合物被减压蒸干，残留物溶在350ml乙酸乙酯，水洗(100ml)，盐水洗(100ml)，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，乙酸乙酯/环己烷重结晶得到N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸乙酯，0℃下，加入40ml1mol·L-1NaOH，反应1小时后，加入40ml水，室温反应过夜，过滤除去不溶物，0℃下用盐酸调pH＝2，过滤，水洗，五氧化二磷真空干燥得产物1.22g，产率20％。FT-IR：vC＝O：1760，1724；ESI-MS：[M-H]-＝326.07，[M-H-CO2]-＝281.98；1H NMR(DMSO-d6)：δ：10.701(s，1H)，8.608(s，1H)，8.418(s，1H)，7.388(m，5H)，5.208(s，2H)，5.061(s，2H)。
实施例3：N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯的合成：
称取N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯(2.0g，9mmol)，3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(1.46g，9mmol)，N6-苄氧羰基腺嘌呤-9-乙酸(2.92g，9mmol)悬浮于15ml N，N-二甲基甲酰胺中，加入15ml二氯甲烷，冰浴冷至0℃后，加入二环己基炭二亚胺(2.01g，10mmol)，冰浴搅拌2.5小时，然后室温搅拌3小时，过滤，N，N-二甲基甲酰胺(15ml)洗涤，二氯甲烷(15ml)洗涤，合并有机相，再向有机相中补加100ml二氯甲烷，依次用碳酸氢钠洗涤(3×100ml)，硫酸氢钾洗涤(2×100ml)，盐水洗(1×100ml)，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得黄色油状体，溶于50ml乙醇，加入活性炭，加热搅拌10min，过滤，加水30ml，充分搅拌，冰箱放置过夜，过滤，干燥得白色沉淀N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯。FT-IR：vN-H：3414，vC-H：2933，vC＝O：1751，1708，1672；ESI-MS：[M]+＝556.29；1H NMR(CDCl3)：δ＝8.710/8.701(2×s，1H)，8.059/8.008(2×s，1H)，7.363(m，5H)，5.562(t，1H)，5.265(s，2H)，5.111/4.951(2×s，1H)，4.248/4.167(2×q，2H)，4.027(s，1H)，3.610/3.526(2×m，2H)，3.373/3.22(2×m，2H+H2O)，2.141(s，9H)，1.229(t，3H)。
实施例4：
茂铁偶氮苯肽核酸(腺嘌呤)单体的合成：
N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-叔丁氧羰基-氨乙基)甘氨酸乙酯(0.5g，0.88mmol)溶于12ml二氯甲烷中，三氟乙酸(0.7ml，0.9mmol)加入到上述溶液中，于室温下反应2小时后，减压蒸馏二氯甲烷，再溶于7ml甲苯，再减压蒸馏蒸干甲苯，重复上述操作一次。将产物中加入乙醚4ml，超声分散，过滤(操作要快)得到产物N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-三氟乙酸基-氨乙基)甘氨酸乙酯0.512g。
茂铁偶氮苯甲酸(391.2mg，0.945mmol)溶解在9ml N，N-二甲基甲酰胺，溶液被冷至0℃，然后加入二异丙基碳化二亚胺(213.88mg，1.7mmol)和3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(276.69mg，1.7mmol)，搅拌15min；在0℃下，溶有N((N6-苄氧羰基腺嘌呤-9)-乙酰基-N-(2-三氟乙酸基-氨乙基)甘氨酸乙酯(487.7mg，0.9mmol)的6ml N，N-二甲基甲酰胺，缓慢加入到上述溶液中，然后加入N，N-二异丙基乙胺(236.25μl，1.3mmol)室温搅拌24h.，减压蒸干N，N-二甲基甲酰胺，粘稠液体溶解在90ml二氯甲烷，用饱和的碳酸氢钠洗涤(2×30ml)，水洗涤(2×30ml)，有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干，产物柱色谱分离(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝4∶6并逐渐增加极性)，得到黄色产物327.8mg，产率：45％，m.p.＞300℃；MS：[M+H]+＝848.22，calcd forC44H41N9O6Fe 847.26，1H-NMR(CDCl3)：δ＝8.44(t，3H)，8.28(d，2H)，8.06(d，3H)，7.92(m，4H)，7.61(d，2H)，4.78(s，br，2H)，4.70(s，2H)，4.45(s，br，2H)，4.08(s，br，5H)，2.03/0.86(m，8H)，0.048(s，br，3H)；IR：vNH＝3323cm-1，vC＝O＝1786/1706cm-1，vN＝N＝1440cm-1，vasCH3＝2950cm-1，vsCH3＝2921cm-1。